一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，其步驟：A、根據(jù)雞SLC45A2基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物；B、以引物對(duì)M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15μL體系；C、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物；D、限制性內(nèi)切酶酶切；E、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物；F、銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果；G、在公雞中，條帶為64bp和16bp則為金羽純合子（ZsZs）；條帶為64bp、55bp和16bp則為銀羽雜合子（ZSZs）；條帶為55bp和16bp則為銀羽純合子（ZSZS）；H、在母雞中，條帶為64bp和16bp則為金羽半合子（ZsW）；條帶為55bp和16bp則為銀羽半合子（ZSW）。方法易行，操作簡(jiǎn)便，不受遺傳背景的限制，應(yīng)用范圍廣泛。能夠鑒定出不同個(gè)體在金銀羽位點(diǎn)上的基因型。
【專利說明】—種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雞遺傳育種中分子標(biāo)記應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]初生雛雞的雌雄鑒別在養(yǎng)雞生產(chǎn)中有著重要的意義，在肉雞生產(chǎn)中雛雞出殼時(shí)鑒別雌雄有利于公母分養(yǎng)，便于根據(jù)公母不同的生長(zhǎng)發(fā)育速度、營(yíng)養(yǎng)需求給予不同的飼料和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，避免公雛發(fā)育快，搶食而影響母雛發(fā)育；在商品蛋雞生產(chǎn)中雛雞出殼時(shí)即淘汰公雛可節(jié)省飼養(yǎng)公雛的空間和成本，提高母雞的成活率和整齊度；對(duì)于種雞可通過鑒別雌雄、只出售不同品系單一性別的雛雞保護(hù)育種成果。雛雞的性別鑒定方法大體分為兩類:一類根據(jù)雌雄雛雞的生殖器官的差異，通過對(duì)生殖突起或性腺的直接觀察來鑒定，包括器械鑒別法、翻肛鑒別法等；另一類利用雞性連鎖基因的伴性交叉遺傳現(xiàn)象，使用帶有特定伴性基因基因型的品種或品系進(jìn)行雜交生產(chǎn)自別雌雄配套系，通過雜交后代雛雞絨羽的顏色、淺色斑塊的大小或不同的羽毛生長(zhǎng)速度來鑒別雛雞性別。自別雌雄相對(duì)直接觀察法(如翻肛法，器械鑒別法)有鑒別速度快，準(zhǔn)確率高，不需要對(duì)鑒別人員進(jìn)行專門的技術(shù)培訓(xùn)，對(duì)雛雞損傷小，交叉感染疾病的可能性小的優(yōu)點(diǎn)。目前在自別雌雄配套系生產(chǎn)中應(yīng)用的伴性基因有快慢羽基因、金銀羽基因和橫斑基因。在利用這些基因的自別雌雄方法中，利用金銀羽基因自別雌雄可直接通過雛雞絨羽顏色區(qū)分雌雄，更為簡(jiǎn)單直觀，沒有時(shí)間的限制，而且準(zhǔn)確率更高，具有更好的利用價(jià)值。利用金銀羽基因進(jìn)行自別雌雄時(shí)，使用金羽公雞與銀羽母雞交配，所生后代公雛絨羽為白色，母雛絨羽為紅色。目前金銀羽自別雌雄配套系已廣泛應(yīng)用于來源于洛島紅一洛島白遺傳背景的褐殼蛋雞配套系中，但在其他遺傳背景的雞群中罕見應(yīng)用，一個(gè)重要原因是金銀羽位點(diǎn)上等位基因的表達(dá)很大程度上受其他位點(diǎn)(如E位點(diǎn)等)上的修飾基因影響，因而在一些遺傳背景下很難準(zhǔn)確鑒定個(gè)體金銀羽表型(進(jìn)而鑒定基因型)。采用本發(fā)明的金銀羽位點(diǎn)基因型分子鑒定方法，可以在不同雞種群體中挑選出在金銀羽位點(diǎn)基因型不同的公雞和母雞進(jìn)行繁育，從而達(dá)到在其他遺傳背景下也能利用金銀羽基因進(jìn)行自別雌雄的目的。本發(fā)明建立的方法可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的鑒定不同個(gè)體金銀羽位點(diǎn)上的基因型，有助于金銀羽自別雌雄技術(shù)更廣泛的推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供了一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，在金銀羽自別雌雄配套系中，雛雞的絨羽顏色僅憑肉眼觀察確定，而銀羽雜合子和銀羽純合子表型相同，肉眼無(wú)法區(qū)分，而此分子鑒定方法可以區(qū)分雜合子和純合子。目前金銀羽自別雌雄配套系已廣泛應(yīng)用于來源于洛島紅一洛島白遺傳背景的褐殼蛋雞配套系中，但在其他遺傳背景的雞群中罕見應(yīng)用，一個(gè)重要原因是金銀羽位點(diǎn)上等位基因的表達(dá)很大程度上受其他位點(diǎn)上的修飾基因影響，因而在一些遺傳背景下很難準(zhǔn)確鑒定個(gè)體金銀羽表型(進(jìn)而鑒定基因型)。而此分子鑒定方法不受遺傳背景的限制，應(yīng)用范圍廣泛。能夠鑒定出不同個(gè)體在金銀羽位點(diǎn)上的基因型。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，其步驟是:
