用于重組蛋白質(zhì)的改進(jìn)的收獲操作的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，其包括發(fā)酵原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，在dO2水平大于0％的條件下收獲所述重組蛋白質(zhì)，將所述重組蛋白質(zhì)純化成的經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物，其中通過(guò)如IEC測(cè)定法在310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物。此外，還提供產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，其包括發(fā)酵缺失menE基因的原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，收獲所述重組蛋白質(zhì)，將所述重組蛋白質(zhì)純化成經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法在310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其中將重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加約20％或者更多。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于重組蛋白質(zhì)的改進(jìn)的收獲操作
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交互引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年3月27日提交的臨時(shí)美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?1/616, 297的優(yōu)先權(quán)的權(quán) 益，將所述申請(qǐng)以其整體并入本文作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于在原核宿主細(xì)胞中培養(yǎng)重組蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 對(duì)于活的生物技術(shù)產(chǎn)品而言，蛋白質(zhì)的大規(guī)模經(jīng)濟(jì)純化是必須的。通常，使用哺乳 動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞系，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，通過(guò)插入含該蛋白質(zhì)的基因的重組質(zhì)粒來(lái) 改造所述哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞系以產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)。由于所使用的細(xì)胞系是活的生物，所 以必須使用復(fù)合生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)它們，所述復(fù)合生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常含有鹽、糖、氨基酸、維生 素、痕量元素和蛋白胨的混合物。從培養(yǎng)細(xì)胞的化合物的混合物中以及從細(xì)胞自身的副產(chǎn) 物中分離期望的蛋白質(zhì)達(dá)到足夠用作為人類(lèi)治療劑的純度是一種艱難的挑戰(zhàn)。
[0006] 通常在幾種宿主細(xì)胞系中產(chǎn)生重組治療性蛋白質(zhì)，包括哺乳動(dòng)物宿主細(xì) 胞例如，鼠骨髓瘤NSO和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞（Anderson, D. C和&1皿11611，1^ (2002)Curr. Opin. Biotech. 13:117-123 ;Chu，L 和 Robinson, D.K. (2001)Curr. Opin. Biotechnol. 12:180-187)以及細(xì)菌宿主細(xì)胞包括大腸桿菌Escherichia coli(E.coli)。就 產(chǎn)率和由細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的特征而言，每一細(xì)胞系都具有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。大腸桿菌已經(jīng)最 廣泛地用于治療性蛋白質(zhì)的大規(guī)模產(chǎn)生，其不需要用于生物活性的復(fù)合糖基化。由大腸桿 菌表達(dá)的異源蛋白質(zhì)可以聚積成可溶性產(chǎn)物或者不溶性聚集體。通常，為了分離蛋白質(zhì)，可 以將細(xì)胞進(jìn)行用于周質(zhì)提取的處理或者裂解以釋放用其它方法無(wú)法接近的胞內(nèi)產(chǎn)物。發(fā)酵 和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展極大地增加了目標(biāo)重組蛋白質(zhì)的滴度。
