桑螟β-呋喃果糖苷酶、編碼基因、基因載體、菌株及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來自桑螟的β-呋喃果糖苷酶、編碼基因、基因載體、菌株及應(yīng)用。本發(fā)明提供的桑螟β-FFase是序列表中SEQ?ID?NO.1所示的由488個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明從桑樹重要害蟲桑螟的中腸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中克隆得到DpSuc1a，該基因在桑螟的中腸高量表達，與表達載體pET-24b連接，轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)誘導(dǎo)表達，獲得了可溶性融合蛋白DpSUC1a，經(jīng)酶學(xué)特性鑒定，重組DpSUC1a具有β-FFase的活性，說明β-FFase是桑螟為害桑樹，避免桑樹生物堿毒害作用的重要酶蛋白。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白對食桑害蟲抵抗桑樹生物堿的分子機制研究，以及進一步利用植物轉(zhuǎn)基因RNAi等技術(shù)開發(fā)新型抗蟲靶標(biāo)具有重要的理論及實際意義，將在桑園害蟲防治和增強桑樹抗蟲性的研究中發(fā)揮重要的作用，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】桑螟β-呋喃果糖苷酶、編碼基因、基因載體、菌株及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于昆蟲分子生物學(xué)和植物生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及桑螟β-FFase基因DpSucla的擴增、全長cDNA的克隆和鑒定及其編碼蛋白的體外表達與酶活性分析。
【背景技術(shù)】
[0002]多種植物在機械性損傷或者昆蟲取食的部位滲出乳液或其他分泌物。大量研究表明這些乳液富含多種化學(xué)防護物質(zhì)，如萜類、生物堿、類黃酮、類固醇等，其通過昆蟲的中腸發(fā)生作用，阻礙昆蟲的攝食或成長，進而在防御植食性昆蟲食害方面起重要作用。乳液因此被認為是與植物的抗蟲防御功能密切相關(guān)。
[0003]另一方面，植食性昆蟲進化出對植物的復(fù)雜的適應(yīng)性，從分子、生理、行為方面抵御各種乳液的損害。桑樹是迄今為止被發(fā)現(xiàn)含有脫氧野尻霉素(DNJ)等糖類似生物堿的幾種高等植物之一，桑葉的乳液中含有高濃度的次生代謝產(chǎn)物生物堿。Konno等人的研究發(fā)現(xiàn)，桑葉乳液中所含的生物堿對一些鱗翅目昆蟲如寡食性的蓖麻蠶和多食性的甘藍夜蛾幼蟲具有強烈的毒害作用。
[0004]蔗糖水解酶有兩種:一種是從葡萄糖基一側(cè)起催化作用的α-葡萄糖苷酶，另一種是從果糖基一側(cè)水解鹿糖的β -呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase, β-FFase,在動物中鮮有報道)。研究表明，生物堿是α-葡萄糖苷酶的強效抑制劑，而對β-FFase沒有抑制作用。^mBombyx是以桑葉為唯一食物和糖營養(yǎng)來源的經(jīng)濟昆蟲，家蠶的基因組中存在β-FFase基因(汝?5i/c7)，其在幼蟲中腸中特異表達并被證實具有不受生物堿抑制的酶活性質(zhì)。研究認 為家蠶正是利用β-FFase的功能充分分解吸收桑葉中的蔗糖營養(yǎng)，從而成功地避開了桑葉生物堿的毒害作用。
[0005]針對當(dāng)前蠶桑產(chǎn)業(yè)的多元化發(fā)展趨勢和要求，桑樹不僅可以作為蠶的飼料來源，更為廣闊的是，桑樹還可以作為生態(tài)桑，用于治理石漠化，起到防沙護林和保護環(huán)境等多方面的作用。桑螟imaphania pyloalis)是桑樹重要害蟲之一，對我國多省份夏秋季的桑樹為害相當(dāng)嚴重。我們發(fā)現(xiàn)桑螟的中腸組織蛋白中含有β-FFase的酶活性，桑螟的基因組中同樣存在β-FFase的同源基因(Z05i/c7a)，該基因在桑螟的中腸被大量轉(zhuǎn)錄表達。本發(fā)明對桑螟的β -FFase基因的cDNA進行擴增、克隆和序列分析，通過體外表達重組DpSUCla酶蛋白，鑒定了酶的活性功能。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白對食桑害蟲抵抗桑樹生物堿的分子機制研究，以及進一步利用植物轉(zhuǎn)基因RNAi等技術(shù)開發(fā)新型抗蟲靶標(biāo)具有重要的理論及實際意義，將在桑園害蟲防治和增強桑樹抗蟲性的研究中發(fā)揮重要的作用，應(yīng)用前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種新的桑螟β -FFase基因的編碼基因、擴增方法及擴增引物組，其編碼基因辦5^7<3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:本發(fā)明提供了用于擴增桑螟β -FFase基因的引物組，由如下引物組成:
簡并引物:正向引物SUCdgpF如SEQ ID N0.3所示；