A、利用軟件primer premier 5.0,根據(jù)雞SLC45A2基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì) M4-S/A，引物長(zhǎng)度為 22bp:M4-S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’ ；一種分離的DNA序列，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0005]B、以引物對(duì)M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15yL體系如下:1.5yL IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，I μ L的基因組DNA，加超純水補(bǔ)齊至15 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火30s，72。。延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min，15°C，lmin，4°C下保存?zhèn)溆茫?br> C、電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物:取6 yL PCR產(chǎn)物，加3μ L 6 X Loading Buffer，制備濃度為1.2 %的瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣后，在120V電壓下電泳40min，溴化乙錠染色，凝膠成像儀檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無(wú)及大小判定是否擴(kuò)增成功。
[0006]D、限制性內(nèi)切酶酶切:酶切的反應(yīng)體系為:超純水3.6μ L，IOXbufferG 0.5 μ L,內(nèi)切酶4U，PCR產(chǎn)物I μ L。于37°C酶切16h。
[0007]E、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物:采用40%、交聯(lián)度為19:1的聚丙烯酰胺，配制為16%聚丙烯酰胺的凝膠，體系為:聚丙烯酰胺18 mL,5XTBE 9 mL，超純水18 mL, 10%AP350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 電泳 IOmin,再 120V 電泳 5.5h。
[0008]F、銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果:銀染步驟如下:超純水漂洗兩遍，10%的無(wú)水乙醇漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，1%的硝酸漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，為0.2%的硝酸銀加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超純水漂洗兩遍,3%的氫氧化鈉加ImL甲醛漂洗直至出現(xiàn)清晰條帶；超純水漂洗兩遍，3%乙酸終止顯色；換超純水，拍照記錄分析結(jié)果。
[0009]G、在公雞中，若條帶為64bp和16bp則為金羽純合子(ZsZs);若條帶為64bp、55bp和16bp則為銀羽雜合子(ZsZs);若條帶為55bp和16bp則為銀羽純合子(ZsZs)；
H、在母雞中，若條帶為64bp和16bp則為金羽半合子(ZsW);若條帶為55bp和16bp則為銀羽半合子(ZsW)。
[0010]atcccattat cgctgtctgt gtgtgagcca cctctttgga tggatggctt tcctgtccaa 60
catgctcttc ttcacggatt80
下劃線標(biāo)注的為SNP位點(diǎn)。
[0011]在公雞中，若基因型為金羽純合子，則該位點(diǎn)為C/C;若為銀羽純合子，則該位點(diǎn)為A/A ;若為銀羽雜合子，則該位點(diǎn)為C/A。
[0012]在母雞中，若基因型為金羽半合子，則該位點(diǎn)為C/-;若為銀羽半合子，則該位點(diǎn)為 A/-。
[0013]采用苯?)—氯仿法提取待鑒定雞的DNA，也可采用鹽析法等其他方法提取DNA。所提取的DNA用于擴(kuò)增基因SLC45A2的部分序列。