[0007] 選擇市售產(chǎn)品細(xì)胞系通常平衡了對(duì)于高產(chǎn)率的需求和遞送給定產(chǎn)品所需的產(chǎn)品 質(zhì)量特性的能力。在cGMP發(fā)酵協(xié)議下，質(zhì)量已經(jīng)構(gòu)建到整個(gè)工藝中，以確保就安全性、產(chǎn)品 同一性、質(zhì)量和純度而言，符合管理機(jī)構(gòu)的需求。然而，偶然會(huì)出現(xiàn)給定產(chǎn)品不符合其規(guī)格 的問(wèn)題。存在的挑戰(zhàn)是研發(fā)健全的工藝，其中鑒別并分離不符合規(guī)格的產(chǎn)品，然后減少不符 合規(guī)格的產(chǎn)品的出現(xiàn)，以使工藝控制可以維持在已建立的參數(shù)范圍內(nèi)，并確保工藝持續(xù)產(chǎn) 生符合產(chǎn)品規(guī)格的產(chǎn)品。本領(lǐng)域存在減輕或消除不符合規(guī)格的產(chǎn)品的發(fā)生率的需求。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，其包括（a)發(fā)酵原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用 編碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和（b)在溶解氧（d0 2)水平大于0% 的條件下收獲所述重組蛋白質(zhì)，以及（C)將所述重組蛋白質(zhì)純化成用于儲(chǔ)存的經(jīng)過(guò)濾的 儲(chǔ)備物（filtered bulk for storage) (FBS)，其中通過(guò)分析測(cè)定法如離子交換層析（IEC) 測(cè)定法在310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的1，4-二羥基-2-萘甲酸 (DHNA)-重組蛋白質(zhì)加合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在上述方法中，分析測(cè)定法是HPLC、RP HPLC、HIC HPLC、NMR、質(zhì)譜法或UV光譜學(xué)。
[0010] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編 碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和（b)在(1〇2水平大于0%的條件下收獲 所述重組蛋白質(zhì)，以及（C)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法在310nm 處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其中所述重組 蛋白質(zhì)是重組多肽或分離的抗體。
[0011] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編 碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和（b)在(1〇2水平大于0%的條件下收獲 所述重組蛋白質(zhì)，以及（C)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法在310nm 處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其中發(fā)酵是獨(dú) 立于規(guī)模的。
[0012] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編 碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和（b)在(1〇 2水平大于0%的條件下 收獲所述重組蛋白質(zhì)，以及（C)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法在 310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其中所 述原核宿主細(xì)胞是大腸桿菌（Escherichia coli(E.coli))、腸桿菌屬（Enterobacter)、 固氮菌屬（Azotobacter)、歐文氏菌屬（Erwinia)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、假單胞菌 屬（Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、變形桿菌屬（Proteus)、沙門(mén)氏菌屬 (Salmonella)、沙雷氏菌屬（Serratia)、志賀氏菌屬（Shigella)、根瘤菌屬（Rhizobia)、透 明顫菌屬（Vitreoscilla)和副球菌屬（Paracoccus)。
[0013] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編 碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和（b)在(1〇 2水平大于0%的條件下收獲 所述重組蛋白質(zhì)，以及（C)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法在310nm 處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其中所述d02在 整個(gè)步驟（b)的收獲操作中持續(xù)維持在大于0%的水平。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，收 獲操作包括勻漿階段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，d02在勻漿前維持在約30%至約75%。又在 另一個(gè)實(shí)施方案中，d02在勻漿前維持在大于75 %的水平。仍在另一個(gè)實(shí)施方案中，d02在 勻漿后維持在約50%。在一個(gè)實(shí)施方案中，d02在勻漿后維持在大于50%的水平。在一個(gè) 實(shí)施方案中，d02維持大于或等于1. 5個(gè)小時(shí)。仍在一個(gè)實(shí)施方案中，d02維持大于或等于 2個(gè)小時(shí)。
