降解角蛋白的方法以及制備的角蛋白水解產(chǎn)物的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于制備角蛋白水解產(chǎn)物的方法，包括以下步驟：i)將角蛋白材料與蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合，還涉及如此制備的角蛋白水解產(chǎn)物及其用途。
【專利說明】降解角蛋白的方法以及制備的角蛋白水解產(chǎn)物的用途
[0001] 序列表的引用
[0002] 所附的是包括SEQIDN0 :1_4的序列表，其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及蛋白酶和不含硫的表面活性劑的組合在降解角蛋白方面的方法和用 途，以及所制備的角蛋白水解產(chǎn)物的后續(xù)用途。

【背景技術(shù)】
[0004] 角蛋白是存在于多種結(jié)構(gòu)中的一家族堅(jiān)韌蛋白的總稱。它是被許多類的動(dòng)物用作 結(jié)構(gòu)元件的蛋白，并且是纖維蛋白的經(jīng)典例子。為了實(shí)現(xiàn)此結(jié)構(gòu)功能，角蛋白分子是螺旋 和纖維狀的，從而圍繞彼此纏繞形成稱為中間絲的鏈。據(jù)認(rèn)為，這使得許多蛋白難以在一 開始就被酶消化。另外，角蛋白含有高百分比的含硫氨基酸，主要是半胱氨酸，這些氨基酸 在各個(gè)分子之間形成二硫橋并有助于形成相當(dāng)剛性的角蛋白結(jié)構(gòu)。遺憾的是，二硫橋也使 得角蛋白的消化和降解相當(dāng)困難。存在兩種主要類型的角蛋白：a-角蛋白和角蛋白。 a-角蛋白主要存在于哺乳動(dòng)物的毛發(fā)（包括羊毛）、獸角、指/趾甲、爪子和獸蹄中。更硬 的角蛋白存在于爬行動(dòng)物的趾甲中及鱗和爪子中，它們的殼中（龜鱉目（Testudines)， 諸如烏龜、海龜、水龜），鳥類的羽毛、鳥喙、爪子中，以及豪豬的剛毛中。0 -角蛋白主要以 折疊的形式形成，但一些折疊也存在于a-角蛋白中。
[0005] 角蛋白的降解可具有重大的商業(yè)價(jià)值。一種特別的角蛋白來(lái)源，即羽毛，由家禽 業(yè)大量產(chǎn)生。在2002年，家禽業(yè)中使用了大約490億只雞。家禽羽毛通常含有大約90% 的角蛋白形式的蛋白。然而，角蛋白必須在裂解后其蛋白內(nèi)容物才能被動(dòng)物消化 (McCaslandandRichardson1966,Poult.Sci., 45:1231-1236(McCasland和Richardson, 1966年，《家禽科學(xué)》，第45卷，第1231-1236頁(yè)）；Moranetal. (Moran等人））。羽毛的降 解因此可提供可消化蛋白和氨基酸的廉價(jià)來(lái)源。相應(yīng)地，羽毛水解產(chǎn)物（即，降解的羽毛） 能夠以多種方式使用，諸如用于動(dòng)物飼料中。然而，回收該營(yíng)養(yǎng)物的現(xiàn)行方法是如此低效和 高昂以至于絕大部分角蛋白廢物流只是在垃圾填埋場(chǎng)處置或經(jīng)由焚燒處置，這兩者均可導(dǎo) 致環(huán)境問題并降低主要商業(yè)化工藝（通常為用于人類食用的肉類生產(chǎn)）的可持續(xù)性。遺憾 的是，用于制備角蛋白水解產(chǎn)物的一些當(dāng)代工藝所制備的羽毛粉比雞肉更貴。
[0006] 角蛋白的降解可通過蒸汽水解、化學(xué)水解和酶水解實(shí)現(xiàn)。例如，蒸汽水解在 M.J.Considine,2000,NewEnzymeTechnologiesForPoultryBy-Products.Proc.Aust.Poult.Sci.Sym. 2000. -- 12,pages163-165,ISSNNo. 1034-6260 (M.J.Considine，2000 年， "用于家禽副產(chǎn)品的新型酶技術(shù)"，《2000年12月澳大利亞家禽科學(xué)專題討論會(huì)會(huì)議記錄》， 第163-165頁(yè)，ISSN號(hào)1034-6260)中進(jìn)行了公開。蒸汽水解的一個(gè)缺點(diǎn)在于該工藝會(huì)使 熱敏性氨基酸降解，從而耗減所得的羽毛水解產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)含量。此外，已發(fā)現(xiàn)，通過蒸汽水 解制備的羽毛水解產(chǎn)物具有相對(duì)低的可消化性。這對(duì)于將羽毛水解產(chǎn)物用于飼料是明顯不 可取的，因?yàn)榭晒﹦?dòng)物獲取的蛋白質(zhì)和氨基酸的量并不理想。
[0007] 用于降解角蛋白的另一種方法是化學(xué)水解。例如，可使用酸（諸如鹽酸）、堿（諸 如氫氧化鈉）和氧化劑（諸如過酸）來(lái)分解存在于角蛋白中的二硫鍵?；瘜W(xué)水解的一個(gè)缺 點(diǎn)在于使用此類化學(xué)試劑的成本可較高昂。另一個(gè)缺點(diǎn)在于與酶方法相比，氨基酸的量可 減少，參見Kim等人（PoultryScience，2002,85 :95-98(《家禽科學(xué)》，2002年，第85卷，第 95-98頁(yè)）-表2)。另一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)在于，許多被建議用于化學(xué)水解的試劑是不適用于食 品用途的含硫試劑（例如，十二烷基硫酸鈉（SDS)、二硫蘇糖醇（DTT)、巰基乙醇、L-半胱氨 酸、亞硫酸鈉、氨基磺酸銨和二甲基亞砜（DMS0))。此類刺激性化學(xué)試劑可能擅于破壞二硫 橋，但它們使所得的角蛋白水解產(chǎn)物不適宜在食品或動(dòng)物飼料產(chǎn)品中使用。
[0008] 降解角蛋白的另一種方法是借助酶水解。多份以北卡羅萊納州立大學(xué)（North CarolinaStateUniversity)的名義授予Shih等人的專利涉及使用地衣芽孢桿 菌（B.lichenif〇rmis)PWD-l或從該細(xì)菌分離的角蛋白酶來(lái)降解家禽羽毛。參見US 4,908,220、舊 4,959,311、舊 5,063,311、舊5，171，682、舊5，186,961 和舊5,712，147。 酶降解可以是有利的，因?yàn)榕c使用蒸汽水解或化學(xué)水解相比，一些工藝可導(dǎo)致存在更易消 化的蛋白質(zhì)和氨基酸。
[0009]然而，如Cai等人（J.ZhejiangUniv.Sci.B20089 (9) :713-720 (《浙江大學(xué)學(xué)報(bào) B輯》，2008年，第9卷第9期，第713-720頁(yè)））所公開，單獨(dú)使用蛋白酶（諸如角蛋白酶） 降解角蛋白可能非常低效。Cai等人公開了含硫化學(xué)試劑諸如SDS、氨基磺酸銨（ammonium sulfatate)和DMS0刺激了羽毛粉水解，原因是含硫化學(xué)試劑所引起的反應(yīng)。然而，使用含 硫化學(xué)試劑的一個(gè)缺點(diǎn)在于，高含量的亞硫酸鹽可導(dǎo)致潛在有害的副作用。例如，高含量的 亞硫酸鹽與某些人的哮喘加重有關(guān)，并且如果其在工業(yè)過程中于高溫下使用，則會(huì)帶來(lái)危 害。
