專利名稱：：丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺、制法和在基因傳遞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺、制法和在基因傳遞中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基因傳遞作為一種可能從根本上治療疾病的新興醫(yī)療手段，多年來引起了科研學(xué)者的極大興趣，而限制基因傳遞發(fā)展的一個關(guān)鍵因素是基因載體材料的發(fā)展?；蜉d體材料一般分為病毒類和非病毒類，病毒類載體包括腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等，它們的轉(zhuǎn)染效率較高，但是裝載量有限，成本高，而最為關(guān)鍵的是其安全隱患，可能引起癌變、基因變異等，極大地限制了其發(fā)展。非病毒基因載體應(yīng)運而生，它們具有結(jié)構(gòu)多樣，物理化學(xué)性質(zhì)確定，裝載容量大，容易大量制備等優(yōu)點，但是轉(zhuǎn)染效率較低參見WongSY，PeletJM，PutnamD.Polymersystemsforgenedelivery—past，present,andfuture.PROGRESSINPOLYMERSCIENCE,2007，32(8-9):799-837。非病毒基因載體材料中最為著名的是超支化的重均分子量為25K的聚乙烯亞胺，簡稱PEI25K，具有相對較高的轉(zhuǎn)染效率，研究學(xué)者將其歸因于"質(zhì)子海綿效應(yīng)"參見Boussif0，ZantaM.A，BehrJ.P，etal.Aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivo-polyethylenimine.PROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCESOFTHEUNITEDSTATESOFAMERICA,1995，92(16):7297-7301。然而，其不可降解的特性和很高的細(xì)胞毒性極大地限制了其應(yīng)用前景參見LungwitzU，BreunigM，BlunkT，eta1.Polyethylenimine—basednon—viralgenedeliverysystems.EUROPEANJOURNALOFPHA薩CEUTICSANDBIOPHA薩CEUTICS，2005，60(2):247-266。
發(fā)明內(nèi)容為了解決已有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺、制法和在基因傳遞中的應(yīng)用。本發(fā)明通過用丙烯酰胺類單體修飾聚乙烯亞胺，不僅降低了細(xì)胞毒性，而且極大提高了轉(zhuǎn)染效率，具有良好的應(yīng)用前景。丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺，其結(jié)構(gòu)式如下式中，R基團(tuán)為-H或者異丙基；所述的丙烯酰胺類單體為丙烯酰胺或N-異丙基丙烯酰胺。優(yōu)選聚乙烯亞胺為超支化的重均分子量為25k的聚乙烯亞胺。丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺制備方法的步驟和條件如下(1)按照聚乙烯亞胺在氯仿中濃度為0.050.3g/ml，將聚乙烯亞胺溶于氯仿中，再注入到反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，按照丙烯酰胺類單體與聚乙烯亞胺物質(zhì)的量比為88:1400:l，稱取丙烯酰胺類單體加入上述聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，5(TC反應(yīng)4天；(3)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液旋干，得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，得到目標(biāo)產(chǎn)物丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺。丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺在基因傳遞中的應(yīng)用，其在體外轉(zhuǎn)染或體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其步驟和條件如下(1)細(xì)胞的培養(yǎng)將細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37t:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。(2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基稀釋，按每孔IX104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37t:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到8090%，轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，加入基因轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及無血清或者含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積200ii1，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率。(4)細(xì)胞毒性測試采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法比較評價基因載體材料的細(xì)胞毒性。實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基稀釋，按每孔1X104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37t:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達(dá)8090%，將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20ii1含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%MTT的PBS溶液，混合物在37"繼續(xù)作用4小時，加入200yl二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘，然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm，細(xì)胞存活率按下公式計算細(xì)胞存活率(％)=(As—乂A一r。》X100Asam*是加入聚合物溶液的細(xì)胞樣品孔的吸收，A。。ntw是未加入聚合物溶液的細(xì)胞樣品孔的吸收，每組實驗重復(fù)三次。丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體的用法，其步驟和條件如下取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5i！g熒光素酶質(zhì)粒的基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒溶液100iU。第二天重復(fù)注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在進(jìn)行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200iU熒光素酶底物，10分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。有益效果本發(fā)明提供的丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺用作非病毒基因載體材料時，PEN175其最高轉(zhuǎn)染效率為商品化的PEI25K的9倍多，而細(xì)胞毒性在濃度20yg/ml時僅為PEI25K的1/3左右，是一種低毒高效的非病毒基因載體，具有廣泛的應(yīng)用前景。圖1是實施例1的用N-異丙基丙烯酰胺修飾的聚乙烯亞胺的體外轉(zhuǎn)染效率柱形圖。圖2是實施例1和2制備的目標(biāo)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性曲線。B為PEI25k，A為PEA100，，為PEA200，參為PEA400，A為PEN88，v為PEN175，〇為PEN350。具體實施例方式實施例1:用N-異丙基丙烯酰胺(簡稱NIPA)修飾的聚乙烯亞胺的制備(1)分別稱取1.5g超支化的重均分子量為25K的聚乙烯亞胺(簡稱PEI25k)，按照表1分別溶于氯仿中，注入到反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，分別按照表l的N-異丙基丙烯酰胺與PEI25k的物質(zhì)的量比為88:1、175:1和350:1，稱取N-異丙基丙烯酰胺加入上述聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，5(TC反應(yīng)4天；(3)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液旋干，得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，分別得到N-異丙基丙烯酰胺修飾的聚乙烯亞胺PEN88、PEN175和PEN350，詳見表1。