[0014] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編 碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和（b)在(1〇 2水平大于0%的條件下收獲 所述重組蛋白質(zhì)，以及（C)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法在310nm 處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其中用覆蓋的 或噴射的氣體（在增加的反壓或在振蕩（即攪拌）的情況下）維持d0 2。在一個(gè)實(shí)施方案 中，覆蓋的氣體為約〇. 4vvm至約0. 8vvm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，覆蓋的氣體規(guī)定為0. 6vvm。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，增加的反壓在約1. 〇至30psi之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，增加的反壓 為19psi。仍在另一個(gè)實(shí)施方案中，攪拌速率為約6瓦特/L至約8瓦特/L。又在另一個(gè)實(shí) 施方案中，攪拌速率為至少6瓦特/L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，攪拌速率為6瓦特/L。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面中，提出了產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵缺失menE 基因的原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和 (b)收獲所述重組蛋白質(zhì)，以及（c)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法 在310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物。作為上 述方法的其他實(shí)施方案，與使用對(duì)照原核宿主細(xì)胞得到的產(chǎn)量相比，重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加 了約20%或更多、約30%或更多、約40%或更多、約50%或更多、約60%或更多。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面中，提出了產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵缺失menE 基因的原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和 (b)收獲所述重組蛋白質(zhì)，以及（c)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法 在310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其中 與使用對(duì)照原核宿主細(xì)胞比較，重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加了約20 %或更多、約30 %或更多、約 40%或更多、約50%或更多、約60%或更多，其中發(fā)酵是獨(dú)立于規(guī)模的。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面中，提出了產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵缺失menE 基因的原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和 (b)收獲所述重組蛋白質(zhì)，以及（c)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定法 在310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其中 與使用對(duì)照原核宿主細(xì)胞比較，重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加了約20 %或更多、約30 %或更多、約 40%或更多、約50%或更多、約60%或更多，其中所述重組蛋白質(zhì)是重組多肽或分離的抗 體。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面中，提出了產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括（a)發(fā)酵缺失menE 基因的原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和 (b)收獲所述重組蛋白質(zhì)，以及（c)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)IEC測(cè)定 法在310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含有可檢測(cè)的DHNA-重組蛋白質(zhì)加合物，其 中與使用對(duì)照原核宿主細(xì)胞比較，重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加了約20%或更多、約30%或更多、 約40%或更多、約50%或更多、約60%或更多，其中所述原核宿主細(xì)胞是大腸桿菌、腸桿菌 屬、固氮菌屬、歐文氏菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、沙門(mén)氏菌 屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、根瘤菌屬、透明顫菌屬和副球菌屬。
[0019] 附圖簡(jiǎn)述
[0020] 圖1顯示了產(chǎn)品的三種生產(chǎn)操作的COC測(cè)定結(jié)果，其中兩種操作Run2和Run3沒(méi) 有滿足COC測(cè)定法的預(yù)期結(jié)果。PW =純水，C =研發(fā)操作對(duì)照，I = Run 1，2 = Run 2和3 =Run 3〇
