免疫增強的人乳頭瘤病毒感染及相關(guān)疾病的治療性疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種免疫增強的人乳頭瘤病毒感染及相關(guān)疾病的治療性疫苗，其包括基于重組腺病毒的基因載體。為了獲得針對HPV的協(xié)同免疫增強效果，該類治療性疫苗含有三個關(guān)鍵元素：1）有效表達HPV病毒抗原，包含HPV16型和18型的E6、E7多價融合蛋白；2）有效表達與前述抗原蛋白融合的免疫佐劑蛋白，包含結(jié)核桿菌的熱休克蛋白（HSP）；3）同時表達免疫刺激因子，包含粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF。該疫苗通過對小鼠體內(nèi)含HPV抗原的腫瘤治療實驗表明，能有效增強免疫反應并清除腫瘤。本發(fā)明展示了HSP融合蛋白與GM-CSF對HPV抗原的協(xié)同免疫刺激作用，為宮頸癌及其它HPV感染所致疾病的治療性疫苗提供了新的方法。
【專利說明】免疫增強的人乳頭瘤病毒感染及相關(guān)疾病的治療性疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種人乳頭瘤病毒持續(xù)性感染及其所誘發(fā)的宮頸癌及其它病變的治療性疫苗，更具體的，涉及含有免疫增強劑的人乳頭瘤病毒治療性疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性第二大高發(fā)癌癥，每年約274，000患者死于該病。所有的宮頸癌均可檢出HPV感染。此外，肛門、陰道、陰莖癌及某些口腔癌及喉癌也與HPV感染有關(guān)。雖然目前已經(jīng)有兩種預防性疫苗投放市場，但其對已存在的HPV感染并無任何治療效果，更無法阻斷病變惡性化進程。并且，據(jù)估算現(xiàn)已被HPV感染的病人基數(shù)很大，所以通過大規(guī)模接種預防性疫苗達到減少宮頸癌發(fā)病率，至少需要20年后才能明顯見效。由于已有大量人群感染病毒甚至已發(fā)生宮頸癌或癌前病變，因此以清除已被感染的細胞和癌細胞為目的的治療性疫苗的研發(fā)非常迫切。人乳頭瘤病毒E6和E7蛋白是HPV病毒攜帶的二個致癌基因所編碼的癌蛋白，屬非自體的外源蛋白抗原，從癌前病變到宮頸癌發(fā)生它們都持續(xù)穩(wěn)定表達，因此是非常理想的免疫治療靶點。大量臨床研究都試圖以這兩種癌蛋白為靶點，包括重組病毒、多肽、蛋白和DNA疫苗。這些治療性疫苗都顯示了很好的安全性，在某些病人身上也出現(xiàn)了病灶的消退和生存期延長。此外，研究表明疫苗免疫所誘發(fā)的T細胞免疫強度與治療治療效果有關(guān)。盡管某些臨床研究已經(jīng)出現(xiàn)希望，但如果想徹底治愈持續(xù)感染和清除癌癥，還需要新的策略來誘導足以強大的抗腫瘤特異性抗原的T細胞免疫反應。
[0003]熱休克蛋白(HSP)可以有效地調(diào)節(jié)細胞功能，增強免疫反應。首先，它可以作為“分子伴侶”起作用，幫助蛋白運輸定位和輔助蛋白折疊。其次，它可以活化專職抗原遞呈細胞(APC)，而HSP70可以與巨噬細胞上的受體結(jié)合，從而有效激活其免疫反應。SGN-00101是一種融合有HPV16 型E7蛋白和結(jié)核桿菌的HSP65的融合蛋白，其已經(jīng)表現(xiàn)出了良好的安全性，并且對抑制宮頸上皮細胞的高度不典型增生有一定效果。
[0004]粒-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)是已被廣泛研究并被認為是最有效的免疫治療因子之一。它可以介導自然殺傷細胞和通過抗原提呈細胞來活化腫瘤特異的CD8+殺傷性T淋巴細胞，從而起到抗腫瘤作用。諸多動物和臨床試驗已經(jīng)證實其可以長期有效激發(fā)腫瘤抑制免疫反應。例如，Sipuleucel-T作為一種免疫治療藥物，就是利用了 GM-CSF活化抗原遞呈細胞的特點，現(xiàn)在已經(jīng)被美國食品藥品安全管理局批準上市。Jennerex等人的最新臨床研究也表明表達有GM-CSF的融癌痘苗病毒可以減小多種癌癥病灶。但這些增強免疫的方法其療效都不理想，要么缺乏腫瘤抗原特異性，要么免疫刺激強度欠佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種免疫增強的人乳頭瘤病毒感染及相關(guān)疾病的治療性疫苗。
