冰鮮南極磷蝦的蛋白水解產(chǎn)物的制備及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種由冰鮮南極磷蝦制備蛋白水解產(chǎn)物的方法，包括：(1)將南極磷蝦冰鮮原料與水以每公斤原料加1L-3L水的比例混合，粉碎勻漿后，加堿性蛋白酶在35-55℃酶解1-5h；(2)固液分離得清液，清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物，其中含脂肪0%、肽類及氨基酸總計(jì)60%以上。南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的總放線菌素產(chǎn)量與蛋白胨等現(xiàn)有商品化氮源組產(chǎn)量相當(dāng)，且高效液相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果表明南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組發(fā)酵產(chǎn)生放線菌素D的結(jié)構(gòu)類似物多樣性更好。
【專利說明】冰鮮南極磷蝦的蛋白水解產(chǎn)物的制備及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬南極磷蝦蛋白的酶水解產(chǎn)物制備領(lǐng)域，特別是涉及一種冰鮮南極磷蝦的蛋白水解產(chǎn)物的制備方法及其作為微生物發(fā)酵原料的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]南極磷奸,也稱南極大磷奸,拉丁名Euphausia superba Dana,甲殼類,是南極附近海域蘊(yùn)藏量最大的海洋浮游生物，現(xiàn)有生物量高達(dá)6.5~10.0億噸。南極磷蝦中蛋白質(zhì)、脂類等活性成分豐富，尤其是南極磷蝦干燥肌肉中粗蛋白含量高達(dá)64%，且磷蝦蛋白中18種氨基酸總量達(dá)57%，8種人體必需氨基酸含量高于25%，占氨基酸總量的43%以上。因此，從資源豐富的南極磷蝦中制備磷蝦蛋白或其水解產(chǎn)物，具有較為廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)在釣魚餌料、養(yǎng)殖飼料等行業(yè)中得到了應(yīng)用。
[0003]海洋動(dòng)物蛋白成分的常規(guī)酶水解方法一般包括以下過程:新鮮或凍干個(gè)體切片粉碎，然后在水相介質(zhì)中用酶(包括常用的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等)在適宜溫度條件下水解一定時(shí)間，固液分離，水溶液干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物。
[0004]針對南極磷蝦蛋白利用堿性蛋白酶水解的方法目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道，南極磷蝦蛋白及其水解產(chǎn)物作為微生物發(fā)酵原料的用途目前也尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種冰鮮南極磷蝦的蛋白水解方法，該制備工藝較為簡單，可有效水解南極磷蝦蛋白。所得蛋白水解產(chǎn)品中肽類或氨基酸總計(jì)60%以上；并能有效地代替現(xiàn)有蛋白胨等商品作為氮源，應(yīng)用于微生物發(fā)酵的科研和生產(chǎn)過程中。
[0006]本發(fā)明的一種由冰鮮南極磷蝦制備蛋白水解產(chǎn)物的方法，包括:(I)將冰鮮南極磷蝦原料與水以每公斤原料加1L-3L水的比例混合，粉碎勻漿后，加堿性蛋白酶在35-55°C酶解l-5h ;(2)固液分離得清液，清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物。
[0007]在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述步驟(1)中的堿性蛋白酶添加量5_20mL/kg原料；
[0008]在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，其中在步驟(1)中，冰鮮南極磷蝦原料與水以每公斤原料加1.5-2.0L水的比例混合；堿性蛋白酶的添加量為10-15mL/kg原料或10000_30000U/kg原料，45-50°C下酶解l_3h ;以及/或者在步驟(2)中，所述固液分離方法包括:過濾，并將濾液再經(jīng)離心得到所述清液，其中所述過濾為真空抽濾，所述離心的條件為10°C以下離心20-50min，轉(zhuǎn)速 6000-12000 轉(zhuǎn) /min。
[0009]本發(fā)明還提供一種蛋白水解產(chǎn)物，其上述的本發(fā)明方法得到。 [0010]本發(fā)明還提供一種通過本發(fā)明方法得到的蛋白水解產(chǎn)物作為微生物發(fā)酵的氮源的用途。
[0011]本發(fā)明還提供一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)放線菌素的方法，所述發(fā)酵所用R2A培養(yǎng)基中的蛋白胨組分被本發(fā)明的蛋白水解產(chǎn)物替代，或者所述發(fā)酵所用蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基中的蛋白胨組分被本發(fā)明的蛋白水解產(chǎn)物替代。[0012]有益效果