[0010] 因此，期望提供一種用于降解角蛋白的方法，該方法提供了在所得水解產(chǎn)物的效 率、成本效益和營(yíng)養(yǎng)含量方面的所需平衡。例如，期望提供一種降解角蛋白的方法，該方法 得到可消化蛋白質(zhì)和氨基酸的良好來(lái)源，同時(shí)使成本最小化和/或同時(shí)減少了所利用的含 硫化學(xué)試劑的量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1顯示了雞羽毛在與以下物質(zhì)（從左到右）反應(yīng)之后的降解：20mg亞硫酸氫鈉 (K2)，150iilProtex 30L(E0) ;150iilProtex 30L和 20mg亞硫酸鈉（E1-兩根試管）；以 及150y1 Protex 30L和20mg亞硫酸氫鈉（E2-兩根試管）。
[0012] 圖2顯示了雞羽毛在存在或不存在GrinsteduSSLP55VEGK-A(E481，硬脂酰乳 酸鈉）和亞硫酸鈉的情況下與蛋白酶（Protex30L)反應(yīng)之后的降解。所有管均包含Protex 30L，此外從左到右：試管1. 0和1. 1包含20mj4'GHnstecTSSL和20mg亞硫酸鈉；試管1. 2 包含20mg亞硫酸鈉，并且試管1. 3包含20mgGrinstecTSSL。
[0013] 圖3顯示了雞羽毛在存在或不存在Pan〇danu517K0SHER(E472e，單和二甘油酯 的二乙酰酒石酸酯）和亞硫酸鈉的情況下與蛋白酶（Protex30L)反應(yīng)之后的降解量。所 有管均包含Protex30L，此外從左到右：試管2. 0和2. 1包含20mgpan〇dailU 517和20mg 亞硫酸鈉，試管2. 2包含20mg亞硫酸鈉，并且試管2. 3包含20mgpan〇dan* 517。
[0014] 圖4顯示了角蛋白材料在各種蛋白酶ProtexP濃度下的反應(yīng)之后，通過吸光度測(cè) 得的角蛋白水解。
[0015] 圖5顯示了不含硫的表面活性劑與蛋白酶結(jié)合使用時(shí)對(duì)羽毛水解的影響，以角蛋 白水解單位表示。添加全部五種不含硫的表面活性劑，連同1%V/V蛋白酶（ProtexP)， 達(dá)到0.1%w/v的最終濃度。ProtexP:在不存在不含硫的表面活性劑時(shí)的反應(yīng)。對(duì)照： 在既不存在不含硫的表面活性劑、也不存在蛋白酶時(shí)的反應(yīng)。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù) Holm-Sidak成對(duì)比較，帶有字母a-f的平均值顯著不同，P= 0. 05。
[0016] 圖6顯示了僅有不含硫的表面活性劑時(shí)對(duì)羽毛水解的影響，以角蛋白水解單位表 示。添加全部五種不含硫的表面活性劑，達(dá)到〇. 1%w/v的最終濃度。對(duì)照：在不存在表面 活性劑時(shí)的反應(yīng)。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)Holm-Sidak成對(duì)比較，帶有字母a-c的平均 值顯著不同，P= 0.05。
[0017] 圖7顯示了不含硫的表面活性劑與蛋白酶結(jié)合使用的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。通過將來(lái)自 使用單獨(dú)的蛋白酶的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)與來(lái)自使用單獨(dú)的不含硫的表面活性劑的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)相 加生成計(jì)算數(shù)據(jù)。*指示根據(jù)使用SigmaPlot11.0軟件執(zhí)行的t檢驗(yàn)，在觀察值和計(jì)算值 之間存在統(tǒng)計(jì)上的顯著差異，P= 〇. 05。
[0018]圖 8 顯不 了序列IDNO1ProtexP
[0019]圖 9 顯不 了序列IDNO2Protex6L
[0020] 圖10顯示了序列IDNO3
[0021] 圖11顯示了序列IDNO4


【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本發(fā)明的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)在于不含硫的表面活性劑可刺激蛋白酶對(duì)角蛋白的降解。該 發(fā)現(xiàn)特別令人驚訝，因?yàn)樵诒景l(fā)明之前，人們普遍認(rèn)為在刺激蛋白酶對(duì)角蛋白的水解時(shí)，存 在硫或使用還原劑是關(guān)鍵的。
[0023] 本發(fā)明人首次證實(shí)，不含硫的表面活性劑（諸如硬脂酰-2-乳酸鈉和脂肪酸的單 和二甘油酯的二乙?；剖狨ィ┰鰪?qiáng)了蛋白酶對(duì)角蛋白的降解和/或溶液化。這一令人 驚訝的發(fā)現(xiàn)使得角蛋白能夠降解和/或溶解以提供可消化蛋白質(zhì)和氨基酸的良好來(lái)源，和 /或能夠制備具有可消化蛋白質(zhì)和氨基酸的良好來(lái)源的角蛋白水解產(chǎn)物。有利的是，在角 蛋白的酶降解過程中使用不含硫的表面活性劑可以導(dǎo)致以下有利效果中的一者或多者：i) 使工藝能夠更快地實(shí)現(xiàn)期望的降解水平或期望的可消化蛋白質(zhì)和/或氨基酸的水平；ii) 改善獲得具有可消化蛋白質(zhì)和/或氨基酸來(lái)源的期望水平的角蛋白水解產(chǎn)物的成本效益； 和/或iii)使在工藝中利用的含硫化學(xué)試劑的量減少。
[0024]發(fā)明陳沭
[0025] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供制備角蛋白水解產(chǎn)物的方法，該方法包括以下步驟：i) 將角蛋白材料與蛋白酶和不含硫的表面活性劑任選地在封閉系統(tǒng)中或在受控的氧氣水平 下混合。
[0026] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供降解角蛋白的方法，其中將角蛋白材料與蛋白酶和不 含硫的表面活性劑混合。
[0027] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供制備動(dòng)物飼料的方法，該方法包括將通過本發(fā)明的方 法制備的角蛋白水解產(chǎn)物與一種或多種動(dòng)物飼料組成組分混合。