[0006]首先，本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒及免疫增強分子五基因型融合抗原，其含有人乳頭瘤病毒16型的E6、E7蛋白和人乳頭瘤病毒18型的E6、E7蛋白及免疫增強分子佐劑蛋白。
[0007]本發(fā)明采用多價抗原線性排列的方式，對融合蛋白的T細胞表位未有影響。在治療疫苗中起中心作用的是T細胞免疫反應，而T細胞抗原決定簇在遞呈過程中被降解成線性短肽，而識別位點一般僅有大約8個氨基酸，所以各種抗原排列順序也對免疫激發(fā)沒有實質(zhì)影響。本發(fā)明我們?nèi)诤狭?HPV16及18型的4抗原蛋白與熱休克蛋白分子，融合更多HPV抗原有更大的優(yōu)勢:可以提供更多的潛在抗原決定簇，增強抗原的遞呈及增加免疫反應，對更多不同基因型的HPV感染起作用。從而有效的提高潛在的疫苗免疫的受益人群；并且更大的蛋白更容易被降解提成，從而激發(fā)更強的免疫反應。
[0008]在本發(fā)明一個實施方案中，所述的融合抗原具有下述一或多個突變位點，其中，所述的人乳頭瘤病毒16型E6蛋白的突變位點為:121位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?22位的賴氨酸突變?yōu)楦拾彼?；所述的人乳頭瘤病毒16型E7蛋白的突變位點為:24位的半胱氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?6位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔凰龅娜巳轭^瘤病毒18型E6蛋白的突變位點為:116位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?17位的賴氨酸突變?yōu)楦拾彼?；所述的人乳頭瘤病毒18型E7蛋白的突變位點為:27位的半胱氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?9位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼帷?br> [0009]本發(fā)明對HPV E6蛋白中與細胞p53蛋白的結(jié)合區(qū)域進行了氨基酸的點突變，同時也對E7蛋白中與細胞pRb蛋白的結(jié)合區(qū)域進行了氨基酸的點突變。突變后的蛋白將不再與上述兩種蛋白特異結(jié)合，從而消除HPV E6及E7蛋白的潛在轉(zhuǎn)化正常細胞的風險。需要說明的是，本發(fā)明僅在幾處關(guān)鍵位點進行了點突變，對融合蛋白的抗原性未有影響。
[0010]其中，所述的免疫增強分子佐劑蛋白為原核生物或哺乳動物熱休克蛋白，優(yōu)選為結(jié)核桿菌的熱休克蛋白。
[0011]在本發(fā)明一個具體的實施方案中，人乳頭瘤病毒及免疫增強分子五基因型融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0012]進一步地，本發(fā)明提供一種表達所述的含有所述融合抗原的重組基因表達載體。
[0013]在本發(fā)明一個實施方案中，所述的載體優(yōu)選還可以同時攜帶免疫刺激因子的表達盒。
[0014]優(yōu)選的，所述的免疫刺激因子為粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干擾素或細胞趨化因子，優(yōu)選為粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF。
[0015]在本發(fā)明一個具體的實施方案中，所述的表達載體攜帶核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示的DNA片段。
[0016]其中，所述載體可為重組腺病毒載體(adenoviral vector)，亦可為重組腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated viral vector)、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retroviral vector)、重組慢病毒載體(lentiviral vector)、重組皰疫病毒載體(Herpes viral vector)、重組痘苗病毒載體(Vaccinia vector)或者重組仙臺病毒載體(Sandai viral vector);也可為非病毒載體，所述非病毒載體選自裸DNA載體、納米顆粒，多聚物或脂質(zhì)體。