[0013]本發(fā)明的突出特點(diǎn)是為南極磷蝦蛋白提供了新的酶水解方法，其蛋白水解產(chǎn)物制備工藝簡單，所得產(chǎn)品中肽類或氨基酸總計(jì)60%以上，并能有效地代替市場上現(xiàn)有的蛋白胨等商品，作為微生物發(fā)酵的氮源，應(yīng)用于微生物發(fā)酵相關(guān)的科研和生產(chǎn)過程中。例如，南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的總放線菌素產(chǎn)量與蛋白胨等現(xiàn)有商品化氮源組產(chǎn)量相當(dāng)，且高效液相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果表明南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組發(fā)酵產(chǎn)生放線菌素D的結(jié)構(gòu)類似物多樣性更好。南極磷蝦的原料來源豐富，蛋白含量高，制備的蛋白水解產(chǎn)物可廣泛用于微生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)，有很好的開發(fā)利前景。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明的一種冰鮮南極磷蝦的蛋白水解方法，包括:
[0015](I)將南極磷蝦冰鮮原料與水混合，粉碎勻漿，加堿性蛋白酶酶解；
[0016](2)過濾、離心，取上清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物。
[0017]所述步驟(1)中的每公斤南極磷蝦冰鮮原料可加1L-3L水，優(yōu)選2L ；
[0018]所述步驟(1)中的堿性蛋白酶添加量5-20mL/kg磷蟲下,優(yōu)選10mL/kg磷蟲下；
[0019]所述步驟(1)中的水解溫度35-55°C，優(yōu)選50°C ；
[0020]所述步驟(1)中的水解時(shí)間為l_5h，優(yōu)選3h。
[0021]所述步驟(2)中的離心的條件為4°C離心20-50min，轉(zhuǎn)速6000-12000轉(zhuǎn)/min，優(yōu)選條件為離心30min,轉(zhuǎn)速9 000轉(zhuǎn)/min。
[0022]本發(fā)明中所述方法得到的南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物中，含脂肪0%、肽類或氨基酸總計(jì)60%以上。
[0023]本發(fā)明的南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物可作為微生物發(fā)酵的氮源，應(yīng)用于微生物發(fā)酵的科研和生產(chǎn)過程中。舉例如下(更詳細(xì)情況參見下文使用例):
[0024]一株產(chǎn)生放線菌素D的海鞘共附生鏈霉菌Streptomyces globisporus FDZ35(專利保藏號(hào)為CCTCC M2013587), R2A培養(yǎng)基250mL搖瓶發(fā)酵，獲得小量菌種；
[0025]選取R2A培養(yǎng)基和蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基作為2個(gè)對照組，這兩種培養(yǎng)基經(jīng)證明能有效地用于鏈霉菌Streptomyces globisporus FDZ35發(fā)酵,并產(chǎn)生放線菌素D ;另用南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物等量替代R2A培養(yǎng)基和蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基中對應(yīng)的蛋白胨，作為培養(yǎng)基中唯一有機(jī)氮源，得到2個(gè)南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組；每組配制1500mL培養(yǎng)基。以上4組培養(yǎng)基分別加入到每組3個(gè)2000mL搖瓶中，滅菌、接種、發(fā)酵7天，每組1500mL總發(fā)酵混合液體40°C真空濃縮干燥，分別得到4組發(fā)酵混合物，均為褐色粉末；
[0026]分別以甲醇(每次250mL，2次，超聲20min)提取4組發(fā)酵混合物，最后分別定容，得到各自發(fā)酵提取物的500mL甲醇溶液，以放線菌素D為標(biāo)準(zhǔn)品，按照《中國藥典》(2005年版)附錄VA紫外-可見分光光度法，分別測定放線菌素D及其結(jié)構(gòu)類似物含量。
[0027]所得4組發(fā)酵提取物中放線菌素D及其結(jié)構(gòu)類似物產(chǎn)量均>35mg/L發(fā)酵混合液，南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組產(chǎn)量與蛋白胨等現(xiàn)有商品化氮源組產(chǎn)量相當(dāng)，且高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Tof MS)分析結(jié)果表明南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組發(fā)酵產(chǎn)生放線菌素D的結(jié)構(gòu)類似物多樣性更好。(參見后述使用例)
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0029]蛋白水解產(chǎn)物制備例
[0030]實(shí)施例所用原料:南極磷蝦冰鮮原料來自2012年12月至2013年3月的農(nóng)業(yè)部南極磷蝦探捕漁船；堿性蛋白酶來自諾維信中國生物技術(shù)有限公司。