[0028] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含不含硫的表面活性劑的組合物用于刺激角蛋白的 酶降解的用途。適宜地，所述包含不含硫的表面活性劑的組合物可任選地包含蛋白酶。適 宜地，所述組合物可以是藥物組合物或化妝品組合物。
[0029] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過本發(fā)明的方法制備的角蛋白水解產(chǎn)物在飼料中的 用途。
[0030] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過本發(fā)明的方法制備的角蛋白水解產(chǎn)物。
[0031] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的角蛋白水解產(chǎn)物的飼料添加劑組合物。
[0032] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的角蛋白水解產(chǎn)物的飼料。
[0033] 本發(fā)明的這些和其他方面在下文的【具體實(shí)施方式】中更詳細(xì)地描述。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本公開文本所屬技術(shù) 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。Singleton，etal.，DICTIONARYOFMICROBIOLOGY ANDMOLECULARBI0L0GY，20ED.JohnWileyandSons，NewYork(1994) (Singleton等人， 《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》，第20版，約翰威利父子出版公司，紐約，1994年）以及Hale &Marham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991) (Marham，《哈珀柯林斯生物學(xué)詞典》，哈珀永久出版社，紐約，1991年）為技術(shù)人員提供本公 開所使用的許多術(shù)語(yǔ)的通用詞典。
[0035] 本公開文本并不受本文公開的示例性方法和材料的限制，任何與本文所述的那些 方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公開文本的實(shí)施例的實(shí)施或試驗(yàn)。數(shù)值 范圍包括限定該范圍的數(shù)字。除非另外指明，否則分別是，任何核酸序列從左至右以5'至 3'取向?qū)懗?；氨基酸序列從左至右以氨基至羧基取向?qū)懗觥?br> [0036] 本文提供的標(biāo)題并非對(duì)本公開文本的各個(gè)方面或?qū)嵤├南拗?，這些方面或?qū)嵤?例可通過將說明書作為一個(gè)整體來(lái)參考而得到。相應(yīng)地，下面就要定義的術(shù)語(yǔ)通過將說明 書作為一個(gè)整體來(lái)參考會(huì)得到更完全的定義。
[0037] 在更詳細(xì)地描述示例性的實(shí)施例之前，應(yīng)理解本公開文本并不限于所描述的具體 實(shí)施例，因?yàn)檫@些實(shí)施例當(dāng)然是可變的。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述具體的實(shí)施 例的目的，并不意在具有限制意義，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求的限定。
[0038] 在提供數(shù)值范圍的情況中，應(yīng)理解，該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間數(shù)值 (至下限的個(gè)位的十分之一，除非上下文另有清楚規(guī)定）也被具體公開。規(guī)定的范圍中的任 何規(guī)定值或中間值與該規(guī)定的范圍中的任何其他規(guī)定值或中間值之間的每個(gè)較小范圍，被 涵蓋在本公開文本內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地被包括或排除在該范圍中，而 且其中任一個(gè)、沒有一個(gè)或兩個(gè)界限被包括在較小范圍中的每個(gè)范圍也被涵蓋在本公開文 本中，但依據(jù)該規(guī)定的范圍中的任何被具體排除的界限而定。在規(guī)定的范圍包括界限中的 一個(gè)或兩個(gè)的情況中，排除這些被包括的界限中的任一個(gè)或兩個(gè)的范圍，也被包括在本公 開文本中。
[0039] 必須指出，本文和所附權(quán)利要求書中用到的名詞既有單數(shù)含義也有復(fù)數(shù)含義，除 非上下文另有清楚規(guī)定。因此，例如，提到"蛋白酶"包括多種此類酶，而提到"飼料"包括 提到一種或多種飼料以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的它們的等同物，以此類推。
[0040] 本文述及的出版物只是為了它們?cè)诒旧暾?qǐng)的提交日之前的公開內(nèi)容而提供。本文 的任何內(nèi)容都不能被解釋為承認(rèn)這些出版物構(gòu)成本文所附權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù)。
[0041] 方法
[0042] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及降解角蛋白或制備角蛋白水解產(chǎn)物的方法，該方法包括 將角蛋白材料與蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合。
[0043] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"角蛋白水解產(chǎn)物"是指在通過例如蛋白酶水解角蛋白材料后 所得的產(chǎn)物。
[0044] 混合可在容器或反應(yīng)器中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，容器或反應(yīng)器是自由落體容器 或反應(yīng)器。自由落體容器的例子包括圓筒混合器和滾筒混合器。
[0045] 適宜地，可將角蛋白材料、一種或多種蛋白酶和一種或多種表面活性劑任選地與 一種或多種另外的組分混合（同時(shí)地或依次地）。