[0017]進一步地，本發(fā)明還提供一種治療人乳頭瘤病毒感染引起的疾病的藥物制劑，其包含治療有效量的所述的融合抗原，或包含治療有效量的所述的重組基因表達載體。
[0018]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的藥物制劑包含治療有效量的所述的融合抗原以及免疫刺激因子。
[0019]其中，所述的免疫刺激因子為粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干擾素或細胞趨化因子，優(yōu)選為粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF。
[0020]在本發(fā)明一個具體的實施方案中，所述藥物制劑所表達的抗原為所述人乳頭瘤病毒16型18型的E6、E7多基因型融合抗原，所表達的免疫增強分子佐劑為結(jié)核桿菌的熱休克蛋白并與前述多價融合蛋白再融合，所表達的免疫刺激因子為粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF。
[0021]在本發(fā)明另一個具體的實施方案中，所述的藥物制劑還可以含有藥學可接受的載體、賦形劑、輔料等。
[0022]在本發(fā)明一個具體的實施方案中，該藥物制劑可作為疫苗直接一次性注射或一次以上的加強免疫注射到病人體內(nèi)，以達到刺激和增強免疫的效果。也作為一種抗原，間接用于處理和孵育體外病人自體細胞或供體細胞，包括淋巴細胞、樹突狀細胞、腫瘤細胞、臍帶血細胞等。再分一次性或多次性注射到病人體內(nèi)，以達到刺激和增強免疫的效果。
[0023]進一步地，本發(fā)明提供一種重組腺病毒，其攜帶所述的重組基因表達載體。
[0024]在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述的重組腺病毒表達人乳頭瘤病毒16型18型的E6、E7，以及粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF。
[0025]在本發(fā)明另一個具體實施方案中，所述的重組腺病毒優(yōu)選表達人乳頭瘤病毒16型18型的E6、E7蛋白和結(jié)核桿菌的熱休克蛋白，以及粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF。
[0026]其中， 所述的人乳頭瘤病毒16型18型的E6、E7蛋白與結(jié)核桿菌熱休克蛋白融合生成的多價融合蛋白。該融合蛋白表達盒與GM-CSF表達合在同一載體上共表達。
[0027]其中，所述的人乳頭瘤病毒16型18型的E6、E7蛋白為多價融合蛋白，該蛋白可不與熱休克蛋白融合。該融合蛋白表達盒與GM-CSF表達盒在同一載體上共表達。
[0028]進一步地，本發(fā)明還提供所述的融合抗原、所述的重組基因載體、所述的腺病毒、所述的藥物制劑在制備治療人乳頭瘤病毒感染引起的疾病的藥物中的應用。
[0029]所述的人乳頭瘤病毒感染引起的疾病屬于與HPV慢性感染相關(guān)的疾病，優(yōu)選宮頸癌、陰莖癌、肛門癌、喉癌、口腔癌、頭頸部癌、宮頸癌前病變和/或?qū)m頸增生。
[0030]體外T淋巴細胞激活實驗結(jié)果表明，表達有HPV抗原HSP融合蛋白的載體，與共表達HPV抗原與GM-CSF的載體均能誘導比單純表達HPV抗原的載體強的T細胞免疫反應。而同時表達HPV抗原HSP融合蛋白與GM-CSF的載體誘導的T細胞免疫反應最強。此外，GM-CSF的表達可以顯著提高低劑量組的T細胞免疫水平，并誘導更多的腫瘤浸潤T細胞。在小鼠體內(nèi)的表達HPV抗原的腫瘤治療實驗中，對各組小鼠腫瘤發(fā)生率和腫瘤發(fā)生大小的評估結(jié)果顯示，融合有HSP的載體與表達GM-CSF的載體具有更好的腫瘤清除和抑制再生作用。而同時表達HPV抗原與HSP的融合蛋白和GM-CSF的載體的作用最強，其結(jié)果與體外實驗的結(jié)果一致。因此，本發(fā)明首次展示了 HSP融合蛋白與GM-CSF的協(xié)同免疫刺激作用，為增強宮頸癌治療疫苗效果提供了新的方法。