[0014]SLC45A2所編碼的蛋白 為膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，含有12個(gè)跨膜區(qū)，與色素的合成有關(guān)?？赡芘cTYR、TYRPl從高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到II期的黑色素小體這個(gè)過程有關(guān)。SLC45A2的突變可能會(huì)影響上述轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)而影響偽黑色素的合成但對(duì)真黑色素的合成沒有影響，最終導(dǎo)致雞的紅黃色羽毛變成白色。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
可以在不同雞種群體中挑選出在金銀羽位點(diǎn)基因型不同的公雞和母雞進(jìn)行繁育，從而達(dá)到在其他遺傳背景下也能利用金銀羽基因進(jìn)行自別雌雄的目的。本發(fā)明建立的方法可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的鑒定不同個(gè)體金銀羽位點(diǎn)上的基，有助于金銀羽自別雌雄技術(shù)更廣泛的推廣和應(yīng)用。
[0016]在金銀羽自別雌雄配套系中，使用金羽公雞與銀羽母雞交配，所生后代公雛絨羽為白色，母雛絨羽為紅色。雛雞絨羽的顏色僅通過肉眼觀察確定，銀羽純合子和銀羽雜合子的表型一致，無(wú)法通過肉眼區(qū)別。而此分子鑒定方法可區(qū)分雜合子與純合子。目前金銀羽自別雌雄配套系已廣泛應(yīng)用于來源于洛島紅一洛島白遺傳背景的褐殼蛋雞配套系中，但在其他遺傳背景的雞群中罕見應(yīng)用，一個(gè)重要原因是金銀羽位點(diǎn)上等位基因的表達(dá)很大程度上受其他位點(diǎn)上的修飾基因影響，因而在一些遺傳背景下很難準(zhǔn)確鑒定個(gè)體金銀羽表型(進(jìn)而鑒定基因型)。而分子鑒定方法不受遺傳背景的限制。在除洛島紅一洛島白以外的遺傳背景下，可先利用此分子鑒定方法確定個(gè)體的基因型，然后在相同基因型的個(gè)體之間找出表型上的共同點(diǎn)，并找出影響其表型的修飾基因，從而達(dá)到在其他的遺傳背景條件下也能夠采用金銀羽自別雌雄。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法流程圖。
[0018]圖2為一種金 銀羽配套系京紅雞DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖。
[0019]編號(hào)說明如下:
1-4:雌性，金羽，ZsW ； 5-8:雌性，銀羽，ZsW 9-12:雄性，金羽，ZsZs ; 13-16:雄性，銀羽，ZsZs NC:陰性對(duì)照
除陰性對(duì)照外，均擴(kuò)增出80bp的條帶。DNA Marker為marker I。
[0020]圖3為一種酶切產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染的結(jié)果示意圖。
[0021]編號(hào)說明如下:
1-4:雌性，金羽，ZsW ； 5-8:雌性，銀羽，ZsW 9-12:雄性，金羽，ZsZs ； 13-16:雄性，銀羽，ZsZs NC:陰性對(duì)照
DNA Marker 為 low ladder。
[0022]1-4的條帶為64bp和16bp,5_8的條帶為55bp和16bp 9-12 的條帶為 64bp 和 16bp, 13-16 的條帶為 64bp、55bp 和 16bp。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1:
一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，其步驟是:
1.試樣的制備與保存:采集中國(guó)湖北省武漢市天牧養(yǎng)殖場(chǎng)的羅曼褐父母代公母雞及其商品代雛雞(公母雞)血樣，檸檬酸抗凝劑抗凝，置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室保存于_20°C冰箱中備用。取60 μ L抗凝血樣，采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取血樣中的0應(yīng)，將DNA樣品保存于4°C冰箱中備用。
[0024]2、引物設(shè)計(jì):利用軟件primer premier 5.0,根據(jù)雞的SLC45A2基因的DNA序列的8821位到9781位設(shè)計(jì)引物對(duì)M4-S/A，引物長(zhǎng)度為22bp:M4_S:5’ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’ AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’；