[0046] 混合角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑，直至已出現(xiàn)期望的角蛋白材料 降解程度（例如，直至角蛋白材料的可消化性升高，從而在其中富集可消化蛋白質(zhì)和肽的 濃度）。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地理解，所用的最佳時(shí)間段將取決于許多因素，諸如 涉及所使用蛋白酶的最佳pH和最佳溫度的溫度和pH;存在于待降解的角蛋白材料中的交 聯(lián)度；是否在所述工藝中使用其他組分諸如還原劑、化學(xué)氧化劑、酸或堿，以及例如蛋白酶 與角蛋白材料的量比率。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施例中，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合約30分鐘 至約48小時(shí)。適宜地，可將角蛋白材料和蛋白酶混合約1小時(shí)至約42小時(shí)；或約2小時(shí)至 約36小時(shí)；或約3小時(shí)至約30小時(shí)；或約4小時(shí)至約24小時(shí)；或約5小時(shí)至約18小時(shí)。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施例中，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合約30分鐘 至約16小時(shí)；或約30分鐘至約14小時(shí)；或約1小時(shí)至約12小時(shí)；或約1. 5小時(shí)至約10小 時(shí)；或約2小時(shí)至約8小時(shí)；或約3小時(shí)至約7小時(shí)。
[0049] 適宜地，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合至少30分鐘；或至 少45分鐘；或至少1小時(shí)；或至少1. 5小時(shí)；或至少2小時(shí)；或至少2. 5小時(shí)；或至少3小 時(shí)；或至少3. 5小時(shí)；或至少4小時(shí)；或至少4. 5小時(shí)；或至少5小時(shí)；或至少5. 5小時(shí)；或 至少6小時(shí)；或至少7小時(shí)；或至少8小時(shí)；或至少9小時(shí)；或至少10小時(shí)。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施例中，將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合至少2小時(shí)。
[0051] 適宜地，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合少于16小時(shí)、少于 15. 5小時(shí)、少于15小時(shí)、少于14. 5小時(shí)、少于14小時(shí)、或少于13小時(shí)。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施例中，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合少于16小 時(shí)。
[0053] 在一個(gè)實(shí)施例中，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合少于13小 時(shí)。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施例中，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合約1. 5小 時(shí)至約10小時(shí)。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施例中，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合直到至少 50重量％的角蛋白材料降解。任選地，可將角蛋白材料、蛋白酶和不含硫的表面活性劑混 合直到至少55重量％ (適宜地，至少60重量％或至少70重量％或至少80重量％或至少 90重量％或100重量％ )的角蛋白材料降解。100%降解的羽毛材料或使羽毛材料100% 降解可通過以下方式定義：羽片、羽支和后羽完全從羽軸和空心軸脫離；并且羽軸和空心 軸碎片化，使得羽毛粉在一個(gè)單步驟中制得。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施例中，可將角蛋白材料（例如，濕羽毛）加工（例如，機(jī)械地加工）成小 碎片?？蓪⒔堑鞍撞牧霞尤肴萜鳎ɡ?，處于環(huán)境溫度）中并加熱（例如，加熱至50-80°C)， 同時(shí)添加蛋白酶、不含硫的表面活性劑以及任選的化學(xué)試劑和/或還原劑（例如，亞硫酸 鹽）。容器可以是任選地具有減小的空氣空間以控制氧氣水平的封閉反應(yīng)器。使角蛋白材 料和蛋白酶反應(yīng)合適的時(shí)間（例如，30小時(shí)至48小時(shí)）。可將容器旋轉(zhuǎn)，或可對(duì)容器內(nèi)容 物進(jìn)行混合（例如，使用攪拌槳以l_200rpm混合）。在反應(yīng)過程期間，混合可導(dǎo)致一些氧氣 被連續(xù)引入反應(yīng)液體中。相應(yīng)地，容器的空氣空間可有利地具有較低的氧氣水平（例如，通 過使用料流將空氣驅(qū)出反應(yīng)器）。所得的角蛋白材料（例如，羽毛粉）可被干燥并且可被用 作飼料組分。適宜地，這種工藝具有降低與研磨角蛋白材料并利用特定高溫（例如120°C) 相關(guān)聯(lián)的能量的優(yōu)點(diǎn)，所述能量可導(dǎo)致某些氨基酸破壞。
[0057] 適宜地，反應(yīng)期間的pH在所使用蛋白酶的工作范圍內(nèi)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員能按常規(guī)確定所使用蛋白酶的最佳工作范圍，并添加緩沖劑以將反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)到適當(dāng) 的pH。例如，蛋白酶Protex30L(可得自杜邦工業(yè)生物科學(xué)公司（DuPontIndustrial 13;[08(^6110684口3))的工作口11范圍可以為約5.5至約12。當(dāng)將？1'(^61301^用作蛋白酶 時(shí)，混合步驟期間的pH可以為約5. 5至約12。適宜地，該pH范圍可以為約7至約11、或約 8至約10。優(yōu)選地，當(dāng)使用Protex30L時(shí)，pH為約pH9。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施例中，所用的pH為處于所使用蛋白酶的約最佳pH的pH。例如，該pH可 以為所使用蛋白酶的最佳pH(例如，對(duì)于Protex30L而言，為約8至約10的pH)的+/-約 lpH。適宜地，該pH可以為所使用蛋白酶的最佳pH的+/-約0. 5pH。
[0059] 在另一個(gè)實(shí)施例中，所用的pH是蛋白酶的最佳pH。