[0031]依據(jù)現(xiàn)有在小鼠體內(nèi)的實驗結(jié)果，可以預見此種疫苗在人體內(nèi)也能以同樣的機制來激活對HPV病毒所表達抗原的特異性免疫反應，從而激發(fā)和強化特異性免疫細胞如T細胞對人乳頭瘤病毒感染細胞及宮頸癌細胞的強大殺傷作用。鑒于此類疫苗所誘導的免疫反應是針對HPV病毒的二個關(guān)鍵癌蛋白，即E6和E7這二個長期表達并誘發(fā)被感染細胞慢性增生，最終導致癌變的二個癌抗原蛋白，因此此類疫苗可用于治療HPV慢性感染所致的宮頸癌，宮頸癌前病變，宮頸增生以及其它與HPV慢性感染所致癌癥如某些喉癌及口腔癌等坐寸O
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1.重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定a.利用Ad-easy系統(tǒng)制備相應重組腺病毒的5種cDNA結(jié)構(gòu)模式圖。b.Western blot檢測重組腺病毒載體在HEK293細胞中的表達。腺病毒感染HEK293細胞，利用抗HPV16E7抗體檢測外源基因表達。Ad-GFP作為陰性對照。c.Western blot檢測相應的重組腺病毒在HEK293細胞中的GM-CSF表達。d.重組腺病毒Ad-E6E7hsp-GM表達的HPV18/16E6E7HSP融合蛋白在進行密碼子優(yōu)化后表達量較優(yōu)化前有明顯增加。
[0033]圖2.T淋巴細胞增生實驗。在E7多肽刺激下，相應重組腺病毒免疫小鼠脾細胞增生倍數(shù)。縱坐標為相對增生倍數(shù)，為E7多肽刺激脾細胞0.D.值比上未有E7多肽刺激脾細胞 0.D.值。n=3;bars, SE;星號表示 p〈0.05。
[0034]圖3.ELISP0T實驗。A.在E6多肽刺激下，相應重組腺病毒免疫小鼠IFN Y分泌脾細胞數(shù)。B.在E7多肽刺激下，相應重組腺病毒免疫小鼠IFNy分泌脾細胞數(shù)?？v坐標，每IO6脾細胞中的斑點形成細胞數(shù)量。n=3;bars，SE;星號表示p〈0.05。
[0035]圖4.腫瘤浸潤的T淋巴細胞。重組腺病毒免疫可增加腫瘤浸潤的⑶8+和⑶4+T細胞數(shù)量?？v坐標為每個視野下CD4+或CD8+T淋巴細胞數(shù)量，經(jīng)4個視野計數(shù)后的平均值。bars, SE;星號代表與對照Ad-GFP相比ρ〈0.05。
[0036]圖5.重組腺病毒載體劑量實驗。3種劑量相應的重組腺病毒分別免疫小鼠，進行ELISP0T實驗，對IFNy分泌脾細胞數(shù)量進行對比。n=3;bars，SE。
【具體實施方式】
[0037]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0038]實施例1質(zhì)粒構(gòu)建與病毒包裝
[0039]以 HPV18 型 E6 (Genbank access number:AF373109)、E7 (AF373110)及 HPV16型E6 (AB818691)、E7 (KC736931)和結(jié)核桿菌HSP (EU747334)基因為模本，以人的表達適應性進行密碼子優(yōu)化，并去除中間的終止密碼子，依次拼接成一個融合基因開放讀碼框，由Genescript公司全序列合成。為了消除E6、E7的細胞惡變轉(zhuǎn)化威脅，在HPV18及16的E6和E7蛋白的重要位點進行了點突變:18型E6蛋白(Glull6Gly;Lysll7Gly) ; 16型 E6 蛋 S (Glul21Gly;Lysl22Gly) ; 18 型 E7 蛋 S (Cys27Gly;Glu29Gly) ；E7 蛋白(Cys24Gly;Glu26Gly)0 HPV18&16/E6/E7 的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1 所示，HPV18&16/E6/E7HSP的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。人源GM-CSF基因cDNA通過RT-PCR擴增獲得(SEQ ID N0.4)。