表1:用N-異丙基丙烯酰胺修飾的聚乙烯亞胺的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2:用丙烯酰胺(簡稱AA)修飾的聚乙烯亞胺的制備(1)分別稱取15g超支化的重均分子量為25K的聚乙烯亞胺(簡稱PEI25k)，按照表2分別溶于氯仿中，注入到反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，分別按照表2的丙烯酰胺與PEI25k的物質(zhì)的量比為100:1、200:1和400:1，稱取丙烯酰胺加入上述聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，5(TC反應(yīng)4天；(3)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液旋干，得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，分別得到丙烯酰胺修飾的聚乙烯亞胺PEA88、PEA175和PEA350，詳見表2。表2:用丙烯酰胺修飾的聚乙烯亞胺的制備產(chǎn)物編號AA:PEI25k(mo1)PEI25k濃度(g/ml)產(chǎn)物中AA數(shù)PEA100100:10.3129.0PEA200200:i0.15190.4PEA400400:i0.05366.0實施例3:目標(biāo)產(chǎn)物介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒對人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的體外轉(zhuǎn)染1、HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)取HeLa細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37。C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)；2、體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1乂104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于體積分?jǐn)?shù)為5%0)2、371:孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度到達(dá)8090%。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，更換200ii1/孔含有體積分?jǐn)?shù)10X胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，再選用熒光素酶質(zhì)粒(pGL3)分別加入實施例1-2得到的各種目標(biāo)產(chǎn)物與pGL3及PEI25k/pGL3的復(fù)合物顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染對比，繼續(xù)培養(yǎng)48小時;3、體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，使用照度計測定轉(zhuǎn)染效率，表示為每毫克蛋白的發(fā)光單元數(shù)(RLU/mgProtein)，測試結(jié)果見圖1。實施例4:目標(biāo)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性測試1、HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)取HeLa細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37。C含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)；2、毒性測試采用MTT的方法比較評價實施例1-2得到的各種目標(biāo)產(chǎn)物和PEI25k的材料細(xì)胞毒性。實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM稀釋，按每孔1X104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37t:含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到8090%。將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20ii1含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%MTT的PBS溶液。混合物在37t:繼續(xù)作用4小時，加入200yl二甲基亞砜溶解MTT甲臢結(jié)晶10分鐘。然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm。細(xì)6胞存活率按下公式計算細(xì)胞存活率(％)=(As卿jAc。ntr。》X100Asample是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收，A。。ntw是不與復(fù)合物溶液作用的細(xì)胞樣品孔的吸收，每組實驗重復(fù)三次，測試結(jié)果見圖2。實施例5:PEN175介導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染實驗取5周的巴比賽裸鼠，在腹側(cè)皮下接種人宮頸癌上皮細(xì)胞的細(xì)胞株，待腫瘤直徑長至0.4cm后，隨機分為兩組，每組6只，分別在瘤內(nèi)注射含5iig熒光酶質(zhì)粒(pGL3)的PEN175/pGL3與PEI25K/pGL3復(fù)合物顆粒溶液100yl。第二天重復(fù)注射一次，注射后48小時，用精諾真活體成像儀觀測體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。在進(jìn)行活體成像觀察之前，將小鼠麻醉。麻醉5分鐘后，向小鼠體內(nèi)注入200iU熒光素酶底物。10分鐘后，用活體成像系統(tǒng)觀察體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果。權(quán)利要求丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如下式中，R基團(tuán)為-H或者異丙基；所述的丙烯酰胺類單體為丙烯酰胺或N-異丙基丙烯酰胺。F2009102178493C0000011.tif2.如權(quán)利要求1所述的丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺，其特征在于，所述的聚乙烯亞胺為超支化的重均分子量為25k的聚乙烯亞胺。3.如權(quán)利要求1所述的丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺的制備方法的步驟和條件如下(1)按照聚乙烯亞胺在氯仿中濃度為O.050.3g/ml，將聚乙烯亞胺溶于氯仿中，再注入到反應(yīng)器內(nèi)；(2)然后，按照丙烯酰胺類單體與聚乙烯亞胺物質(zhì)的量比為88:1400:l，稱取丙烯酰胺類單體加入上述聚乙烯亞胺的氯仿溶液中，5(TC反應(yīng)4天；(3)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液旋干，得到的粗產(chǎn)物溶于去離子水中，于截留分子量為3，500的透析袋中對去離子水透析3天，G4砂芯漏斗過濾，凍干，得到目標(biāo)產(chǎn)物丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺。4.權(quán)利要求1所述的丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺在基因傳遞中的應(yīng)用，其特征在于，其在體外轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。5.權(quán)利要求1所述的丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺在基因傳遞中的應(yīng)用，其特征在于，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中作為基因傳遞載體。全文摘要本發(fā)明涉及丙烯酰胺類單體修飾的聚乙烯亞胺、制法和在基因傳遞中的應(yīng)用。本發(fā)明通過用丙烯酰胺或N-異丙基丙烯酰胺單體修飾聚乙烯亞胺，不僅降低了細(xì)胞毒性，而且提高了轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明提供的丙烯酰胺或N-異丙基丙烯酰胺單體修飾的聚乙烯亞胺用作非病毒基因載體材料時，其最高轉(zhuǎn)染效率為商品化的PEI25K的9倍多，而細(xì)胞毒性在濃度20μg/ml時僅為PEI25K的1/3左右，是一種低毒高效的非病毒基因載體，具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號C12N15/85GK101704949SQ200910217849公開日2010年5月12日申請日期2009年11月13日優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日發(fā)明者景遐斌,李非凡,田華雨,陳學(xué)思申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所