[0060] 適宜地，將反應(yīng)期間的溫度調(diào)節(jié)到所使用蛋白酶的工作范圍內(nèi)。本領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員能按常規(guī)確定所使用蛋白酶的最佳工作范圍并在期望的溫度下執(zhí)行所述反應(yīng)。例 如，蛋白酶Protex30L的工作范圍可以為約30°C至約80°C。當(dāng)將Protex30L用作蛋白酶 時(shí)，混合步驟期間的溫度可以為約30°C至約80°C。適宜地，該溫度可以為約40°C至約80°C， 或約50°C至約80°C。適宜地，該溫度可以為約60°C至約80°C。優(yōu)選地，當(dāng)使用Protex30L 時(shí)，該溫度為約70°C。
[0061] 適宜地，所用的溫度可以為所使用蛋白酶的最佳溫度的+和/或-15°C;或者+和/ 或-10°C;或者+和/或-5°c ;或者+和/或-4°c ;或者+和/或-3°c ;或者+和/或-2°c ; 或者+和/或-rc。優(yōu)選地，所用的溫度為所使用蛋白酶的約最佳工作溫度。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施例中，所用的溫度為所使用蛋白酶的最佳溫度的+和/或-10°C。
[0063] 在另一個(gè)實(shí)施例中，所用的溫度為所使用蛋白酶的最佳溫度的+和/或_5°C。
[0064] 在一個(gè)實(shí)施例中，在混合步驟中可存在不止一種酶。適宜地,所用的溫度、pH和其 他反應(yīng)條件可隨后被選擇為在所使用酶的工作范圍內(nèi)。適宜地，所使用酶（例如，不止一種 蛋白酶和/或其他額外的酶）被選擇為具有重疊的工作范圍。優(yōu)選地，酶被選擇為具有相 容的、優(yōu)選相似的工作范圍。
[0065] 適宜地，在將角蛋白材料與蛋白酶和/或不含硫的表面活性劑混合之前，可對(duì)羽 毛進(jìn)行滅菌，例如以減少和/或防止細(xì)菌污染。該滅菌步驟可通過任何可用的方式執(zhí)行。例 如，可通過使角蛋白材料與福爾馬林或環(huán)氧乙烷氣體接觸而實(shí)現(xiàn)熏蒸。作為另一種選擇和 /或除此之外，可通過在壓力下汽蒸而實(shí)現(xiàn)蒸汽滅菌。適宜地，為了有助于角蛋白材料的后 續(xù)酶降解，蒸汽滅菌可能是優(yōu)選的。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施例中，可使用蒸汽對(duì)角蛋白材料進(jìn)行預(yù)處理，以便將空氣從容器中排 出、將容器加熱至40至121°C(優(yōu)選50-80°C)的溫度、和/或?qū)堑鞍撞牧线M(jìn)行滅菌。適 宜地，可在這種蒸汽處理之前或之后將蛋白酶和/或亞硫酸鹽與角蛋白材料混合。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施例中，在反應(yīng)步驟之前對(duì)角蛋白材料進(jìn)行蒸汽滅菌。適宜地，蒸汽滅菌 包括使角蛋白與蒸汽在足以促進(jìn)其后續(xù)酶水解的溫度下接觸一段時(shí)間的步驟，即使該蒸汽 處理步驟不實(shí)現(xiàn)角蛋白材料的完全滅菌。適宜地，蒸汽滅菌可包括使角蛋白材料與蒸汽在 壓力下于封閉室內(nèi)在120至125°C下接觸至少2分鐘、或至少5分鐘、或至少10分鐘、或至 少15分鐘、或至少20分鐘。適宜地，蒸汽處理的時(shí)間和溫度可小于商業(yè)蒸汽水解工藝中所 采用的那些時(shí)間和溫度，所述商業(yè)蒸汽水解工藝在約35p.s.i.或更高的蒸汽壓力下采用 35分鐘或更長(zhǎng)的處理時(shí)間。
[0068] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可包括可以在與蛋白酶和/或不含硫的 表面活性劑的反應(yīng)步驟之前、期間和/或之后進(jìn)行的化學(xué)水解步驟。
[0069] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可包括可以在與蛋白酶和/或不含硫的 表面活性劑的反應(yīng)步驟之前和/或期間進(jìn)行的化學(xué)水解步驟。
[0070] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可包括可以在與蛋白酶和/或不含硫的 表面活性劑的反應(yīng)步驟之后進(jìn)行的化學(xué)水解步驟。
[0071] 在一個(gè)實(shí)施例中，適宜地，在化學(xué)水解中使用的酸或堿可提供將pH調(diào)節(jié)到蛋白酶 的最佳工作條件的手段。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施例中，化學(xué)水解可以在與蛋白酶的反應(yīng)步驟之后進(jìn)行。
[0073] 本發(fā)明的工藝可以作為分批、分批補(bǔ)料或連續(xù)工藝執(zhí)行。
[0074] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的工藝可以分批工藝執(zhí)行。有利的是，分批工藝更容易適 于控制氧氣水平。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施例中，通過本發(fā)明的方法制得的羽毛水解產(chǎn)物可以是沉淀物的形式。 適宜地，將大于1. 〇cm(適宜地，大于0.lcm)的顆粒物回收，以進(jìn)行預(yù)處理或水解。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施例中，通過本發(fā)明的方法制得的羽毛水解產(chǎn)物可以是溶液的形式。
[0077] 表面活件劑
[0078] 本發(fā)明的方法和用途利用不含硫的表面活性劑。
[0079] 在一個(gè)實(shí)施例中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)"表面活性劑"是指降低其溶解于其中的液體 的表面張力的物質(zhì)。例如，表面活性劑可降低水的表面張力。表面活性劑可優(yōu)選地充當(dāng)洗 滌劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑或分散劑。適宜地，表面活性劑可以是兩親的（即，可同時(shí)包含疏水基 團(tuán)和親水基團(tuán)）。
[0080] 在另一個(gè)實(shí)施例中，"表面活性劑"可以是"乳化劑"。如本文所用的術(shù)語(yǔ)"乳化劑" 是指通過增加乳液的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性而使乳液穩(wěn)定的物質(zhì)。
[0081] 優(yōu)選地，所用的表面活性劑（例如，乳化劑）對(duì)動(dòng)物和/或人類無(wú)毒。