[0040]Ad-Easy 腺病毒包裝系統(tǒng)(購自 Agilent Technologies, SantaClara, California)用于生產(chǎn)5型重組腺病毒。首先，5種插入不同基因的帶有CMV啟動子的pshuttle質(zhì)粒被構(gòu)建出來:(l)pshuttle-E6E7 表達 HPV16E6 和 E7 融合蛋白；(2) pshuttle-E6E7hsp表達HPV16E6和E7及hsp融合蛋白；(3) pshuttle-E6E7_GM在前一種的基礎(chǔ)上共表達人源 GM-CSF ；(4) pshuttle-E6E7hsp-GM 共表達 HPV18/16E6 和 E7 及 hsp 融合蛋白及人源GM-CSF ；(5)pshuttle-GFP表達eGFP作為對照(圖la)。之后，按照常規(guī)方法，5種重組腺病毒被包裝出來，分別為 Ad-E6E7，Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7_GM，Ad_E6E7hsp-GM 和 Ad-GFP。
[0041]實施例2重組外源蛋白表達檢測
[0042]將實施例1制備的包裝重組腺病毒感染人胚腎細胞293 (HEK293)細胞系購于美國典型生物儲存中心(ATCC，Rockville, MD)，感染滴度為兩個噬斑形成單位(pfu) /細胞。感染2天后，PBS清洗2次，然后用Laemmli裂解緩沖液裂解細胞，將總細胞蛋白通過煮沸5分鐘變性，進行SDS電泳，再將蛋白電轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜，并用相應的抗體進行檢測:抗 HPV16E7 蛋白抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)和抗 GM-CSF 抗體(Biolegend, San Diego, CA)。顯色使用增強的化學發(fā)光系統(tǒng)(ECL)。GM-CSF的ELISA檢測試劑盒(Biolegend, San Diego, CA)被用來檢測小鼠體內(nèi)的GM-CSF濃度。
[0043]五種重組腺病毒按照標準方法進行制備并經(jīng)過兩次超速離心純化。通過Western-Blots的方法，檢測感染有重組病毒的293細胞上的外源基因表達。結(jié)果顯示在預期分子量條帶位置檢測出表達條帶，而在Ad-GFP感染的陰性對照樣品中相應位置沒有條帶(圖lb，c)。此結(jié)果表明HPV抗原相關(guān)的融合蛋白與GM-CSF得到了高效的表達。小鼠血清GM-CSF濃度經(jīng)ELISA檢測結(jié)果顯示其濃度在注射5天后較對照組增高大約7倍，2個月后大約仍有1.5倍增高。
[0044]密碼子優(yōu)化后顯著提高了 HPV抗原的表達效率，表達量與優(yōu)化前相比提高3倍以上(圖1d)。
[0045]實施例3體外淋巴細胞增殖實驗和ELISP0T實驗
[0046]雌性的 C57BL/6 小鼠(H_2b;6 - 8 周齡)購于 Jackson Lab (BarHarbor, MA)通過皮下注射 107pfu/ 只鼠的 Ad-E6E7, Ad_E6E7hsp，Ad-E6E7_GM、Ad_E6E7hsp-GM 和 Ad-GFP 病毒。4周后，分離培養(yǎng)小鼠脾細胞(I X IO5/孔)，每只小鼠的脾細胞分別與或不與10 μ g/ml的E7多肽共孵育5天。在第四天時加入BrdU。融合入細胞的BrdU含量通過Calbiochem細胞增殖試劑盒檢測(Millipore，Billerica, MA)。檢測結(jié)果表示為相對增殖倍數(shù)，其為含有E7多肽的0.D.讀值與不含有E7多肽的0.D.讀值通過對比換算而來。
[0047]進行ELISP0T實驗通過特異針對E6和E7多肽的干擾素IFN Y分泌型T淋巴細胞計數(shù)，評估T細胞免疫反應。首先，雌性C57BL/6小鼠按上述方面免疫接種重組病毒。2-4周后，小鼠脾細胞在96孔板內(nèi)分離培養(yǎng)，數(shù)量為IX IO5細胞/孔。每只小鼠培養(yǎng)細胞分別分為E6多肽刺激和E7多肽刺激組，分別刺激以2 μ g E648_57 (EVYDFAFRDL, H_2Db - restricted)多肽和E749_57 (RAHYNIVTF, H-2Db - restricted)多肽，未經(jīng)多肽刺激的細胞為陰性對照。在37°C孵育24小時。之后，丟棄細胞，并用含0.5%吐溫20的PBS (PBST)清洗3遍。再孵育以抗IFNy的酶標抗體,最后通過ACE底物顯色。顯色終止干燥后，IFN Y反應斑點通過ELISP0T計數(shù)儀計數(shù)，并進行分析。