反向引物SUCdgpR如SEQ ID N0.4所示。
[0008]RACE 引物:5’ RACE 外引物 DpSucla_5RAgsp，如 SEQ ID N0.5 所示；
5’ RACE 內(nèi)引物 DpSucla-5RAngsp，如 SEQ ID N0.6 所示；
3，RACE 外引物 DpSucla-3RAgsp，如 SEQ ID N0.7 所示；
3’ RACE 內(nèi)引物 DpSucla-3RAngsp，如 SEQ ID N0.8 所示。
[0009]本發(fā)明還提供了桑螟β -FFase基因的制備方法，包括如下步驟:
步驟1:獲得桑螟中腸的總RNA ；
步驟2:反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；
步驟3:以cDNA為模版， 用簡并引物SUCdgpF和SUCdgpR為引物進行PCR，擴增得到中間序列；
步驟4:用RACE引物組擴增獲得桑螟β -FFase基因片段的5’端和3’端片段；
步驟5:將所述β -FFase基因cDNA序列的中間片段、所述β -FFase基因的5’端和3’端片段拼接，即得桑螟β -FFase基因的全長cDNA片段。
[0010]作為優(yōu)選，步驟4所述擴增為套式兩輪PCR。
[0011]本發(fā)明的目的之二是提供含有新的桑螟β-FFase基因的重組質(zhì)粒pET_24b/DpSucla及其構(gòu)建方法。
[0012]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
利用含有酶切位點的引物DpSuclaF和DpSuclaR WlDpSucla的ORF進行PCR擴增，擴增引物DpSuclaF和DpSuclaR分別如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示；PCR擴增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5 min，然后94°C變性40s、58°C退火40s、72°C延伸lmin30s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。將擴增產(chǎn)物和載體pET_24b分別經(jīng)過及麗Y I和沿ο I雙酶切6h，連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，挑取單克隆培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，即為原核表達質(zhì)粒 pET_24b/DpSucla。
[0013]本發(fā)明的目的之三是提供一種新的來自桑螟的β-FFase，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，其編碼基因的核苷酸如SEQ ID N0.2所示。其通過含有新的桑螟β-FFase基因的重組質(zhì)粒pET-24b/DpSucla轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21之后獲得工程菌所實現(xiàn)的。
[0014]為解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:
構(gòu)建了一種含有桑螟β-FFase基因的重組質(zhì)粒pET-24b/DpSucla。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆于10 ml LB培養(yǎng)基中，37°C，220rpm，培養(yǎng)12h即獲得含有新的桑螟β -FFase基因的重組質(zhì)粒pET_24b/DpSucla的工程菌。取4ml菌液接種于250ml的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，37°C，220rpm，振蕩培養(yǎng)至OD6tltl~0.6-0.8，加入IPTG至終濃度0.5mM，30°C誘導(dǎo)表達10h。將誘導(dǎo)后的菌液于4°C，5000rpm離心5min，收集菌體，超聲破碎后SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)重組蛋白穩(wěn)定表達并大量存在于可溶性的上清蛋白中。
[0015]本發(fā)明還提供了新的來自桑螟的β-FFase的應(yīng)用，其主要依賴于對新的來自桑螟的β -FFase進行酶活性測試之后對酶活性的確認，該酶活性可以用于對具有β -FFase底物結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進行轉(zhuǎn)化。[0016]本發(fā)明還提供了桑螟P -FFase的氨基酸序列與家蠶BmSUCl氨基酸序列進行比對，二者的同源性高達66%，且具有相同預(yù)測的酶活性位點，說明桑螟也可以利用體內(nèi)的^ -FFase來避開桑樹乳液中的高濃度生物堿的毒害作用，為利用P -FFase防治桑園害蟲提供了重要的理論依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為桑螟P -呋喃果糖苷酶的辦5^7<3和家蠶同源基因汝的編碼蛋白序列比對。黑色區(qū)域為相同的氨基酸，灰色區(qū)域為類似性氨基酸，預(yù)測的活性位點以向下的箭頭標(biāo)出。