[0021] 圖2Α顯示了 Run 1-3的UV/vis光譜（10cm)-近UV，其中顯示了 Run 1-3。大約 在320nm和460nm處觀察到了新的吸收峰，其在Run 1中不明顯。圖2B顯示了 Run 3減去 Run 1的UV/vis光譜，其中Run 2和3的吸收峰的差別可以區(qū)別于Run 1。
[0022] 圖3顯示了在310nm使用IEC測(cè)定監(jiān)測(cè)Run 1-3。對(duì)于Run 2和3,觀察到了主峰 的后面的小肩峰，而Run 1的圖譜與參照材料類(lèi)似。
[0023] 圖4顯示了在280nm和3IOnm處監(jiān)測(cè)的完整Run 1-3的2D LC-MS分析。對(duì)于Run 1，觀察到了期望的質(zhì)量，而對(duì)于Run 2和3,觀察到了期望的質(zhì)量以及157Da的其他質(zhì)量。
[0024] 圖5顯示了 2D-LC MS以及使用MS檢測(cè)收集的褐色加合物的級(jí)分（收集了 IEC測(cè) 定的較小峰），通過(guò)胰蛋白酶肽圖鑒定的質(zhì)量。根據(jù)2D LC-MS分析，除期望的質(zhì)量外，對(duì)于 分級(jí)的肩峰，觀察到了 +156Da質(zhì)量。
[0025] 圖6顯示了在48. 8分鐘，310nm觀察到了新褐色加合物峰的LC-MS-MS分析，其測(cè) 定為+154. 006Da的具有修飾的Cysl82的T20肽。通過(guò)質(zhì)量提?。╩ass extraction)還檢 測(cè)到了修飾的（在半胱氨酸處，+154. 006Da)和未修飾的T6以及T16肽。
[0026] 圖7比較了產(chǎn)物和合成肽（NH2-IVQCR-C00H)的1H-15N HSQC數(shù)據(jù)，并且顯示在產(chǎn) 物樣品中缺失了 Cys NH相關(guān)性。
[0027] 圖8顯示了通過(guò)在Cys的CH和精氨酸的NH之間觀察到的強(qiáng)nOe確認(rèn)的推測(cè)結(jié)構(gòu)。
[0028] 基于收集的NMR數(shù)據(jù)，圖9中顯示了褐色加合物的推測(cè)結(jié)構(gòu)。
[0029] 圖10顯示了原核細(xì)胞中制備甲基萘醌的生物合成途徑。
[0030] 圖11顯示了通過(guò)離子交換層析在310nm處測(cè)試代表性經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物重組產(chǎn)物 的褐色加合物形成，并且顯示沒(méi)有可測(cè)量的加合物形成。
[0031] 圖12顯示了在收獲操作前后執(zhí)行的Hi-dO工藝增強(qiáng)的示例性示意圖。
[0032] 發(fā)明實(shí)施方案的詳細(xì)描述
[0033] I.定義
[0034] 除非另外指明，在本文中使用的以下術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)旨在具有以下含義：
[0035] 術(shù)語(yǔ)"攪拌速率"用于混合培養(yǎng)基或勻漿，其通常測(cè)量為每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（轉(zhuǎn)/分鐘）。 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)"單位體積功率"來(lái)測(cè)量攪拌速率。例如，1，〇〇〇升發(fā)酵罐中 200轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌速率為大約6瓦特/L。
[0036] 在本文中，術(shù)語(yǔ)"抗體"以最廣義使用，并且特別地涵蓋單克隆抗體、多克隆抗體、 多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性?？?體可以是鼠、人、人源化的、嵌合的或者來(lái)源于其他物種。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"抗體"還指全 長(zhǎng)免疫球蛋白分子或全長(zhǎng)免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含免疫特異地結(jié)合目標(biāo)靶抗 原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子或其部分，此類(lèi)祀標(biāo)包括但不限于癌細(xì)胞或者產(chǎn)生與自身免疫疾 病相關(guān)的自身免疫抗體的細(xì)胞。本文所公開(kāi)的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任意類(lèi) 型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD 和 IgA)、種類(lèi)（例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2) 或亞類(lèi)。免疫球蛋白可以來(lái)源于任何物種。然而，在一個(gè)方面中，免疫球蛋白是人、鼠或兔 來(lái)源的。
[0037] "抗體片段"包含全長(zhǎng)抗體的一部分，通常包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段 的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；通過(guò)Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生 的片段、抗獨(dú)特型（anti-id)抗體、CDR(互補(bǔ)決定區(qū)）、ECD (胞外結(jié)構(gòu)域）和任意上述與癌 細(xì)胞抗原、病毒抗原或微生物抗原免疫特異地結(jié)合的抗體的表位結(jié)合片段、單鏈抗體分子； 以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0038] "澄清度、乳池度和顯色（COC)測(cè)定法（Clarity, Opalescence and Coloration(COC)Assay) "定義為使用具有平底和15-25mm內(nèi)徑的無(wú)色、透明、中性玻璃的 相同測(cè)試管，將待檢查的液體與如上所述新鮮制備的參照懸浮液比較，層深為40mm?？