[0048]通過T細胞增殖實驗和ELISP0T實驗結(jié)果可以在體外檢測抗原特異性的T細胞免疫反應。在細胞增殖實驗中，第五天相對細胞數(shù)量可以通過摻入細胞DNA的BrdU含量表現(xiàn)出來。所有接種有表達HPV抗原重組病毒的小鼠脾細胞在E7特異性多肽的刺激下增生顯著高于陰性對照的Ad-GFP免疫的小鼠脾細胞(圖2)。重組病毒Ad-E6E7hsp和Ad-E6E7_GM免疫的小鼠脾細胞比Ad-E67接種小鼠脾細胞的增殖倍數(shù)更高，并且，Ad-E6E7hsp-GM免疫小鼠獲得了最高的增殖。ELISP0T實驗結(jié)果可以顯示抗原特異性的殺傷性T細胞免疫反應強度。結(jié)果顯示，在E6多肽的刺激下，所有表達HPV抗原重組病毒免疫小鼠都獲得了抗原特異性的殺傷性T細胞免疫反應。具體表現(xiàn)為，Ad-E6E7hsp，Ad-E6E7-GM和Ad_E6E7hsp-GM免疫小鼠的IFN Y分泌型脾細胞數(shù)量遠高于Ad-E6E7接種小鼠，并且，Ad_E6E7hsp-GM免疫小鼠具有最高的IFNy分泌型脾細胞數(shù)量(圖3A)。在E7多肽刺激下，IFNy分泌型脾細胞分布的相對結(jié)果與E6多肽刺激的結(jié)果類似，只是每組的絕對數(shù)值遠高于E6多肽的刺激。這表明，在小鼠中E7多肽激發(fā)的殺傷性T細胞免疫反應也遠高于E6多肽激發(fā)的強度(圖3B)。綜上所述，T細胞增殖實驗和ELISPOT實驗的結(jié)果比較一致地反映出HSP和GM-CSF分別可以單獨或協(xié)同增強E6E7抗原特異性的T淋巴細胞免疫反應。
[0049]實施例4腫瘤浸潤T淋巴細胞分析
[0050]C57BL/6小鼠接種TC-1細胞(轉(zhuǎn)化有HPV16型E6和E7癌抗原的C57BL/6小鼠腫瘤細胞，是一種最常用的宮頸癌模型用細胞系，受贈于T.C.Wu教授Johns HopkinsUniversity)。C57BL/6小鼠TC-1細胞生長于含有10%胎牛血清(FBS)和50U/ml雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)基，其它細胞生長于DMEM完全培養(yǎng)基(Gibco)，待皮下腫瘤長至約5毫米直徑，再分別皮下免疫接種 I X IO7 的 Ad-E6E7，Ad_E6E7hsp，Ad-E6E7_GM，Ad_E6E7hsp-GM和Ad-GFP重組腺病毒。7天后收集腫瘤進行H&E染色和抗⑶4+和⑶8+細胞的免疫熒光分析。具體步驟如下，取出的腫瘤組織經(jīng)過冰凍，OCT包埋，切割為5.0ym厚的切片，經(jīng)4%丙酮固定后10%馬血清封閉30分鐘。后于室將其溫孵育抗小鼠⑶4及⑶8抗體(BD Bioscience, San Jose, CA) I 小時，經(jīng) PBS 清洗后與 2mg/mL 羊抗大鼠的二抗 Alexa647(Invitrogen, Carlsbad, CA)孵育,后經(jīng)DAPI染核,和顯微鏡分析。計數(shù)4個視野下的陽性細胞數(shù)，以均數(shù)土標準誤標記并進行統(tǒng)計分析。
[0051]當荷瘤小鼠腫瘤直徑達到5mm左右時， 小鼠接受不同重組腺病毒免疫治療，7天后將腫瘤取出做組織學分析，評價不同病毒免疫的小鼠腫瘤T淋巴細胞浸潤程度。CD8+細胞染色結(jié)果顯示，接受表達HPV抗原的重組病毒小鼠其腫瘤組織內(nèi)較接受Ad-GFP免疫的陰性對照小鼠有更多的⑶8+T淋巴細胞浸潤(圖4)。而融合HSP的融合蛋白與GM-CSF分別表達或共表達的載體均可以顯著增強荷瘤小鼠⑶8+T淋巴細胞浸潤(圖4)。⑶4+細胞染色結(jié)果顯示，接受有GM-CSF表達的重組腺病毒免疫小鼠的腫瘤組織中⑶4+T淋巴細胞浸潤數(shù)量顯著增多。然而，接受HSP融合蛋白表達的小鼠，其腫瘤組織中表達⑶4+T細胞數(shù)量并未比Ad-E6E7和Ad-GFP免疫小鼠有顯著增多，雖然HSP能顯著增加⑶8+T淋巴細胞浸潤(圖4)。
[0052]實施例5重組腺病毒免疫劑量實驗
