一種生物法合成乙偶姻及其衍生物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物法合成乙偶姻及其衍生物的方法，屬于分子生物學【技術(shù)領域】。本發(fā)明將丙酮酸脫羧酶基因、具有乙偶姻合酶活性基因，導入宿主菌得到重組菌，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，進一步在乙偶姻基礎上生產(chǎn)2,3-丁二醇。本發(fā)明成功利用重組后菌株發(fā)酵生成乙偶姻和2,3-丁二醇，解決了天然生產(chǎn)途徑中間產(chǎn)物乙酰乳酸消耗影響乙偶姻和2,3-丁二醇產(chǎn)量的問題。
【專利說明】一種生物法合成乙偶姻及其衍生物的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種合成乙偶姻的方法，具體而言是對大腸桿菌進行分子生物學改造使其合成乙偶姻，并在乙偶姻基礎上進一步合成2，3- 丁二醇，屬于分子生物學【技術(shù)領域】。
【背景技術(shù)】
[0002]乙偶姻(別名:甲基乙酰甲醇，3-羥基-2-丁酮)具有強烈的奶油、脂肪樣香氣，高度稀釋后有令人愉快的奶香氣，主要用于配置香精，是重要的食品添加劑和藥物合成原料。傳統(tǒng)上乙偶姻可由2，3- 丁二酮與鋅在酸性條件下反應獲得，或者由碳水化合物用曲霉屬菌或青霉菌等真菌發(fā)酵制備。2，3-丁二醇主要用作香料和有機合成試劑，還是潛在的生物燃料，可由碳水化合物經(jīng)枯草桿菌類發(fā)酵而得。
[0003]從碳水化合物出發(fā)，通過工程改造過的微生物生產(chǎn)乙偶姻和2，3- 丁二醇的方法雖有報道，但這些方法都基于一種天然的合成代謝路徑:乙酰乳酸合酶催化兩個丙酮酸縮合成乙酰乳酸；乙酰乳酸脫羧酶催化乙酰乳酸脫羧生成乙偶姻；乙偶姻還原酶催化乙偶姻還原生成2，3-丁二醇。這一天然途徑以乙酰乳酸為關(guān)鍵代謝中間物，但乙酰乳酸在微生物代謝中也被用于合成氨基酸、萜類等，因此會被大量消耗，從而會影響乙偶姻和2，3- 丁二醇的生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種合成乙偶姻方法，通過將丙酮酸脫羧酶基因、具有乙偶姻合酶活性基因，導入宿主菌得到重組菌，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，進一步在乙偶姻基礎上生產(chǎn)2，3-丁二醇的方法。
[0005]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0006](I)克隆丙酮酸脫羧酶基因和具有乙偶姻合酶活性基因；
[0007](2)將步驟(1)所得的基因連接到質(zhì)粒載體上，分別構(gòu)建含有丙酮酸脫羧酶基因和乙偶姻合酶基因的重組質(zhì)粒；
[0008](3)將步驟(2)中的重組質(zhì)粒導入宿主菌，獲得重組菌；
[0009](4)利用步驟(3)中重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。
[0010]上述方法的具體步驟如下:
[0011](I)分別克隆丙酮酸脫羧酶基因和具有乙偶姻合酶活性基因；
[0012](2)將步驟(1)所得的基因，丙酮酸脫羧酶基因連接pET28a質(zhì)粒，具有乙偶姻合酶活性基因連接pACYduetl質(zhì)粒；
[0013](3)將步驟(2)得到的兩個重組質(zhì)粒導入到大腸桿菌中，得到重組大腸桿菌；
[0014](4)利用步驟(3)得到的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。
[0015]上述乙偶姻的生產(chǎn)中在所述丙酮酸脫羧酶基因來源于運動發(fā)酵單胞菌或丙酮丁醇梭桿菌；所述具有乙偶姻合酶活性基因為乙偶姻脫氫酶acoABCL，丙酮酸脫氫酶El亞基PDHAl基因和L0C10051669`5基因，乙酰乳酸合酶ILV2基因或YerE酶yerE基因中任——種。
[0016]根據(jù)上述方法，利用丙酮酸脫羧酶I3DC基因和細菌Yersiniapseudotuberculosis的yerE基因生產(chǎn)乙偶姻，具體步驟如下:
[0017](I)分別克隆運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶PDC基因和細菌Yersiniapseudotuberculosis 的 yerE 基因；
[0018](2)將步驟(1)所述PDC基因連接到pET28a質(zhì)粒上，得到的新質(zhì)粒PJXL65，將yerE基因連接到pACYduetl質(zhì)粒上，得到的新質(zhì)粒PJXL63 ；