一種分離的DNA序列，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0025]3、PCR 擴(kuò)增:
以引物對(duì)M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15μ L體系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，I μ L的基因組DNA，加超純水補(bǔ)齊至15 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火30s，72。。延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min，15°C，lmin，4°C下保存?zhèn)溆茫?br> 4、電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物:
取6 yL PCR產(chǎn)物，加3μ L 6 X Loading Buffer，制備濃度為1.2 %的瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣后，在120V電壓下電泳40min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無(wú)及大小判定是否擴(kuò)增成功。
[0026]5、限制性內(nèi)切酶酶切:
酶切的反應(yīng)體系為:超純水3.6 μ L，10XbufferG 0.5yL，內(nèi)切酶4U，PCR產(chǎn)物I μ L。于37°C酶切16h。
[0027]6、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物:
采用濃度為40%、交聯(lián)度為19:1的聚丙烯酰胺，配制濃度為16%聚丙烯酰胺的凝膠，體系為:聚丙烯酰胺 18 mL,5XTBE 9 mL，超純水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V電泳IOmin,再120V電泳5.5h。
[0028]7、銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果:
銀染步驟如下:超純水漂洗兩遍，濃度為10%的無(wú)水乙醇漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，1%的硝酸漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，0.2%的硝酸銀加750 μ L甲醛避光漂洗20min ;超純水漂洗兩遍，3%的氫氧化鈉加ImL甲醛漂洗直至出現(xiàn)清晰條帶；超純水漂洗兩遍，3%乙酸終止顯色；換超純水，拍照記錄分析結(jié)果。
[0029]8、基因型鑒定:
按照本發(fā)明的方法鑒定不同個(gè)體的基因型，結(jié)果顯示:所檢測(cè)的91只金羽母雞(商品代)全為金羽半合子(ZSW)，準(zhǔn)確率為100% ；71只銀羽公雞(商品代)全為銀羽雜合子(ZSZS)，準(zhǔn)確率為100% ;65只銀羽母雞(父母代)中64只為銀羽半合子(ZSW)，I只為金羽半合子(ZSW)，準(zhǔn)確率為98.5% ；71只金羽公雞(父母代)全為金羽純合子(ZsZs),準(zhǔn)確率為100%。
[0030]實(shí)施例2:
一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，其步驟是:
1.試樣的制備與保存:
采集中國(guó)湖北省荊州市峪口禽業(yè)有限公司的京紅父母代公母雞及其商品代雛雞(公母雞)血樣，檸檬酸抗凝劑抗凝，置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-20°C冰箱中備用。取60 μ L抗凝血樣，采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取血樣中的DNA，將DNA樣品保存于4°C冰箱中備用。[0031]2、引物設(shè)計(jì):利用軟件primer premier 5.0，根據(jù)雞SLC45A2基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì) M4-S/A，引物長(zhǎng)度為 22bp:M4_S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3，；
一種分離的DNA序列，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0032]3、PCR 擴(kuò)增:
以引物對(duì)M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15μ L體系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，I μ L的基因組DNA，加11.65 μ L超純水補(bǔ)齊至15 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min, 15。。，lmin, 4°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0033]4、電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物
取6 yL PCR產(chǎn)物，加3μ I 6 X Loading Buffer，制備濃度為1.2 %的瓊脂糖凝膠，在120V的電壓下電泳40min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無(wú)及大小判定是否擴(kuò)增成功。
[0034]5、限制性內(nèi)切酶酶切
酶切的反應(yīng)體系為: 超純水3.6 μ L，10XbufferG 0.5yL，內(nèi)切酶4U，PCR產(chǎn)物I μ L。于37°C酶切16h。
[0035]6、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物
采用40%、交聯(lián)度為19:1的聚丙烯酰胺，配制16%的凝膠，體系為:聚丙烯酰胺18 mL,5 X TBE 9 mL，超純水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 電泳 lOmin，再 120V 電泳 5.5h。
[0036]7、銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果
銀染步驟如下:超純水漂洗兩遍，10%無(wú)水乙醇漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，1%硝酸漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍,0.2%硝酸銀加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超純水漂洗兩遍，3%氫氧化鈉加ImL甲醛漂洗直至出現(xiàn)清晰條帶；超純水漂洗兩遍，3%乙酸終止顯色，換超純水。拍照記錄分析結(jié)果。
[0037]8、基因型鑒定。
[0038]按照本發(fā)明的方法鑒定不同個(gè)體的基因型，結(jié)果顯示:所檢測(cè)的42只金羽母雞(商品代)全為金羽半合子(Zsw)，準(zhǔn)確率為100% ；37只銀羽公雞(商品代)全為銀羽雜合子(ZsZs),準(zhǔn)確率為100% ；40只銀羽母雞(父母代)全為銀羽半合子(ZSW)，準(zhǔn)確率為100% ； 40只金羽公雞(父母代)全為金羽純合子(ZsZs),準(zhǔn)確率為100%。
[0039]實(shí)施例3:
一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，其步驟是:
1.試樣的制備與保存:
采集中國(guó)湖北省恩施市的景陽(yáng)雞(景陽(yáng)雞羽色:不論雛雞還是成年雞，均有兩種類型，一種是粟麻，一種是黃麻。粟麻公母雞項(xiàng)羽、主翼羽、主尾羽末端羽毛為黑色，其他為粟麻色，背羽、腹羽，鞍羽為淺粟麻色。黃麻羽公雞羽色紅亮，項(xiàng)羽、主翼羽、主尾羽末端為黑色，背羽、腹羽、鞍羽等其他部位為黃麻色，母雞全身羽毛為淺黃麻色。)血樣，檸檬酸抗凝劑抗凝，置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室保存于_20°C冰箱中備用。取60 μ L抗凝血樣，采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取血樣中的DNA，將DNA樣品保存于4°C冰箱中備用。
[0040]2、引物設(shè)計(jì):利用軟件primer premier 5.0,根據(jù)雞SLC45A2基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì) M4-S/A，引物長(zhǎng)度為 22bp:M4_S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’。一種分離的DNA序列，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷
酸序列。
[0041]3、3、PCR 擴(kuò)增:
以引物對(duì)M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15μ L體系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，I μ L的基因組DNA，加11.65 μ L超純水補(bǔ)齊至15 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min, 15。。，lmin, 4°C下保存?zhèn)溆?