蓪?U. S. Pharmacopeia 2012 (USP Monograph 631, Color and Achromicity)中或 European Pharmacopoeia 5. 0(EP Method 2.2.2，Degree of Coloration of Liquids)中列出的標(biāo) 準(zhǔn)顏色溶液用于確認(rèn)合適顏色指示。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"1，4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA) "是來(lái)源于大腸桿菌細(xì)胞的化學(xué)產(chǎn)物。Okada Y，Tsuzuki Y，Miyazaki J，Matsuzaki K，Hokari R，Komoto S，等人（2006)Gut 55:681-8。 DHNA是大腸桿菌細(xì)胞的甲基萘醌（MK)，也稱(chēng)為維生素 K2生物合成途徑中的中間產(chǎn)物。 NeidhardtjF. C. (2010)Escherichia coli and Salmonella (online version:Module 3.2.2pgs.36-37) ； InledewjW.J. &R. K. Poole(1984)The respiratory chains of Escherichia coli. Microbiological reviews. 48:222-271 ；Nowicka, B. &J. Cruk(2010) Occurrence, Biosynthesis and Function of Isoprenoid Quinones. Biochimica et Biophysica Acta 1797:1587-1605。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"溶解氧"（d02)是在給定介質(zhì)中溶解的或者攜帶的氧的量的相對(duì)測(cè)量?？梢?在液體介質(zhì)中使用溶解氧探針如氧傳感器測(cè)量溶解氧。
[0041] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵"意為培養(yǎng)已經(jīng)轉(zhuǎn)化了的原核宿主細(xì)胞，以誘導(dǎo)目的重 組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的工藝。
[0042] 術(shù)語(yǔ)"經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物（filtered bulk) "或"經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物質(zhì)（filtered bulk substance) (FBS) "意為收獲和純化后目的產(chǎn)物的重組蛋白質(zhì)，其中已經(jīng)使該蛋白質(zhì)從宿主 細(xì)胞中釋放、離心和/或過(guò)濾以去除任何細(xì)胞碎片、在合適的層析柱上純化，并隨后通過(guò)過(guò) 濾方法濃縮。
[0043] 術(shù)語(yǔ)"收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液"，也表示為HCCF，意為已經(jīng)通過(guò)包括離心或過(guò)濾的方法 去除了細(xì)胞的原核或真核細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)是原核或真核細(xì)胞在可控條件下生長(zhǎng)的過(guò) 程。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞培養(yǎng)"指培養(yǎng)來(lái)源于多細(xì)胞真核生物（包括動(dòng)物細(xì)胞）或者單細(xì)胞原核生 物（包括細(xì)菌和酵母）的細(xì)胞。真核細(xì)胞培養(yǎng)物包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、 雜交瘤和昆蟲(chóng)細(xì)胞。使用合適的細(xì)胞培養(yǎng)容器，可以從依賴(lài)貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞系中獲得 分泌蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞或NSO細(xì)胞。
[0044] 在不限制的情況下，術(shù)語(yǔ)"收獲操縱"或"收獲"意為這樣的工藝，其包括裂解或勻 漿，然后離心和/或過(guò)濾發(fā)酵的經(jīng)轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，以產(chǎn)生重組目的蛋白質(zhì)，從 而開(kāi)始分離和純化所述目的蛋白質(zhì)。
[0045] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"Hi-d0"指如本文中所述的增強(qiáng)工藝，其中在收獲操作期間， 維持溶解氧水平在大于〇%。為此，本發(fā)明提出了可以用于維持ClO2水平處于或者高于設(shè)定 點(diǎn)（即大于〇%、或者處于約30%至約75%、或者處于大于75%的水平、或者處于約50%、 或者處于大于50%水平）的覆蓋氣體、反壓和攪拌速率的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本領(lǐng) 域技術(shù)人員還可以噴射氣體或純氧到培養(yǎng)基中，以直接實(shí)現(xiàn)溶解氧水平的Hi-d0大于0%。 [0046] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"勻漿"意為裂解或機(jī)械性細(xì)胞裂解用重組目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的 原核宿主細(xì)胞，以從宿主細(xì)胞中釋放所述蛋白質(zhì)的工藝。
