適合工業(yè)生產(chǎn)的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適合工業(yè)生產(chǎn)的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，屬于物理場輔助生物催化技術(shù)的范疇。本發(fā)明意在將蔗糖溶解于非水介質(zhì)二甲基亞砜/叔丁(戊)醇的混合溶劑中，利用超聲波輔助脂肪酶催化蔗糖與脂肪酸乙烯酯反應(yīng)生成蔗糖-6-酯。該方法是一種綠色環(huán)保、專一性強、高收率、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)迅速的適合工業(yè)生產(chǎn)的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法。
【專利說明】適合工業(yè)生產(chǎn)的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于物理場輔助生物催化的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及適合工業(yè)生產(chǎn)的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蔗糖-6-酯是制備三氯蔗糖的重要中間體。三氯蔗糖是蔗糖分子中4，I’，6’ -OH被Cl原子取代而保持其它-OH不變的一種功能甜味劑。蔗糖分子中8個-OH的氯化反應(yīng)活性順序為6，6’ >4>1’ >其他位，因此在氯化處理之前，必須首先將蔗糖分子中反應(yīng)活性較高的6-0H保護起來生成蔗糖-6-乙酸酯，再將4，1’，6’-0H進行氯化。6-0H保護是氯化反應(yīng)的關(guān)鍵前期步驟，必須采用有效的6-0H保護方法。
[0003]傳統(tǒng)上采用化學(xué)法制備蔗糖-6-酯中間體，主要有原酸酯法與有機錫催化法等。原酸酯法操作簡單，但是收率偏低；而有機錫法收率較高，但是存在操作及后處理復(fù)雜，并可能造成產(chǎn)品中重金屬超標(biāo)的風(fēng)險。目前國內(nèi)大多企業(yè)還是采用原酸酯法。
[0004]由于酶具有催化專一性強、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、安全性好等優(yōu)勢，近年來利用酶催化法制備蔗糖-6-酯越來越受到重視。
[0005]而在酶催化反應(yīng)中，不同酶的區(qū)域選擇性是不同的。經(jīng)大量的研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶、月旨肪酶、抗體酶均能用來合成蔗糖酯。蛋白酶主要表現(xiàn)了對蔗糖的I’ -OH或2-0H的選擇性，且蛋白酶通常不接受長鏈脂肪酸作為酰基供體。與蛋白酶相比，脂肪酶來源廣泛，可催化較寬范圍的脂肪酸蔗糖酯的合成，并且酰化一般發(fā)生在6-0H。最近也有研究發(fā)現(xiàn)抗體酶催化可能得到更純的蔗糖-6-酯，但仍需進一步研究。目前用于催化合成蔗糖-6-酯的酶主要指脂肪酶。
`[0006]Ferrel 等(Ferrer M, Cruces MA, Bernab ' e M, Ballesteros A, PlouFJ.Lipase-catalyzed regioselective acylation of sucrose in two-solventmixtures.Biotechnol Bioengl999; 65:10 - 16)以棕櫚酸乙烯酯做為?；噭?，在最佳反應(yīng)條件下:0.03M鹿糖、0.3M棕櫚酸乙烯酯、25mg/mL H.lanuginosa脂肪酶(吸附于娃藻土)、非水相DMSO/叔戊醇=1:4 (體積比)混合溶液作為反應(yīng)介質(zhì)；48h后蔗糖轉(zhuǎn)化率為80%，蔗糖-6-棕櫚酸酯的產(chǎn)率為51%。錢海均等(錢海均，羅旭.叔戊醇/水兩相體系脂肪酶催化合成蔗糖酯[J].浙江化工，2009，40 (12):26-30)利用游離態(tài)脂肪酶在叔戊醇/水兩相中催化蔗糖和乙酸乙烯酯合成蔗糖-6-乙酸酯，反應(yīng)24h蔗糖轉(zhuǎn)化率19.8%。羅旭等(羅旭，錢俊青.叔丁醇體系中脂肪酶催化合成蔗糖乙酸酯[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報，2010, 24 (3): 451-455)用固定化脂肪酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯反應(yīng)，24h后酯化率84.7%，但蔗糖-6-乙酸酯卻只占總酯的48.3%。王勅等(王勅，鄭璞，倪曄，等.非水介質(zhì)中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè).2010, 36(12):20-24)用脂肪酶在DMSO/叔丁醇的混合溶液中催化蔗糖和乙酸乙烯酯生成蔗糖-6-乙酸酯，9h后相應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率為77%-89%。