[0031]實(shí)施例1
[0032]將南極磷蝦冰鮮原料取1.0kg,按1.2倍質(zhì)量體積比加入1.2L水中，轉(zhuǎn)速250rpm/min粉碎勻漿5min，加堿性蛋白酶(酶活力1400U/mL) IOmL在40°C酶解2h ;用布氏漏斗中速定性濾紙減壓過濾，取水溶液在4°C、9000轉(zhuǎn)/min離心30min，上清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物，產(chǎn)品12.6g，產(chǎn)率為1.26%。得到的南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物中，含脂肪0%、肽類或氨基酸總計(jì)63%。
[0033]實(shí)施例2
[0034]將南極磷蝦冰鮮原料取1.0kg,按1.5倍質(zhì)量體積比加入1.5L水中，轉(zhuǎn)速250rpm/min粉碎勻漿5min，加堿性蛋白酶(酶活力2000U/mL)7mL在45°C酶解2h ;用布氏漏斗中速定性濾紙減壓過濾，取水溶液在4°C、9000轉(zhuǎn)/min離心30min，上清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物，產(chǎn)品13.7g，產(chǎn)率為1.37%。得到的南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物中，含脂肪0%、肽類或氨基酸總計(jì)61%。
[0035]實(shí)施例3 [0036]將南極磷奸冰鮮原料取1.0kg,按3倍質(zhì)量體積比加入3L水中，轉(zhuǎn)速250rpm/min粉碎勻漿5min，加堿性蛋白酶(酶活力2000U/mL) 14mL在50°C酶解3h ;用布氏漏斗中速定性濾紙減壓過濾，取水溶液在4°C、9000轉(zhuǎn)/min離心30min，上清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物，產(chǎn)品18.4g，產(chǎn)率為1.84%。得到的南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物中，含脂肪0%、肽類或氨基酸總計(jì)71%。
[0037]實(shí)施例4
[0038]將南極磷奸冰鮮原料取1.0kg,按2倍質(zhì)量體積比加入2L水中，轉(zhuǎn)速250rpm/min粉碎勻漿5min，加堿性蛋白酶(酶活力1800U/mL) IOmL在50°C酶解3h ;用布氏漏斗中速定性濾紙減壓過濾，取水溶液在4°C、9000轉(zhuǎn)/min離心30min，上清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物，產(chǎn)品15.3g，產(chǎn)率為1.53%。得到的南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物中，含脂肪0%、肽類或氨基酸總計(jì)67%。
[0039]實(shí)施例5
[0040]將南極磷奸冰鮮原料取1.0kg,按2倍質(zhì)量體積比加入2L水中，轉(zhuǎn)速250rpm/min粉碎勻漿5min，加堿性蛋白酶(酶活力1500U/mL) 12mL在45°C酶解3h ;用布氏漏斗中速定性濾紙減壓過濾，取水溶液在4°C、9000轉(zhuǎn)/min離心30min，上清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物，產(chǎn)品14.9g，產(chǎn)率為1.49%。得到的南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物中，含脂肪0%、肽類或氨基酸總計(jì)65%。
[0041]蛋白水解產(chǎn)物的使用例
[0042]選取R2A培養(yǎng)基和蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基作為2個(gè)對照組，已證明這兩種培養(yǎng)基能有效地用于鏈霉菌Streptomyces globisporus FDZ35發(fā)酵,并產(chǎn)生放線菌素D。[0043]另用南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物等量替代R2A培養(yǎng)基和蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基中對應(yīng)的蛋白胨，作為培養(yǎng)基中唯一有機(jī)氮源，得到2個(gè)南極磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組。
[0044]每組配制1500mL培養(yǎng)基。各組培養(yǎng)基具體組成如下:
[0045]對照組1(R2A培養(yǎng)基，單位g/L):酵母膏0.5g/L、胰蛋白胨0.25g/L、蛋白胨0.75g/L、葡萄糖 0.5g/L、淀粉 0.5g/L、K2HP040.3g/L、MgS040.024g/L、丙酮酸鈉 0.3g/L、海水鹽溶液 23.6g/L，ρΗ7.2±0.2 ;
[0046]磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組2(替代R2A培養(yǎng)基，單位g/L):酵母膏0.5g/L、磷蝦蛋白水解產(chǎn)物 1.0g/L、葡萄糖 0.5g/L、淀粉 0.5g/L、K2HP040.3g/L、MgS040.024g/L、丙酮酸鈉 0.3g/L、海水鹽溶液 23.6g/L，ρΗ7.2±0.2 ；