[0019](3)將步驟(2)所述的質(zhì)粒載體pJXL65和pJXL63 —起電激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌;
[0020](4)利用步驟(3)中的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。
[0021 ] 上述重組菌優(yōu)選葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。
[0022]本發(fā)明還提供了一種合成2，3-丁二醇的方法，是將丙酮酸脫羧酶基因、具有乙偶姻合酶活性基因和具有乙偶姻還原酶活性基因，導入宿主菌得到重組菌，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇，主要步驟如下:
[0023](I)分別克隆丙酮酸脫羧酶基因，具有乙偶姻合酶活性基因和具有乙偶姻還原酶活性基因；
[0024](2)將具有乙偶姻合酶活性基因、丙酮酸脫羧酶基因和乙偶姻還原酶活性基因分別連接到可在同一宿主細胞中相容的兩個質(zhì)粒上；
[0025](3)將步驟(2)所獲重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌得到重組菌；
[0026](4)利用步驟(3)中的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇。
[0027]上述方法的具體步驟如下:
[0028](I)分別克隆丙酮酸脫羧酶基因，具有乙偶姻合酶活性基因和具有乙偶姻還原酶活性基因；所述丙酮酸脫羧酶基因來源于運動發(fā)酵單胞菌或丙酮丁醇梭桿菌；所述具有乙偶姻合酶活性基因為乙偶姻脫氫酶acoABCL，丙酮酸脫氫酶El亞基TOHAl基因和L0C100516695基因，乙酰乳酸合酶ILV2基因或YerE酶yerE基因中任——種；所述具有乙偶姻還原酶活性基因為2，3- 丁二醇脫氫酶bdhA基因或醇脫氫酶adh基因中任一一種；
[0029](2)將具有乙偶姻合酶活性基因連接到pACYduetl質(zhì)粒得到質(zhì)粒PJXL63，將步驟
(I)所得丙酮酸脫羧酶基因連接到PJXL63質(zhì)粒得到重組質(zhì)粒PJXL78，將具有乙偶姻還原酶活性基因連接到pET28a質(zhì)粒載體得到的重組質(zhì)粒PJXL79 ；
[0030](3)將步驟(2)所獲重組質(zhì)粒PJXL78和pJXL79轉(zhuǎn)化入大腸桿菌得到重組菌；
[0031](4)利用步驟(3)中的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇。
[0032]根據(jù)上述方法，利用丙酮酸脫羧酶PDC基因和2，3- 丁二醇脫氫酶bdhA基因合成2，3-丁二醇的具體步驟如下:
[0033](I)克隆發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶PDC基因和枯草芽孢桿菌的2，3- 丁二醇脫氫酶bdhA基因；(2)將yerE基因連接到pACYduetl質(zhì)粒載體得到的新質(zhì)粒pJXL63，將步驟
(I)所得PDC基因連接到PJXL63質(zhì)粒得到重組質(zhì)粒PJXL78，將bdhA基因連接到pET28a質(zhì)粒載體得到的重組質(zhì)粒PJXL79 ；
[0034](3 )將步驟(2 )所獲重組質(zhì)粒PJXL78和pJXL79電激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)中,得到重組菌；`[0035](4)利用步驟(3)中的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇。
[0036]上述重組菌優(yōu)選葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇。本發(fā)明還提供了用于生物法生產(chǎn)乙偶姻和2，3_ 丁二醇的方法和材料。具體地說，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)乙偶姻和2，3-丁二醇的核酸分子、多肽、宿主細胞和方法。此處提到的核酸分子可用于對宿主細胞進行基因工程改造，使其具有生產(chǎn)乙偶姻和2，3-丁二醇的能力。此處提到的多肽可用在無細胞體系中生產(chǎn)乙偶姻和2，3_ 丁二醇。此處提到的宿主細胞可用在培養(yǎng)體系中生產(chǎn)乙偶姻和 2，3- 丁二醇。
[0037]本發(fā)明提供了具有丙酮酸脫羧酶活性和/或乙偶姻合酶活性和/或甲基乙偶姻還原酶活性的細胞，以及通過培養(yǎng)這些細胞來生產(chǎn)如本文所述的那些產(chǎn)物的方法。在一些實施方案中細胞本身含有所需酶活性如運動發(fā)酵單胞菌、酵母菌。在另一些實施方案中，細胞含有編碼這些酶的外源核酸。