4、電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物:
取6 μ L PCR產(chǎn)物，加3 μ I 6XLoading Buffer, 1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳，120V,40min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂公司)檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無(wú)及大小判定是否擴(kuò)增成功。
[0042]5、限制性內(nèi)切酶酶切:
酶切的反應(yīng)體系為:超純水3.6 μ L，10XbufferG 0.5yL，內(nèi)切酶4U，PCR產(chǎn)物I μ L。于37°C酶切16h。
[0043]6、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物:
采用40%、19:1的聚丙烯酰胺，配制16%的凝膠，體系為:聚丙烯酰胺18 mL,5XTBE 9mL,超純水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 電泳 lOmin,再 120V 電泳 5.5h。
[0044]7、銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果:
銀染步驟如下:超純水漂洗兩遍，10%無(wú)水乙醇漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，1%硝酸漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍,0.2%硝酸銀加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超純水漂洗兩遍，3%氫氧化鈉加ImL甲醛漂洗直至出現(xiàn)清晰條帶；超純水漂洗兩遍，3%乙酸終止顯色；換超純水，拍照記錄分析結(jié)果。
[0045]8、基因型鑒定。
[0046]按照本發(fā)明的方法鑒定不同個(gè)體的基因型，結(jié)果顯示:所檢測(cè)的17只黃麻公雞全為金羽純合子(ZsZs) ；24只黃麻母雞全為金羽半合子(ZsW) ；27只粟麻公雞中，13只為銀羽雜合子(ZsZs), 13只為銀羽純合子(ZSZS)，I只為金羽純合子(ZsZs) ；30只粟麻母雞中，23只為銀羽半合子(ZsW)，7只為金羽半合子(ZsW)。
[0047]實(shí)施例4:
一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，其步驟是:
1.試樣的制備與保存:
采集中國(guó)湖北省安陸市欣華雞血樣，檸檬酸抗凝劑抗凝，置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室保存于_20°C冰箱中備用。取60 μ L抗凝血樣，采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取血樣中的DNA，將DNA樣品保存于4 C冰箱中備用。
[0048]2、引物設(shè)計(jì):利用軟件primer premier 5.0,根據(jù)雞基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì) M4-S/A，引物長(zhǎng)度為 22bp:M4_S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’ ；一種分離的DNA序列，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3、PCR擴(kuò)增:
以引物對(duì)M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15μ L體系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，
Iμ L的基因組DNA，加11.65 μ L超純水補(bǔ)齊至15 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min, 15。。，lmin, 4°C下保存?zhèn)溆?
4、電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物:
取6 yL PCR產(chǎn)物，加3μ I 6 X Loading Buffer, 1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳，120V，40min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無(wú)及大小判定是否擴(kuò)增成功。
[0049]5、限制性內(nèi)切酶酶切:
酶切的反應(yīng)體系為:超純水3.6 μ L，10 XbufferG 0.5 μ L ，內(nèi)切酶4U, PCR產(chǎn)物I μ L。于37°C酶切16h。
[0050]6、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物
采用40%、19:1的聚丙烯酰胺，配制16%的凝膠，體系為:聚丙烯酰胺18 mL,5XTBE 9mL,超純水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 電泳 lOmin,再 120V 電泳 5.5h。
[0051]7、銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果:
銀染步驟如下:超純水漂洗兩遍，10%無(wú)水乙醇漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，1%硝酸漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍,0.2%硝酸銀加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超純水漂洗兩遍，3%氫氧化鈉加ImL甲醛漂洗直至出現(xiàn)清晰條帶；超純水漂洗兩遍，3%乙酸終止顯色；換超純水，拍照記錄分析結(jié)果。
[0052]8、基因型鑒定: 按照本發(fā)明的方法鑒定不同個(gè)體的基因型，結(jié)果顯示:所檢測(cè)的40只欣華雞全部為金羽純合子(ZsZs)或金羽半合子(ZsW)。
[0053]實(shí)施例5:
一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，其步驟是:
1.試樣的制備與保存:
采集中國(guó)湖北省十堰市的鄖陽(yáng)白羽烏雞公雞(產(chǎn)于湖北省鄖縣，羽色為全白，均為隱性白羽純合子)精液，用精液保存液保存，置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室保存于_20°C冰箱中備用。取60 μ L抗凝血樣，采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取血樣中的DNA，將DNA樣品保存于4°C冰箱中備用。