[0082] 優(yōu)選地，表面活性劑選自：癸酸鈉；TritonX-100 ;吐溫20 ;吐溫80;卵磷脂；聚氧 乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯；聚氧乙烯山 梨醇酐單棕櫚酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂 酸銨；脂肪酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽；脂肪酸的鎂鹽；脂肪酸的單和二甘油酯的乙酸酯；脂肪 酸的單和二甘油酯的乳酸酯；脂肪酸的單和二甘油酯的檸檬酸酯；脂肪酸的單和二甘油酯 的單和二乙?；剖狨ィ恢舅岬恼崽酋?；蔗糖甘油酯；脂肪酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖 麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1，2-二醇酯；與脂肪酸的單和二甘油酯相互作用的熱氧化大豆油； 硬脂酰-2-乳酸鈉；硬脂酰-2-乳酸鈣；山梨醇酐單硬脂酸酯；山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨 醇酐單月桂酸酯；山梨醇酐單油酸酯和山梨醇酐單棕櫚酸酯。
[0083] 在一個(gè)實(shí)施例中，表面活性劑選自：癸酸鈉；TritonX-100 ;吐溫20和吐溫80。優(yōu) 選地，表面活性劑為癸酸鈉。
[0084] 在一個(gè)實(shí)施例中，表面活性劑是選自以下的乳化劑：癸酸鈉；TritonX-100;吐 溫20 ;吐溫80 ;卵磷脂；聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯；聚氧乙烯山梨 醇酐單油酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單棕櫚酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯；聚氧乙烯 山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂酸銨；脂肪酸的鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽；脂肪酸的鎂鹽；脂肪酸的單 和二甘油酯的乙酸酯；脂肪酸的單和二甘油酯的乳酸酯；脂肪酸的單和二甘油酯的檸檬酸 酯；脂肪酸的單和二甘油酯的單和二乙?；剖狨?；脂肪酸的蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪 酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1，2-二醇酯；與脂肪酸的單和二甘油酯 相互作用的熱氧化大豆油；硬脂酰-2-乳酸鈉；硬脂酰-2-乳酸鈣；山梨醇酐單硬脂酸酯； 山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨醇酐單月桂酸酯；山梨醇酐單油酸酯和山梨醇酐單棕櫚酸酯。 有利的是，此類表面活性劑是目前用于食品行業(yè)并通常被認(rèn)為能安全用于食品的乳化劑。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施例中，在本發(fā)明的方法和用途中僅將一種表面活性劑與蛋白酶結(jié)合使 用。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用兩種或更多種表面活性劑的任意組合。例如，可以使用2種或 3種或4種或5種或6種或7種或8種或9種或10種表面活性劑的任意組合。
[0086] 待使用的表面活性劑的最佳量可容易地由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定。
[0087] 在一個(gè)實(shí)施例中，所用的表面活性劑的量可在約0. 01%w/v至約1%w/v的范圍 內(nèi)。優(yōu)選地，表面活性劑的量可在約0. 05-0. 9%w/v的范圍內(nèi)。
[0088] 適宜地，所用的表面活性劑的量可以大于或等于0. 01%w/v角蛋白材料。優(yōu)選地， 所用的表面活性劑的量可以大于或等于〇. 02%w/v、或0. 05%w/v或0. 1%w/v角蛋白材 料。
[0089] 適宜地，所用的表面活性劑的量可以小于或等于1%w/v角蛋白材料。優(yōu)選地，所 用的表面活性劑的量可以小于或等于〇. 9%w/v、或0. 8%w/v或0. 5%w/v角蛋白材料。
[0090] 在一個(gè)實(shí)施例中，所用的表面活性劑的量可以在約0.lg/Kg角蛋白材料至約10g/ Kg角蛋白材料（例如羽毛）的范圍內(nèi)。適宜地，所用的表面活性劑的量可以在約0.5g/Kg 角蛋白材料至約5g/Kg角蛋白材料（例如羽毛）的范圍內(nèi)。
[0091] 適宜地，所用的表面活性劑的量可以大于或等于0.lg/Kg角蛋白材料。優(yōu)選地，所 用的表面活性劑的量可以大于或等于〇. 5g/Kg、或lg/Kg、或2g/Kg角蛋白材料。
[0092] 適宜地，所用的表面活性劑的量可以小于或等于10g/Kg角蛋白材料。優(yōu)選地，所 用的表面活性劑的量可以小于或等于8g/Kg、或5g/Kg或3g/Kg角蛋白材料。
[0093] 在一個(gè)實(shí)施例中，表面活性劑與角蛋白材料的比率可以在約1 : 100至約 1 : 10, 000的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，表面活性劑與角蛋白材料的比率可以在約1 : 500至約 1 : 5,000的范圍內(nèi)。
[0094] 適宜地,表面活性劑與角蛋白材料的比率可以大于1 : 10, 000。
[0095] 適宜地，表面活性劑與角蛋白材料的比率可小于1 : 100。
[0096] 在一個(gè)實(shí)施例中，表面活性劑是不含硫的表面活性劑。不希望受理論的束縛，據(jù) 信，表面活性劑可通過打開溶液中的疏水性角蛋白材料而起作用，從而允許酶更好地進(jìn)入 結(jié)構(gòu)中以進(jìn)行水解。作為另一種選擇，表面活性劑可有助于將經(jīng)水解的蛋白質(zhì)從羽毛的表 面移除到溶液中，使得羽毛的下層表面暴露于蛋白水解。
[0097] 在一個(gè)實(shí)施例中，如果在降解角蛋白材料（例如羽毛）的過程中，在過程結(jié)束時(shí)存 在于溶液中的可溶性蛋白的量與存在于不使用不含硫的表面活性劑的對(duì)照方法的溶液中 的可溶性蛋白的量相比有所增大，則該不含硫的表面活性劑可以是用于本發(fā)明的方法和用 途的表面活性劑。適宜地，可溶性蛋白的增加可通過在215-280nm處的吸光度的增加來(lái)衡 量。
[0098] 角蛋白材料