[0038]在一些實施方案中，所述的細胞還含有二醇脫水酶活性和/或醇脫氫酶活性這些細胞可以將2，3- 丁二醇進一步轉(zhuǎn)化為丁酮和2- 丁醇。
[0039]本發(fā)明成功利用重組后菌株發(fā)酵生成乙偶姻和2，3- 丁二醇，解決了天然生產(chǎn)途徑中中間產(chǎn)物乙酰乳酸消耗影響乙偶姻和2，3- 丁二醇生產(chǎn)的問題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1本發(fā)明中提到的各化合物的結(jié)構(gòu)式；
[0041](1.乙酰乳酸，2.乙醛，3.丙酮酸，4.乙偶姻，5.2，3-丁二醇)。
[0042]圖2生物法生產(chǎn)乙偶姻的合成代謝路徑示意圖；
[0043](1.丙酮酸脫羧酶，2.乙偶姻合酶)。
[0044]圖3生物法生產(chǎn)2，3- 丁二醇的合成代謝路徑示意圖；
[0045](1.丙酮酸脫羧酶，2.乙偶姻合酶，3.乙偶姻還原酶)。
[0046]圖4質(zhì)粒pJXL65的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0047]圖5質(zhì)粒pJXL63的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0048]圖6質(zhì)粒pJXL78的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0049]圖7質(zhì)粒pJXL79的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0050]圖8產(chǎn)生的乙偶姻用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測產(chǎn)生的TIC圖。
[0051]圖9產(chǎn)生的乙偶姻用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測產(chǎn)生的質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0052]圖1-3描述了生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的路徑:丙酮酸脫羧酶催化丙酮酸脫羧生成乙醛；一種具有乙偶姻合酶活性的酶催化乙醛和丙酮酸反應生成乙偶姻；乙偶姻還原酶催化乙偶姻還原生成2，3- 丁二醇。這里所說的脫羧酶、合酶、還原酶活性廣泛存在于各種細胞中?？梢岳眉毎泄逃械倪@些酶活性。也可以從另外的物種中克隆這些酶然后轉(zhuǎn)入到細胞中去。這些酶也可以是通過改造的酶。這種改造可以通過誘變篩選或定向進化來實現(xiàn)。
[0053]目前人們已經(jīng)發(fā)`現(xiàn)的多種以硫胺素焦磷酸為輔酶的蛋白具有圖1-3中所示的乙偶姻合酶活性。比如乙偶姻脫氫酶的El亞基，動物的丙酮酸脫氫酶的El亞基，乙酰乳酸合酶，轉(zhuǎn)酮酶，YerE酶。這些蛋白都可以應用于本發(fā)明。這些蛋白及編碼他們的核酸的來源舉例如下:
[0054]表1具有乙偶姻合酶活性的蛋白及其基因
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種生物法合成乙偶姻的方法，其特征在于，將丙酮酸脫羧酶基因、具有乙偶姻合酶活性基因，導入宿主菌得到重組菌，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下: (O克隆丙酮酸脫羧酶基因和具有乙偶姻合酶活性基因； (2)將步驟(1)所得的基因連接到質(zhì)粒載體上，分別構(gòu)建含有丙酮酸脫羧酶基因和乙偶姻合酶基因的重組質(zhì)粒； (3)將步驟(2)中的重組質(zhì)粒導入大腸桿菌，獲得重組大腸桿菌； (4)利用步驟(3)得到的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，具體步驟如下: (O分別克隆丙酮酸脫羧酶基因和具有乙偶姻合酶活性基因； (2)將步驟(1)所得的基因，丙酮酸脫羧酶基因連接到pET28a質(zhì)粒上，制成重組質(zhì)粒PJXL65，具有乙偶姻合酶活性基因連接到pACYduetl質(zhì)粒上，制成重組質(zhì)粒pJXL63 ； (3)將步驟(2)得到的兩個重組質(zhì)粒導入到大腸桿菌中，得到重組大腸桿菌； (4)利用步驟(3)得到的重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。`