[0053]三種劑量的Ad-E6E7，Ad_E6E7hsp，Ad-E6E7_GM，Ad_E6E7hsp-GM 和 Ad-GFP 分別用來免疫小鼠，劑量為2 X IO5,1 X IO6和I X 107pfu/只。免疫四周后小鼠被處死，收集脾細胞進行ELISPOT實驗。通過對各種重組腺病毒不同劑量免疫小鼠的脾細胞IFNy反應斑點進行讀取分析，判定不同劑量誘導的T細胞免疫強度。
[0054]為了判定不同重組病毒在不同劑量下激發(fā)T細胞免疫反應能力，我們進行了劑量實驗。在2X IO5和IXlO6Pfu/只的低劑量條件下，依據(jù)IFNy分泌細胞數(shù)量，重組病毒Ad-E6E7-GM和Ad-E6E7hsp-GM誘發(fā)較其他種類病毒較強的T細胞免疫反應，并且Ad-E6E7hsp-GM誘導最強的T細胞免疫反應。在I X 107pfu/只的高劑量條件下，所有表達HPV抗原的重組病毒都能有效的激發(fā)免疫反應。有趣的是，Ad-E6E7hsp重組病毒免疫小鼠較Ad-E6E7-GM免疫小鼠有更多數(shù)量的IFN Y分泌性脾細胞。而Ad_E6E7hsp-GM免疫組仍然擁有最多數(shù)量的IFNy分泌性脾細胞(圖5)。此結(jié)果表明，GM-CSF的表達可以有效增強低劑量組的T細胞免疫反應，而HSP融合蛋白則在高劑量情況下起更好的作用。如果二者同時表達則可獲得協(xié)同效應。
[0055]GM-CSF增強低劑量殺傷性T淋巴細胞免疫反應，可以使用較低劑量取得較好的免疫效果，降低可能的副反應。
[0056]實施例6小鼠體內(nèi)腫瘤治療實驗
[0057]本實驗為評價重組腺病毒治療效果最為重要的實驗。首先，受試小鼠均在皮下接種I X IO5/只的TC-1細胞，大約9天左右，小鼠皮下形成可觸及腫瘤包塊，隨后皮下注射 Ad-E6E7，Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7_GM，Ad_E6E7hsp-GM 和 Ad-GFP，劑量分別采用 I X IO6 和I X 107pfu/K ο初次治療2周后，再以相同劑量加強免疫。初次治療2個月后，所有腫瘤被清除的小鼠再次以相同TC-1細胞接種。每3天對小鼠的腫瘤觀察一次，持續(xù)4個月。通過對不同重組病毒接種小鼠的腫瘤發(fā)生率和腫瘤體積進行對比，以確定不同重組腺病毒的治療和腫瘤清除效果。
[0058]以上腫瘤治療實驗結(jié)果表明，不同重組病毒在體內(nèi)對瘤細胞的清除能力各異。我們依據(jù)前期劑量試驗的結(jié)果，以IXlO6和IXlO7Pfu/只這兩種劑量用于治療實驗。在
IX IO6Pfu/只的劑量條件下，經(jīng)過治療后2個月，對照組所有5只Ad-GFP治療的小鼠全部生成腫瘤。10只Ad-E6E7治療小鼠僅2只免于荷瘤，10只Ad-E6E7hsp治療小鼠6只免于荷瘤，10只Ad-E6E7-GM治療小鼠5只免于荷瘤，而10只Ad_E6E7hsp-GM治療小鼠7只免于荷瘤。該結(jié)果表明后者的治療效果最佳。另外，在IXlO7Pfu/只的劑量條件下，經(jīng)過兩個月，對照組所有5只Ad-GFP治療小鼠全部生成腫瘤，而Ad-E6E7治療小鼠5只中有4只免于荷瘤。并且，經(jīng)Ad-E6E7hsp，Ad-E6E7-GM和Ad_E6E7hsp-GM治療的小鼠全部免于荷瘤(表1)。此外，在相同時間內(nèi)，Ad-E6E7hsp治療的荷瘤小鼠腫瘤尺寸也小于Ad-E6E7治療小鼠(結(jié)果未出示)。初次治療2月后，所有未荷瘤小鼠再次接種TC-1腫瘤細胞。直到半年實驗結(jié)束，再次接種腫瘤的小鼠仍全部免于荷瘤。綜上結(jié)果顯示，HSP和GM-CSF可以單獨也可協(xié)同作用而達到增強HPV特異的T細胞 免疫反應，進而清除小鼠體內(nèi)腫瘤并防止復發(fā)。
[0059]結(jié)果表明以HSP和GM-CSF的協(xié)同治療作用為最佳。
[0060]表1腫瘤治療實驗中的未成瘤小鼠率