[0099] 角蛋白是存在于羽毛、毛發(fā)、毛皮、獸蹄、指/趾甲、羊毛、爪子和鱗中的纖維結(jié)構(gòu) 蛋白。角蛋白可被分成兩個(gè)獨(dú)立的組：a-角蛋白和角蛋白。角蛋白通常比a-角 蛋白更硬，因?yàn)樗鼈兒懈嗟陌腚装彼徭I。
[0100] 用于本發(fā)明的方法和用途的角蛋白材料可以是包含角蛋白的任何物質(zhì)。適宜地， 角蛋白材料可包括羽毛、毛發(fā)、毛皮、獸蹄、指/趾甲和羊毛。
[0101] 在一個(gè)實(shí)施例中，角蛋白材料包含角蛋白。角蛋白可存在于爬行動(dòng)物的趾 甲和爪子中，龜鱉目的殼中，鳥類的羽毛、鳥喙和爪子中，以及豪豬中。適宜地，角蛋白材料 可以是羽毛，優(yōu)選地是家禽羽毛，優(yōu)選地是雞羽毛。
[0102] 在一個(gè)實(shí)施例中，角蛋白材料包含a-角蛋白。a-角蛋白可存在于哺乳動(dòng)物的毛 發(fā)（包括羊毛）、獸角、指/趾甲、爪子和獸蹄中。適宜地，角蛋白材料可以是毛發(fā)、獸角或獸 蹄。
[0103] 在一個(gè)實(shí)施例中，角蛋白材料包括羽毛、毛發(fā)、獸角、獸蹄或羊毛。適宜地，角蛋白 材料可以是羽毛、毛發(fā)、獸角、獸蹄或羊毛。
[0104] 在一個(gè)實(shí)施例中，將至少5g角蛋白材料用于本發(fā)明的工藝和用途。適宜地，將至 少50g、優(yōu)選至少100g、優(yōu)選至少500g角蛋白材料用于本發(fā)明的工藝和用途。
[0105] 在一個(gè)實(shí)施例中，使用至少1kg角蛋白材料，優(yōu)選地使用至少2kg、或至少10kg、或 至少20kg、或至少30kg角蛋白材料。
[0106]蛋白酶
[0107] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"蛋白酶"與肽酶或蛋白酶同義。
[0108]用于本發(fā)明中的蛋白酶可以是枯草桿菌蛋白酶（E.C.3. 4.21.62)或芽孢桿 菌溶素（bacillolysin) (E.C. 3. 4. 24. 28)或堿性絲氨酸蛋白酶（E.C. 3. 4. 21.x)或 角蛋白酶（E.C. 3.4.x.x)。適宜地，用于本發(fā)明中的蛋白酶可以是蛋白酶肽鏈內(nèi)切 酶K(EC3. 4. 2. 1. 64)、肽鏈內(nèi)切酶Arg-C、內(nèi)切蛋白酶Gluc-C(EC3. 4. 21. 19)、腸激 酶（EC3. 4.21.9)、膠原酶（EC3. 4.24.3)、嗜熱菌蛋白酶（EC3. 4.24. 27)、胰蛋白酶(EC3. 4. 21. 4)、胰凝乳蛋白酶（EC3. 4.21. 1)、胃蛋白酶（EC3.4.23.1)、曲霉胃蛋白酶 (aspergillopepsin)(EC3. 4. 23. 18)、sedolisin(EC3. 4. 21. 100)、或二膚基膚酶（EC 3. 4. 14. 1)。
[0109] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、酸 性蛋白酶、中性蛋白酶或角蛋白酶。
[0110] 合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物起源的那些?；瘜W(xué)改性的或蛋白質(zhì)工程改 造的突變體也是合適的。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，例如，堿性微生物蛋 白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子為枯草桿菌蛋白酶，尤其是源自芽孢桿菌屬 (Bacillus)菌種的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌 蛋白酶309 (參見，例如美國(guó)專利No. 6, 287, 841)、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶 168 (參見，例如W0 89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子為胰蛋白酶（例如豬或牛起源的 胰蛋白酶）和鐮刀菌（Fusarium)蛋白酶（參見，例如W0 89/06270和W0 94/25583)。可用 的蛋白酶的例子還包括但不限于W0 92/19729和W0 98/20115中所述的變體。所有這些均 以引用方式并入本文。
[0111] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"野生型蛋白酶"或"野生型"描述具有存在于自然界中的氨基 酸序列的蛋白酶。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"蛋白酶變體"或"變體"描述具有衍生自親本蛋白酶的氨基酸 序列的氨基酸序列但差別在于一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入和/或缺失（它們一起稱為"突 變"）的蛋白酶?？梢栽O(shè)想，蛋白酶變體也可以是用于另外多輪制備蛋白酶變體的方法諸如 分子進(jìn)化的親本蛋白酶。
[0113] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)"同源多肽"（在本文中也被描述為"同源物"）描述與第一多 肽/蛋白酶/酶氨基酸序列相比具有高于75 %的序列同一性，優(yōu)選地具有至少80 %、85 %、 90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的多肽，優(yōu)選蛋白酶（即，"同源蛋白酶" 或"同源酶"）。
[0114] 術(shù)語(yǔ)"其功能等同物"意指該酶必須具有與本文詳述的蛋白酶大致相同的功能特 性。術(shù)語(yǔ)"修飾形式"或"變體"意指所述酶已從其初始形式進(jìn)行了修飾但保持相同的酶功 能特性。具體地講，術(shù)語(yǔ)"變體"或"修飾形式"涵蓋這樣的蛋白酶，其氨基酸序列衍生自親 本/野生型蛋白酶的氨基酸序列，但具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、插入和/或缺失（它們一 起稱為突變）。修飾形式或變體與親本酶相比可顯示出改變的酶特性。優(yōu)選地，修飾形式或 變體具有以下增強(qiáng)的表型中的一種或多種：增加的熱穩(wěn)定性，和/或增加的蛋白水解（例如 胃蛋白酶）穩(wěn)定性，和/或增加的比活性，和/或更寬的底物特異性，和/或更寬pH范圍內(nèi) 的活性。術(shù)語(yǔ)"功能"或"有效"片段意指蛋白酶的保持大致相同的酶功能或效果的片段或 部分。
[0115] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"熱穩(wěn)定的"涉及酶在暴露于高溫后保持活性的能力。
[0116] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"pH穩(wěn)定的"涉及酶在寬pH范圍內(nèi)保持活性的能力。