[0018]圖2為用含有酶切位點的引物DpSucIaF和DpSucIaR進行PCR擴增得到的含DpSucla ORF的電泳圖。
[0019]圖3為含有桑螟0 -FFase基因的重組質(zhì)粒pET_24b/DpSucla酶切驗證圖。泳道I:pET-24b空載體；泳道2:pET-24b空載體雙酶切產(chǎn)物；泳道3:重組質(zhì)粒；泳道4:重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；M:DNA分子量Marker。
[0020]圖4為體外表達重組蛋白DpSUCla的SDS-PAGE電泳圖。泳道1:pET_24b空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)菌誘導(dǎo)表達后的上清蛋白；泳道2:重組質(zhì)粒pET_24b/DpSucla轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌誘導(dǎo)表達后的上清蛋白；M:蛋白分子量Marker ;箭頭所示為目的重組蛋白。
[0021]圖5為體外表達重組蛋白DpSUCla的Western blot圖。泳道1:pET_24b空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)菌誘導(dǎo)表達后的上清蛋白；泳道2:重組質(zhì)粒pET-24b/DpSucla轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)菌誘導(dǎo)表達后的未純化的上清蛋白；泳道3:純化后的重組蛋白；M:蛋白分子量Marker。箭頭所示為 目的重組蛋白。
[0022]圖6為重組蛋白DpSUCla在不同pH條件下的酶活性。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非限定本發(fā)明的范圍。
[0024]下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0025]實施例1.桑螟中腸組織總RNA的提取
桑螟iDiaphania py1alis)在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)園桑園(大楊店)采集,并經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定為桑螟{Diaphania pyloalis) 0將幼蟲解剖,取中腸,放入預(yù)冷的研缽中,研磨至粉末狀，加入Iml的Trizol，混勻后轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，劇烈震蕩。加入200 的氯仿，劇烈震蕩30s，室溫靜置5min ;4° C下12000 X g離心15min，取上清約400 移到新的去RNA酶管，加入等體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，冰上靜置15-20min ;4° C下12000Xg離心15 min,去盡上清后加入Iml預(yù)冷的75%的乙醇清洗2次后4° C，12000 X g離心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入適量DEPC水溶解RNA沉淀即得到桑螟中腸組織總RNA，-80°C保存。
[0026]實施例2.桑螟P-FFase編碼基因的克隆及氨基酸序列分析
2.1桑螟中腸cDNA的獲得
以實施例1獲得的桑螟中腸組織總RNA為模版，利用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(以下各逆轉(zhuǎn)錄所用試劑均來自于試劑盒TransScript II First-Strand cDNA SynthesisSuperMix,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)。
[0027]在微量離心管中配置下列模版RNA/Primer反應(yīng)液:
總 RNAI Ug
Oligo (dT) 2。引物(0.5 μ g/μ l)1μl
2 X TS II Reaction MIX1μl
TransScript II RT/RI Enzyme Mix1μl
RNase-free Waterto 20 μl
混合后 55°C孵育 30min,再 85°C加熱 5 min 失活 TransScript II RT。
[0028]2.2桑螟β -FFase基因的克隆
依據(jù)蔗糖水解酶32家族的保守性，設(shè)計一對簡并引物SUCdgpF (如SEQ ID N0.3所示)和SUCdgpR (如SEQ ID N0.4所示)進行PCR擴增。