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種人乳頭瘤病毒及免疫增強分子五基因型融合抗原，其含有人乳頭瘤病毒16型的E6、E7蛋白和人乳頭瘤病毒18型的E6、E7蛋白及免疫增強分子佐劑蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的融合抗原，其特征在于，其具有下述一或多個突變位點，其中，所述的人乳頭瘤病毒16型E6蛋白的突變位點為:121位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?22位的賴氨酸突變?yōu)楦拾彼?；所述的人乳頭瘤病毒16型E7蛋白的突變位點為:24位的半胱氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?6位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼?；所述的人乳頭瘤病毒18型E6蛋白的突變位點為:116位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?17位的賴氨酸突變?yōu)楦拾彼?；所述的人乳頭瘤病毒18型E7蛋白的突變位點為:27位的半胱氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?9位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼帷?br> 3.如權(quán)利要求1或2所述的融合抗原，其特征在于，所述的免疫增強分子佐劑蛋白為原核生物或哺乳動物熱休克蛋白，優(yōu)選為結(jié)核桿菌的熱休克蛋白。
4.一種表達權(quán)利要求1~3任一項所述融合抗原的重組基因表達載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組基因表達載體，其特征在于，其攜帶有表達權(quán)利要求1~3任一項所述的融合抗原的表達盒，以及表達免疫刺激因子的表達盒。
6.如權(quán)利要求5所述的重組基因表達載體，其特征在于，所述的免疫刺激因子為粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干擾素或細胞趨化因子，優(yōu)選為粒單核細胞集落刺激因子 GM-CSF。
7.如權(quán)利要求4-6任一項所述的重組基因表達載體，其特征在于，其攜帶核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的DNA片段。
8.如權(quán)利要求4-6任一項所述的重組基因表達載體，其特征在于，其為重組腺病毒載體、重組腺相關(guān)病毒載體、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組皰疹病毒載體、重組痘苗病毒載體或重組仙臺病毒載體。
9.如權(quán)利要求4-6任一項 所述的重組基因表達載體，其特征在于，其為非病毒載體，所述非病毒載體選自裸DNA載體、納米顆粒，多聚物或脂質(zhì)體。
10.一種治療人乳頭瘤病毒感染引起的疾病的藥物制劑，其包含治療有效量的權(quán)利要求I~3任一項所述的融合抗原,或包含治療有效量的權(quán)利要求4-9任一項所述的重組基因表達載體。
11.如權(quán)利要求10所述的藥物制劑，其特征在于，其包含治療有效量的權(quán)利要求1~3任一項所述的融合抗原以及免疫刺激因子。
12.如權(quán)利要求11所述的藥物制劑，其特征在于，所述的免疫刺激因子為粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF、白介素、干擾素或細胞趨化因子，優(yōu)選為粒單核細胞集落刺激因子GM-CSF。
13.—種重組腺病毒，其特征在于，其攜帶權(quán)利要求4-9任一項所述的重組基因表達載體。
14.權(quán)利要求1-3任一項所述的融合抗原、權(quán)利要求4-9任一項所述的重組基因表達載體、權(quán)利要求10-12任一項所述的藥物制劑、權(quán)利要求13所述的腺病毒在制備治療人乳頭瘤病毒感染引起的疾病的藥物中的應用。
15.如權(quán)利要求14所述的應用，其特征在于，所述的人乳頭瘤病毒感染引起的疾病屬于與HPV慢性感染相關(guān)的疾病，優(yōu)選宮頸癌、陰莖癌、肛門癌、喉癌、口腔癌、頭頸部癌、宮頸癌前病變和/或?qū)m頸增生。
【文檔編號】C12N15/861GK103772508SQ201410017909
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】邊濤, 劉娟, 肖嘯 申請人:南京勉益生物藥業(yè)有限公司