應(yīng)答蛻皮激素的家蠶卵黃原蛋白啟動子及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了應(yīng)答蛻皮激素的家蠶卵黃原蛋白啟動子及其制備方法和應(yīng)用，家蠶卵黃原蛋白啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.11所示，由1474個核苷酸組成，該啟動子含有3個家蠶BrC-Z2的特異性結(jié)合位點，能夠與BmBrC-Z2蛋白特異結(jié)合，并受蛻皮激素誘導(dǎo)表達；本發(fā)明還公開了家蠶卵黃原蛋白啟動子的制備方法和應(yīng)用，為研究蛻皮激素誘導(dǎo)表達基因的功能基因以及這些基因是如何受蛻皮激素調(diào)控的機理提供了有力的工具。
【專利說明】應(yīng)答蛻皮激素的家蠶卵黃原蛋白啟動子及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)答蛻皮激素家蠶卵黃原蛋白啟動子，還涉及該啟動子的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲，為中華民族文化經(jīng)濟社會的發(fā)展做出了極為重要的貢獻。同時，其遺傳背景清楚，遺傳資源豐富，又是國際公認的鱗翅目模式昆蟲。卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg),是卵黃磷蛋白的前體,是昆蟲卵發(fā)育和成熟必須的營養(yǎng)組分之一,并且該基因在蛹期特異表達。已有的報道顯示，昆蟲Vg的轉(zhuǎn)錄受到激素和營養(yǎng)信號的共同調(diào)控，如:果蠅3個卵黃蛋白(ypl，yp2，yp3)在脂肪體和卵的濾泡細胞中表達，其表達由組織特異性因子、保幼激素和蛻皮激素共同調(diào)控；蚊子Vg在雌蚊成蟲食血后開始高量表達，這種時期特異性是受蛻皮激素和氨基酸介導(dǎo)的營養(yǎng)信號通路共同調(diào)控。而家蠶卵黃原蛋白(BmVg)是在雌蟲蛹期特異高量表達的，蛹期對于家蠶來說是個變態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵時刻，組織器官更新，代謝旺盛。但是，目前并不清楚家蠶卵黃原蛋白是如何調(diào)控的，因此家蠶卵黃原蛋白BmVg啟動子的開發(fā)，對于揭示這個過程的很多重要基因的功能以及這些基因在變態(tài)期是如何受激素調(diào)控的機理是一個理想的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供應(yīng)答蛻皮激素家蠶卵黃原蛋白啟動子；本發(fā)明的目的之二在于提供家蠶卵黃原蛋白啟動子的制備方法；本發(fā)明的目的之三在于提供含有家蠶卵黃原蛋白啟動子的重組表達載體；本發(fā)明的目的之四在于提供家蠶卵黃原蛋白啟動子的應(yīng)用。
[0004]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0005]應(yīng)答蛻皮激素的家蠶卵黃原蛋白啟動子，所述家蠶卵黃原蛋白啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示。
[0006]2.所述家蠶卵黃原蛋白啟動子的制備方法，以家蠶品種P50上蔟三天基因組為模板，SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示序列為引物進行PCR擴增。
[0007]優(yōu)選的，所述PCR擴增的條件為94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性40秒，55°C退火30秒，72°C延伸80秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，4°C保存。
[0008]3.含有所述家蠶卵黃原蛋白啟動子的重組表達載體。
[0009]優(yōu)選的,所述重組表達載體由SEQ ID N0.11所示核苷酸序列連入細胞轉(zhuǎn)染載體pGL3 basic的XhoI和HindIII酶切位點處而得。
[0010]4.所述家蠶卵黃原蛋白啟動子在制備蛻皮激素誘導(dǎo)表達的重組載體中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了一種應(yīng)答蛻皮激素的家蠶卵黃原蛋白啟動子，通過分析家蠶卵黃原蛋白基因表達譜發(fā)現(xiàn)，家蠶卵黃原蛋白在變態(tài)發(fā)育期高表達，然后利用蛻皮激素和保幼激素分別處理體外培養(yǎng)家蠶脂肪體發(fā)現(xiàn)，BmVg受蛻皮激素誘導(dǎo)表達，并存在時間和濃度依賴性，對啟動子分析發(fā)現(xiàn)BmVg啟動子含有3個BrC結(jié)合元件，并且能夠與BmBrC-Z2蛋白特異結(jié)合，因此可以得出BmVg啟動子受蛻皮激素的調(diào)控表達，可作為一個蛻皮激素調(diào)控靶標基因的模式啟動子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0013]圖1.BmVg的轉(zhuǎn)錄與激素的關(guān)系(A:雌家蠶變態(tài)期BmVg基因的轉(zhuǎn)錄譜；B:不同濃度保幼激素處理體外培養(yǎng)脂肪體；C:不同濃度蛻皮激素處理體外培養(yǎng)脂肪體；D:0.2 μ M蛻皮激素分別處理體外培養(yǎng)脂肪體0，6，12，24，48小時)。
[0014]圖2為BmVg啟動子結(jié)構(gòu)示意圖(其中粗箭頭為BrC_Z2結(jié)合基序，轉(zhuǎn)角箭頭處為轉(zhuǎn)錄起始位點)。
[0015]圖3為BmVg受蛻皮激素的調(diào)控是通過BmBrC_Z2起作用的(A和B:細胞轉(zhuǎn)染分析BrC-Z2結(jié)合元件對BmVg啟動子應(yīng)答蛻皮激素的響應(yīng)；C和D:EMSA實驗分析BmBrC_Z2蛋白與預(yù)測的結(jié)合位點相互作用。
【具體實施方式】
[0016]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0017]實施例1、脂肪體體外培養(yǎng)與激素處理
[0018]取家蠶品種p50雌蟲五齡幼蟲第五天、第七天、上蔟第一天、第二天、第三天、化蛹第一天，第二天(5D5L、7D7L、WU W2、W3、Pl和P2)不同時期的脂肪體，用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)提取組織的總 RNA,并用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega, Madison,WI)合成cDNA。然后利用表1所示的引物進行半定量PCR和定量PCR檢測BmVg基因的表達情況，結(jié)果如圖1A所示。其中半定量PCR的檢測條件為94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性40秒，58°C退火30秒，72°C延伸80秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，4°C保存。定量PCR的檢測條件為95°C預(yù)變性30秒；95°C變性5秒，60°C退火30秒，95°C延伸15秒，共40個循環(huán)。
[0019]表1、半定量和定量檢測檢測BmVg基因表達的引物序列
[0020]
【權(quán)利要求】
1.應(yīng)答蛻皮激素的家蠶卵黃原蛋白啟動子，其特征在于:所述家蠶卵黃原蛋白啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示。
2.權(quán)利要求1所述家蠶卵黃原蛋白啟動子的制備方法，其特征在于:以家蠶品種p50基因組為模板，以SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示序列為引物進行PCR擴增。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述PCR擴增的條件為94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性40秒，55°C退火30秒，72°C延伸80秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，4°C保存。
4.含有權(quán)利要求1所述家蠶卵黃原蛋白啟動子的重組表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體由SEQIDN0.11所示核苷酸序列連入細胞轉(zhuǎn)染載體pGL3 basic的XhoI和HindIII酶切位點處而得。
6.權(quán) 利要求1所述家蠶卵黃原蛋白啟動子在制備蛻皮激素誘導(dǎo)表達的重組載體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/113GK103757023SQ201410032096
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】夏慶友, 楊從文, 林英 申請人:西南大學(xué)