[0117] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，用于本發(fā)明中的蛋白酶可為如下商業(yè)產(chǎn)品中的一者或多 者中的一種或多種蛋白酶：
[0118]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備角蛋白水解產(chǎn)物的方法，包括以下步驟： i)將角蛋白材料與蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟i)在受控的氧氣水平下進(jìn)行。
3. -種降解角蛋白的方法，其中將角蛋白材料與蛋白酶和不含硫的表面活性劑混合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑選自以下中的一者 或多者：癸酸鈉；Triton-X-100 ;吐溫20 ;吐溫80 ;卵磷脂；聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯山 梨醇酐單月桂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐單棕櫚酸酯；聚氧乙 烯山梨醇酐單硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯；磷脂酸銨；脂肪酸的鈉鹽、鉀鹽或 鈣鹽；脂肪酸的鎂鹽；脂肪酸的單和二甘油酯的乙酸酯；脂肪酸的單和二甘油酯的乳酸酯； 脂肪酸的單和二甘油酯的檸檬酸酯；脂肪酸的單和二甘油酯的單和二乙?；剖狨ィ辉轮?肪酸的蔗糖酯；蔗糖甘油酯；脂肪酸的聚甘油酯；聚甘油聚蓖麻酸酯；脂肪酸的丙烷-1， 2_二醇酯；與脂肪酸的單和二甘油酯相互作用的熱氧化大豆油；硬脂酰-2-乳酸鈉；硬脂 酰-2-乳酸鈣；山梨醇酐單硬脂酸酯；山梨醇酐三硬脂酸酯；山梨醇酐單月桂酸酯；山梨醇 酐單油酸酯和山梨醇酐單棕櫚酸酯。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表面活性劑為硬脂酰-2-乳酸 鈉和/或單和二甘油酯的二乙酰酒石酸酯。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述角蛋白材料選自以下中的一者或 多者：羽毛、毛發(fā)、毛皮、獸蹄、指/趾甲和羊毛。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述羽毛為家禽羽毛（例如，雞羽毛）。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白酶為選自以下的屬中的一者 或多者：芽孢桿菌屬（Bacillus)、曲霉屬（Aspergillus)、沙雷氏菌屬（Serratia)和擬諾卡 氏菌屬（Nocardiopsis) 〇
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白酶得自芽孢桿菌屬 (Bacillus)〇
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白酶包含如SEQ ID NO :1或2 中任一者所定義的多肽序列，或其功能性片段或變體，所述功能性片段或變體在至少50個(gè) 氨基酸殘基上與SEQ ID NO :1或2中的任一者具有至少75%的序列同一性。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白酶可由與SEQ ID NO :3或 SEQ ID NO :4具有至少75%同一性的編碼蛋白酶的核酸序列、或在嚴(yán)格條件下能夠雜交至 SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4的核酸序列或其互補(bǔ)序列的核酸序列轉(zhuǎn)錄。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中還原劑在反應(yīng)步驟i)之前或期間添 加。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括化學(xué)水解步驟。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述化學(xué)水解步驟在反應(yīng)步驟i)之前和/或期 間進(jìn)行。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述化學(xué)水解步驟在反應(yīng)步驟i)之后進(jìn)行。
16. -種制備動(dòng)物飼料的方法，包括將通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法制 備的角蛋白水解產(chǎn)物與一種或多種動(dòng)物飼料組成組分混合。
17. 包含不含硫的表面活性劑的組合物用于刺激角蛋白的酶降解的用途。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述組合物包含蛋白酶并且其中所述組合物為 藥物產(chǎn)品或化妝產(chǎn)品。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中執(zhí)行所述角蛋白降解的所述酶包含如SEQ ID NO :1或2中任一者所定義的多肽序列，或其功能性片段或變體，所述功能性片段或變體在 至少50個(gè)氨基酸殘基上與SEQ ID NO :1或2中的任一者具有至少75%的序列同一性。
20. 通過根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法制備的角蛋白水解產(chǎn)物在飼料中的 用途。
21. 通過根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法制備的角蛋白水解產(chǎn)物。
22. -種飼料添加劑組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求21所述的角蛋白水解產(chǎn)物。
23. -種飼料，其包含根據(jù)權(quán)利要求21所述的角蛋白水解產(chǎn)物。
24. -種方法，其是如本文結(jié)合實(shí)施例和附圖充分描述的。
25. -種用途，其是如本文結(jié)合實(shí)施例和附圖充分描述的。
26. -種產(chǎn)品，其是如本文結(jié)合實(shí)施例和附圖充分描述的。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104507329SQ201380038641
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月20日
【發(fā)明者】于 S., H. 波爾森 C., G. 漢斯特德 J. 申請(qǐng)人:杜邦營(yíng)養(yǎng)生物科學(xué)有限公司