[0047]對照組3(蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基，單位g/L):蛋白胨2.0、葡萄糖2.0、硫酸銨1.0、碳酸鈣0.5、氯化鈉0.05、磷酸二氫鉀0.05，pH7.8-8.0 ；
[0048]磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組4 (替代蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基，單位g/L):磷蝦蛋白水解產(chǎn)物2.0、葡萄糖2.0、硫酸銨1.0、碳酸鈣0.5、氯化鈉0.05、磷酸二氫鉀0.05，pH7.8-8.0。
[0049]以上4組培養(yǎng)基分別加入到每組3個(gè)2000mL搖瓶中，滅菌、接種、28° C、轉(zhuǎn)速180rpm/min搖床發(fā)酵7天，每組1500mL總發(fā)酵混合液體40°C真空濃縮干燥,分別得到4組發(fā)酵混合物，均為褐色粉末；
[0050]分別以甲醇(每次250mL，2次，超`聲20min)提取實(shí)施例2中得到的4組發(fā)酵混合物，最后分別定容，得到各自發(fā)酵提取物的500mL甲醇溶液，以放線菌素D為標(biāo)準(zhǔn)品，按照《中國藥典》(2005年版)附錄VA紫外-可見分光光度法，分別測定放線菌素D及其結(jié)構(gòu)類似物濃度，并分別計(jì)算單位體積的各組發(fā)酵混合液中總放線菌素含量，如下表:
[0051]表1發(fā)酵混合液中總放線菌素含量測定
[0052]
Hl發(fā)酵混合液中總放線菌素含量




(mg/L )



52^8
磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組236.23
對照組342.79
憐奸蛋白水解廣物組443.94
[0053]分別取對照組3、磷蝦蛋白水解產(chǎn)物組4的發(fā)酵提取物的甲醇溶液1.0mL，進(jìn)行高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-Tof MS)分析，提取原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)中1000以上的質(zhì)譜峰，以及利用其峰面積歸一化給出的相對含量，結(jié)果如下表:
[0054]表2發(fā)酵產(chǎn)生放線菌素D的結(jié)構(gòu)類似物多樣性分析
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種由冰鮮南極磷蝦制備蛋白水解產(chǎn)物的方法，包括: (1)將冰鮮南極磷蝦原料與水以每公斤原料加1L-3L水的比例混合，粉碎勻漿后，加堿性蛋白酶在35-55°C酶解l_5h ； (2)固液分離得清液，清液濃縮干燥，得到蛋白水解產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟⑴中的堿性蛋白酶添加量5-20mL/kg原料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟(1)中的堿性蛋白酶添加量為5000-40000U/kg原料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(2)中固液分離方法包括:過濾，并將濾液再經(jīng)離心得到所述清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(1)中，冰鮮南極磷蝦原料與水以每公斤原料加1.5-2.0L水的比例混合；堿性蛋白酶的添加量為10-15mL/kg原料或10000-30000U/kg原料，45-50°C下酶解l_3h ;以及/或者在步驟(2)中，所述固液分離方法包括:過濾，并將濾液再經(jīng)離心得到所述清液，其中所述過濾為真空抽濾，所述離心的條件為10°C以下離心 20-50min，轉(zhuǎn)速 6000-12000 轉(zhuǎn) /min。
6.一種蛋白水 解產(chǎn)物，其根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述方法得到。
7.如權(quán)利要求6所述的蛋白水解產(chǎn)物，其特征在于:其中含脂肪0%、肽類及氨基酸總計(jì)60%以上。
8.將權(quán)利要求6或7所述的蛋白水解產(chǎn)物作為微生物發(fā)酵的氮源的用途。
9.如權(quán)利要求8所說的用途，所述微生物發(fā)酵為鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)放線菌素。
10.一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)放線菌素的方法，其特征在于，所述發(fā)酵所用R2A培養(yǎng)基中的蛋白胨組分被權(quán)利要求6或7的蛋白水解產(chǎn)物替代，或者所述發(fā)酵所用蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基中的蛋白胨組分被用權(quán)利要求6或7的蛋白水解產(chǎn)物替代。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103834711SQ201410075726
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】樊成奇, 黃艷青, 楊橋, 田曉清, 王成, 陸亞男, 馬麗艷, 黃洪亮 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所