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述任一方法，其特征在于，所述丙酮酸脫羧酶基因來源于運動發(fā)酵單 胞菌或丙酮丁醇梭桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述任一方法，其特征在于，所述具有乙偶姻合酶活性基因為乙偶姻脫氫酶acoABCL基因，丙酮酸脫氫酶El亞基TOHAl基因和L0C100516695基因，乙酰乳酸合酶ILV2基因或YerE酶yerE基因中任——種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述任一方法，其特征在于，具體步驟如下: (O分別克隆運動發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因PDC基因和細菌Yersiniapseudotuberculosis 的 yerE 基因； (2)將步驟(1)所述PDC基因連接到pET28a質(zhì)粒上，得到的新質(zhì)粒pJXL65，將yerE基因連接到pACYduetl質(zhì)粒載體上,得到的新質(zhì)粒pJXL63 ； (3)將步驟(2)所述的質(zhì)粒載體？幾1^65和pJXL63—起電激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中,得到重組菌； (4)利用步驟(3)中的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。
7.一種合成2，3- 丁二醇的方法，是將丙酮酸脫羧酶基因、具有乙偶姻合酶活性基因和具有乙偶姻還原酶活性基因，導入宿主菌得到重組菌，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)分別克隆丙酮酸脫羧酶基因，具有乙偶姻合酶活性基因和具有乙偶姻還原酶活性基因; (2)將具有乙偶姻合酶活性基因、丙酮酸脫羧酶基因和乙偶姻還原酶活性基因分別連接到可在同一宿主細胞中相容的兩個質(zhì)粒上； (3)將步驟(2)所獲重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌得到重組菌； (4)利用步驟(3)中的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，具體步驟如下: (I)分別克隆丙酮酸脫羧酶基因，具有乙偶姻合酶活性基因和具有乙偶姻還原酶活性基因；所述丙酮酸脫羧酶基因來源于運動發(fā)酵單胞菌或丙酮丁醇梭桿菌；所述具有乙偶姻合酶活性基因為乙偶姻脫氫酶acoABCL基因，丙酮酸脫氫酶El亞基TOHAl基因和L0C100516695基因，乙酰乳酸合酶ILV2基因或YerE酶yerE基因中任——種；所述具有乙偶姻還原酶活性基因為2，3- 丁二醇脫氫酶bdhA基因或醇脫氫酶adh基因中任一一種； (2)將具有乙偶姻合酶活性基因連接到pACYduetl質(zhì)粒得到重組質(zhì)粒pJXL63，將步驟(I)所得丙酮酸脫羧酶基因連接到PJXL63質(zhì)粒得到重組質(zhì)粒PJXL78，將具有乙偶姻還原酶活性基因連接到pET28a質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒PJXL79 ； (3)將步驟(2)所獲重組質(zhì)粒PJXL78和pJXL79轉(zhuǎn)化入大腸桿菌得到重組菌； (4 )利用步驟(3 )中的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)克隆發(fā)酵單胞菌的丙酮酸脫羧酶PDC基因和枯草芽孢桿菌的2，3-丁二醇脫氫酶bdhA基因； (2)將yerE基因連接到pACYduetl質(zhì)粒載體得到重組質(zhì)粒pJXL63，將步驟(1)所得TOC基因連接到PJXL63質(zhì) 粒得到重組質(zhì)粒PJXL78，將bdhA基因連接到pET28a質(zhì)粒得到的重組質(zhì)粒 PJXL79 ； (3)將步驟(2)所獲重組質(zhì)粒PJXL78和pJXL79電激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌； (4 )利用步驟(3 )中的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇。
【文檔編號】C12N15/70GK103725718SQ201410007345
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】咸漠, 姜興林, 劉煒, 徐鑫, 劉輝 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所