[0029]用逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，使用簡并引物SUCdgpF和SUCdgpR為引物，PCR其反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，然后94°C變性40s、48°C退火lmin、72°C延伸lmin30s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(Sangon)回收。將該DNA片段連接到pMD19_T載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆送到上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，得到557bp桑螟β -FFase基因的保守序列片段。
[0030]根據(jù)已經(jīng)獲得的保守片段設(shè)計基因特異性引物。
[0031]RACE 引物:5’ RACE 外引物 DpSucla_5RAgsp，如 SEQ ID N0.5 所示，
5’ RACE 內(nèi)引物 DpSucla-5RAngsp，如 SEQ ID N0.6 所示，
3，RACE 外引物 DpSucla-3RAgsp，如 SEQ ID N0.7 所示，
3’ RACE 內(nèi)引物 DpSucla-3RAngsp，如 SEQ ID N0.8 所示。
[0032]按照GeneRacer ? Kit (Invitrogen)的要求進行桑螟 β-FFase 基因的 5’ RACE和3’ RACE操作。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，用設(shè)計的5’ RACE和3’ RACE外引物分別進行第一輪PCR擴增。第一次反應(yīng)體系為20ul，反應(yīng)條件如下表:
【權(quán)利要求】
1.一種桑螟P -呋喃果糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述的一種桑螟P-呋喃果糖苷酶的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的一種編碼桑螟(6-呋喃果糖苷酶的基因，其特征為所述基因序列如SEQ ID N0.2所示。
4.權(quán)利要求2或者3所述的一種編碼桑螟(6-呋喃果糖苷酶基因在制備重組(6-呋喃果糖苷酶中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2或者3所述的一種編碼桑螟(6-呋喃果糖苷酶基因的制備方法，該方法包括:提取桑螟中腸的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，用簡并引物克隆獲得部分基因序列，然后用RACE方法獲得長度為1762bp的cDNA全長基因，序列如SEQ ID N0.2所示，包含一個1467bp完整開放閱讀框ORF。
6.如權(quán)利要求5所述的一種編碼桑螟(6-呋喃果糖苷酶基因的制備方法，其特征在于，所述簡并引物和RACE方法用到的RACE引物如下: 簡并引物:正向引物SUCdgpF如SEQ ID N0.3所示， 反向引物SUCdgpR如SEQ ID N0.4所示； RACE 引物:5’ RACE 外引物 DpSucla-5RAgsp，如 SEQ ID N0.5 所示，
5’ RACE 內(nèi)引物 DpSucla-5RAngsp，如 SEQ ID N0.6 所示， 3，RACE 外引物 DpSucla-3RAgsp，如 SEQ ID N0.7 所示，`
3’ RACE 內(nèi)引物 DpSucla-3RAngsp，如 SEQ ID N0.8 所示。
7.一種含有權(quán)利要求2或者3所述的一種編碼桑螟P -呋喃果糖苷酶基因辦ORF的重組質(zhì)粒pET-24b/DpSucla，其特征在于，由含有雙酶切位點的引物DpSucIaF和DpSuclaR對ORF進行PCR擴增后，將擴增產(chǎn)物和載體pET_24b分別經(jīng)過及麗7 I和通o I雙酶切6h后進行連接獲得；所述PCR方法中設(shè)計的兩種擴增引物DpSuclaF和DpSuclaR分別如 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10 所示。
8.由權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞得到的基因工程菌株。
9.一種含有如權(quán)利要求1所述的桑螟P -呋喃果糖苷酶的重組蛋白DpSUCla，其特征在于，該重組蛋白是將重組質(zhì)粒pET-24b/DpSucla轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞，經(jīng)擴大培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達，超聲破碎后純化獲得可溶性的重組蛋白。
10.如權(quán)利要求1所述的桑螟(6-呋喃果糖苷酶的應(yīng)用，所述應(yīng)用為利用桑螟(6-呋喃果糖苷酶的活性對具有3-呋喃果糖苷酶底物結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進行轉(zhuǎn)化。
【文檔編號】C12N9/26GK103773748SQ201410031951
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】孟艷, 李靜, 高俊山, 戴偉宏, 張蕾 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)