[0007]王勅等(王勅，鄭璞，倪曄，等.非水介質(zhì)中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36 (12):20-24)雖然相對的縮短了反應(yīng)時間、提高了蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率，但其主要問題表現(xiàn)為目的產(chǎn)物產(chǎn)率依然偏低(沒有超出化學(xué)制備法)、反應(yīng)時間偏長等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明目的:針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和不足，本發(fā)明采用一種高效、快速并且適合工業(yè)生產(chǎn)的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，以達到縮短反應(yīng)時間、提高產(chǎn)物產(chǎn)率的目的。
[0009]技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:一種超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，包括以下步驟:
[0010]I)將干燥后蔗糖溶解于非水相二甲基亞砜與叔丁醇或叔戊醇的混合溶劑中，二甲基亞砜與叔丁醇或叔戊醇的體積比為1:3-9，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速100-3001./min,恒溫20°C _60°C至鹿糖完全溶解；然后加脂肪酶lO-lOOmg/mL,恒溫振蕩10_30min ;再加入脂肪酸乙烯酯，利用超聲輔助酶催化，控制水域溫度20-60°C，反應(yīng)0.5-10h后記錄轉(zhuǎn)化率；
[0011]2)反應(yīng)結(jié)束后將脂肪酶從混合物中離心分離，然后用叔丁醇或叔戊醇清洗、真空干燥備用；
[0012]3)反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯。
[0013]其中，上述脂肪酸乙烯酯為乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯中的一種。
`[0014]其中，上述脂肪酸乙烯酯與蔗糖的摩爾比為1:2-15。
[0015]其中，上述脂肪酶為Lipozyme TL IM、Lipozyme TL100L 和 Lipozyme RM IM 中的一種。
[0016]其中，上述超聲輔助酶催化的方式為對酶進行超聲預(yù)處理后再置于反應(yīng)介質(zhì)中進行酶催化反應(yīng)或者直接對反應(yīng)介質(zhì)中的酶進行超聲處理，即超聲處理與酶催化反應(yīng)同時進行。
[0017]其中，上述對酶進行超聲預(yù)處理的超聲波聲強為0.01-lW/cm2，優(yōu)選0.1-0.5 W/cm2 ;超聲頻率IO-1OOkHz，優(yōu)選30_50kHz ;超聲預(yù)處理酶的時間為30s_100min，優(yōu)選10-40min。上述對酶進行超聲預(yù)處理也稱為超聲波輻射預(yù)處理。
[0018]其中，上述直接對反應(yīng)介質(zhì)中的酶進行超聲的超聲波聲強為0.01-lW/cm2，優(yōu)選0.1-0.7ff/cm2 ;超聲頻率IO-1OOkHz，優(yōu)選20-50kHz，以防改變酶催化的專一性，甚至導(dǎo)致酶失活。上述直接對反應(yīng)介質(zhì)中的酶進行超聲也稱為超聲波在線輔助酶催化。
[0019]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明適合工業(yè)生產(chǎn)的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法具有反應(yīng)迅速，并可得到高產(chǎn)率、高純度的蔗糖-6-酯，而且固定化酶可反復(fù)多次使用，從而有效解決了副產(chǎn)物多、反應(yīng)耗時等問題。本發(fā)明采用適合工業(yè)生產(chǎn)的超聲波輔助酶催化蔗糖和脂肪酸乙烯酯合成蔗糖-6-酯，不僅沒有改變酶的區(qū)域選擇性，而且還使反應(yīng)時間大幅度縮短、產(chǎn)物產(chǎn)率得到有效提高。
【專利附圖】

【附圖說明】圖1是蔗糖-6-乙酸酯的高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。