[0054]2、引物設(shè)計(jì):利用軟件primer premier 5.0,根據(jù)雞基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì) M4-S/A，引物長(zhǎng)度為 22bp:M4_S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’ ；一種分離的DNA序列，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0055]3、PCR 擴(kuò)增:
以引物對(duì)M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15μ L體系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，Iμ L的基因組DNA，加11.65 μ L超純水補(bǔ)齊至15 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min, 15。。，lmin, 4°C下保存?zhèn)溆谩?br> [0056]4、電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物:
取6 μ L PCR產(chǎn)物，加3 μ I 6XLoading Buffer, 1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳，120V,40min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無(wú)及大小判定是否擴(kuò)增成功。
[0057]5、限制性內(nèi)切酶酶切:
酶切的反應(yīng)體系為:超純水3.6 μ L，10XbufferG 0.5yL，內(nèi)切酶4U，PCR產(chǎn)物I μ L。于37°C酶切16h。
[0058]6、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物:
采用40%、19:1的聚丙烯酰胺，配制16%的凝膠，體系為:聚丙烯酰胺18 mL,5XTBE 9mL,超純水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 電泳 lOmin,再 120V 電泳 5.5h。
[0059]7、銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果:
銀染步驟如下:超純水漂洗兩遍，10%無(wú)水乙醇漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，1%硝酸漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍,0.2%硝酸銀加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超純水漂洗兩遍，3%氫氧化鈉加ImL甲醛漂洗直至出現(xiàn)清晰條帶；超純水漂洗兩遍，3%乙酸終止顯色；換超純水，拍照記錄分析結(jié)果。
[0060]8、基因型鑒定:
按照本發(fā)明的方法鑒定不同個(gè)體的基因型，結(jié)果顯示:所檢測(cè)的36只雄性鄖陽(yáng)白羽烏雞中，33只為金羽純合子(ZsZs )，3只為銀羽雜合子(ZsZs)。
【權(quán)利要求】
1.一種分離的DNA序列，其序列為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的一種雞金銀羽位點(diǎn)基因型的分子鑒定方法，其步驟是: 利用軟件primer premier 5.0,根據(jù)雞基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)M4-S/Α，引物長(zhǎng)度為 22bp，引物序列為:M4-S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3，； 以引物對(duì)M4-S/A為擴(kuò)增引物建立15μ L體系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15μ L 的 dNTP (2.5mM),0.5U 的 Taq 聚合酶，.1 μ L的基因組DNA，加超純水補(bǔ)齊至15 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火30s，72。。延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min，15°C，lmin，4°C下保存?zhèn)溆茫? 電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物:取6 μ L PCR產(chǎn)物，加3μ L 6 X Loading Buffer，制備濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣后，在120V電壓下電泳40min，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，根據(jù)條帶的有無(wú)及大小判定是否擴(kuò)增成功； 限制性內(nèi)切酶酶切:酶切的反應(yīng)體系為:超純水3.6μ L，IOXbufferG 0.5 μ L,內(nèi)切酶4U, PCR 產(chǎn)物 I μ L，于 37°C酶切 16h ； 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物:采用濃度為40%、交聯(lián)度為19:1的聚丙烯酰胺，配制濃度為16%的聚丙烯酰胺凝膠，體系為:聚丙烯酰胺18 mL，5XTBE 9 mL，超純水18 mL,10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L，先 300V 電泳 lOmin，再 120V 電泳 5.5h ； 銀染顯示電泳結(jié)果，根據(jù)條帶的大小和數(shù)目判定結(jié)果:銀染步驟如下:超純水漂洗兩遍，10%的無(wú)水乙醇漂洗1Omin ;超純水漂洗兩遍，1%的硝酸漂洗IOmin ;超純水漂洗兩遍，.0.2%的硝酸銀加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超純水漂洗兩遍,3%的氫氧化鈉加ImL甲醛漂洗直至出現(xiàn)清晰條帶；超純水漂洗兩遍，3%乙酸終止顯色；換超純水，拍照記錄分析結(jié)果; 在公雞中，條帶為64bp和16bp則為金羽純合子:ZSZS ;條帶為64bp、55bp和16bp則為銀羽雜合子=ZsZs ;條帶為55bp和16bp則為銀羽純合子:ZSZS ； 在母雞中，條帶為64bp和16bp則為金羽半合子:ZSW ;條帶為55bp和16bp則為銀羽半合子-.ZsI
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103789305SQ201410032115
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】龔炎長(zhǎng), 王瑩, 彭秀麗, 李世軍, 俸艷萍 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)