[0021]高效液相色譜(HPLC)分析條件:島津LC-10AT型高效液相色譜儀:LC_10AT高壓輸送泵，色譜柱 Supelcosil?LC-18 (250X4.6mm, 5um)，柱溫 30 °C ;檢測器=RID-1OA ;連接器=CBM-1OA VP PLUS ;流動相:乙腈 / 水=6/1 (V/V);進樣量:20 μ L，流速 0.8mL/min。
[0022]實施例1:
[0023]在IOOmL的的三口燒瓶中加入1.2g已研磨的蔗糖于真空干燥箱中60°C干燥24h以上，先加入IOmLDMSO (利用無水硫酸鈉在33°C以下除水)，攪拌，緩慢升溫到60°C至蔗糖完全溶解后停止加熱，再加入40mL叔丁醇(提前用無水硫酸鎂除水)，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速300r/min，恒溫60°C至蔗糖完全溶解，待溫度降至30°C后加入4.0g固定化脂肪酶TUM，在相應(yīng)溫度振蕩IOmin (約200r/min)，然后緩慢加入乙酸乙烯酯4.5mL (提前用無水硫酸鎂除水)，利用0.4W/cm2、40kHz的超聲波在線輔助酶催化，保證溫度在30_40°C之間。反應(yīng)3h后，經(jīng)離心、旋蒸后得淡黃色液體。HPLC分析得蔗糖轉(zhuǎn)化率約為98.2%，蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率約95.5%。如圖1所示，其中蔗糖的出峰時間為4.491min，蔗糖-6-乙酸酯的出峰時間為6.40 Imin。
[0024]實施例2: [0025]在IOOmL的的三口燒瓶中加入1.0g已研磨的蔗糖，先加入IOmLDMSO,攪拌，緩慢升溫到60°C至蔗糖完全溶解后停止加熱，再加入50mL叔丁醇，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速100r/min，恒溫40°C至蔗糖完全溶解，待溫度降至30°C后加入4.0g固定化脂肪酶TUM，此酶已用0.2W/cm2、45kHz的超聲波福射預(yù)處理30min ;在相應(yīng)溫度下振蕩IOmin (約200r/min)，然后緩慢加入丁酸乙烯酯4.5mL，保證溫度在30_40°C之間。反應(yīng)3h后，經(jīng)離心、旋蒸后得淡黃色液體。HPLC分析得蔗糖轉(zhuǎn)化率約為92.3%，蔗糖-6- 丁酸酯的產(chǎn)率約92.8%。
[0026]實施例3:
[0027]將干燥后蔗糖溶解于非水相二甲基亞砜與叔戊醇的混合溶劑中，二甲基亞砜與叔戊醇的體積比為1:3，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速200r/min，恒溫20°C至蔗糖完全溶解；然后加脂肪酶TL100L10mg/mL，恒溫振蕩30min ;再加入辛酸乙烯酯，使得辛酸乙烯酯與蔗糖的摩爾比為1:2，利用0.7ff/cm2,50kHz的超聲波在線輔助酶催化，控制水域溫度20°C，反應(yīng)IOh后記錄轉(zhuǎn)化率；反應(yīng)結(jié)束后，加熱到80°C使脂肪酶TL100L失活，從而離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯。HPLC分析得蔗糖-6-辛酸酯的產(chǎn)率約為92.3%。實施例4:
[0028]將干燥后蔗糖溶解于非水相二甲基亞砜與叔丁醇的混合溶劑中，二甲基亞砜與叔戊醇的體積比為1:9，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速300r/min，恒溫50°C至蔗糖完全溶解；然后加脂肪酶RM M100mg/mL，此酶已用0.5W/cm2、30kHz的超聲波輻射預(yù)處理40min ；再加入辛酸乙烯酯，使得辛酸乙烯酯與蔗糖的摩爾比為1:15，控制水域溫度301:，反應(yīng)
0.5h后記錄轉(zhuǎn)化率；反應(yīng)結(jié)束后，離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯。HPLC分析得蔗糖-6-辛酸酯的產(chǎn)率約91.7%。
[0029]實施例5:[0030]將干燥后蔗糖溶解于非水相二甲基亞砜與叔丁醇的混合溶劑中，二甲基亞砜與叔戊醇的體積比為1:6，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速300r/min，恒溫50°C至蔗糖完全溶解；然后加脂肪酶RM M100mg/mL，此酶已用0.lW/cm2、IOOkHz的超聲波輻射預(yù)處理30s ;再加入癸酸乙烯酯，使得癸酸乙烯酯與蔗糖的摩爾比為1:6，控制水域溫度30°C，反應(yīng)6h后記錄轉(zhuǎn)化率；反應(yīng)結(jié)束后，離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯。HPLC分析得蔗糖-6-癸酸酯的產(chǎn)率約為91.8%。
[0031]實施例6:
[0032]將干燥后蔗糖溶解于非水相二甲基亞砜與叔戊醇的混合溶劑中，二甲基亞砜與叔戊醇的體積比為1:3，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速2001'/1^11，恒溫401:至蔗糖完全溶解；然后加脂肪酶TL100L30mg/mL,恒溫振蕩30min ;再加入月桂酸乙烯酯，使得月桂酸乙烯酯與蔗糖的摩爾比為1:8，利用lW/cm2、100kHz的超聲波在線輔助酶催化，控制水域溫度200C，反應(yīng)2h后記錄轉(zhuǎn)化率；反應(yīng)結(jié)束后，加熱到80°C使脂肪酶TLlOOL失活，從而離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯。HPLC分析得蔗糖-6-月桂酸酯的產(chǎn)率約90.6%。
[0033]實施例7:
[0034]按實施例2的方法，在IOOL的反應(yīng)釜中加入1.6kg蔗糖、80LDMS0/叔丁醇=1:4(體積比)的混合溶液、7.2L乙酸乙烯酯、6.4kg固定化脂肪酶TUM，利用0.2ff/cm2,45kHz的超聲輻射預(yù)處理酶30min。反應(yīng)3.5h后，經(jīng)HPLC分析得蔗糖_6_乙酸酯的產(chǎn)率約94.8%。
[0035]實施例8:
[0036]按實施例1的方法，在50L的反應(yīng)釜中加入0.8kg蔗糖、40LDMS0/叔丁醇=1:9 (體積比)的混合溶液、3.6L乙酸乙烯酯、3.2kg固定化脂肪酶TUM，利用0.4ff/cm2,40kHz的超聲波在線輔助酶催化反應(yīng)3.5h。經(jīng)HPLC分析`得蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率約96.1%。
【權(quán)利要求】
1.一種超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將干燥后蔗糖溶解于非水相二甲基亞砜與叔丁醇或叔戊醇的混合溶劑中，二甲基亞砜與叔丁醇或叔戊醇的體積比為1:3-9，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速100-300r/min，恒溫20°C _60°C至蔗糖完全溶解；然后加脂肪酶lO-lOOmg/mL，恒溫振蕩10_30min ;再加入脂肪酸乙烯酯，利用超聲輔助酶催化，控制水域溫度20-60°C，反應(yīng)0.5-10h后記錄轉(zhuǎn)化率； 2)反應(yīng)結(jié)束后將固定化脂肪酶從混合物中離心分離，然后用叔丁醇或叔戊醇清洗、真空干燥備用；游離脂肪酶加熱使其失活后離心除去； 3)反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酸乙烯酯為乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯或油酸乙烯酯中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酸乙烯酯與蔗糖的摩爾比為1:2-15。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酶為 Lipozyme TL IM、Lipozyme TLlOOL 和 Lipozyme RM IM 中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述超聲輔助酶催化的方式為對酶進行超聲預(yù)處理后再置于反應(yīng)介質(zhì)中進行酶催化反應(yīng)或者直接對反應(yīng)介質(zhì)中的酶進行超聲處理，即超聲處理與酶催化反應(yīng)同時進行。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述對酶進行超聲預(yù)處理的超聲波聲強為0.01-lW/cm2，超聲頻率IO-1OOkHz,超聲預(yù)處理酶的時間為 30s-100min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的超聲波輔助酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，直接對反應(yīng)介質(zhì)中的酶進行超聲的超聲波聲強為0.01-lW/cm2，超聲頻率IO-1OOkHz。
【文檔編號】C12P19/12GK103805653SQ201410017910
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】朱國廷, 吳金山, 沈彬, 申桂賢 申請人:鹽城捷康三氯蔗糖制造有限公司