[0047] 術(shù)語(yǔ)"增加的反壓"用于增加穿過(guò)培養(yǎng)基的氧轉(zhuǎn)移速率。反壓通常以psi或巴測(cè) 量。
[0048] "甲基萘醌（MK) "是維生素 K2同系物，并且在微氧和/或厭氧條件時(shí)，在膜結(jié)合蛋 白質(zhì)復(fù)合體之間的呼吸鏈中用作為電子穿梭分子。術(shù)語(yǔ)"menE"是制備甲基萘醌的生物合 成途徑中的基因。
[0049] 術(shù)語(yǔ)"微生物發(fā)酵"意為細(xì)胞培養(yǎng)基因工程細(xì)菌或酵母，以產(chǎn)生蛋白質(zhì)和小分子 (例如次級(jí)代謝產(chǎn)物）。發(fā)酵用于增殖重組細(xì)菌和酵母，以及其他微生物并產(chǎn)生有價(jià)值的蛋 白質(zhì)。通過(guò)供應(yīng)特定生長(zhǎng)培養(yǎng)基并控制多種環(huán)境因素（例如pH、溫度和通氣），最大化細(xì)胞 產(chǎn)率和這些生物的生長(zhǎng)。細(xì)菌發(fā)酵液可以來(lái)源于大腸桿菌培養(yǎng)物。
[0050] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指獲自基本上同質(zhì)的抗體群體（即，除可能存 在極少量的天然發(fā)生的突變外，群體包含的各個(gè)抗體是相同的）的抗體。單克隆抗體是高 度特異的，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與包括針對(duì)不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆 抗體制劑相反，每一單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除它們的特異性外，單克隆抗體 是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢院铣?，而不被其他抗體污染。修飾詞"單克隆"指抗體獲自基本上 同質(zhì)的抗體群體的特征，并且不應(yīng)理解為需要通過(guò)任意特定方法產(chǎn)生抗體。例如，可以通過(guò) 由Kohler等人（1975)Nature 256:495第一次描述的雜交瘤方法制備或者可以通過(guò)重組 DNA方法（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 816, 567)制備根據(jù)本發(fā)明所使用的單克隆抗體。"單克隆抗體" 還可以使用例如在 Clackson 等人（1991)Nature, 352:624-628 ;Marks 等人（1991) J. Mol. Biol.，222:581-597中所述的技術(shù)，分離自噬菌體抗體文庫(kù)。
[0051] 術(shù)語(yǔ)"覆蓋氣體"意為從含培養(yǎng)基的發(fā)酵罐的頂部吹送氣體。通常，通過(guò)在液體培 養(yǎng)基中產(chǎn)生氣泡，常常伴隨劇烈攪拌以實(shí)現(xiàn)良好的氣泡分散，來(lái)向發(fā)酵罐供氧。
[0052] 如本發(fā)明中所用，術(shù)語(yǔ)"原核宿主細(xì)胞"應(yīng)當(dāng)包括使用甲基萘醌生物合成途徑的那 些細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，原核宿主細(xì)胞包括，例如古細(xì)菌（Archaebacteria)和真細(xì)菌 (Eubacteria)，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物。有用的細(xì)菌的實(shí)例包括埃希氏菌屬（例 如，大腸桿菌）、芽孢桿菌屬（例如，枯草芽孢桿菌（B. subtilis))、腸桿菌屬、假單胞菌屬物 種（例如，銅綠假單胞菌（P. aeruginosa))、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium)、 粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescans)、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、志賀氏菌屬、根瘤菌 屬、透明顫菌屬或副球菌屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，將大腸桿菌細(xì)胞（Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol.2(Washington，D. C. !American Society for Microbiology, 1987)，pp. 1190-1219 ;ATCC|C藏號(hào) 27, 325)及其 衍生物，包括具有基因型 W3110 AfhuA(AtonA)ptr31acIq lacL8 ΔοηιρΤ A(nmpC-fepE) (1叫?411?1111?(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,639,635)的菌株3303用作為本發(fā)明的宿主。當(dāng)然，其他菌株及 其衍生物，例如大腸桿菌294仏了0：31，446)、大腸桿菌8、大腸桿菌入1776仏10：31，537) 和大腸桿菌RV308(ATCC 31，608)也是合適的。這些實(shí)例是說(shuō)明性的，而不是限制性的。用 于構(gòu)件具有定義的基因型的任一上述細(xì)菌的衍生物的方法是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例 如Bass等人（1990)Proteins，8:309-314中。當(dāng)然，選擇合適的細(xì)菌需要考慮復(fù)制子在細(xì) 菌細(xì)胞中的復(fù)制性。例如，當(dāng)將熟知的質(zhì)粒如PBR322、pBR325、pACYC177或ρΚΜΙΟ用于提 供復(fù)制子時(shí)，可以將大腸桿菌、沙雷氏菌屬或沙門(mén)氏菌屬物種合適地用作為宿主。
[0053] 如本文中所用，"重組蛋白質(zhì)"通常指包括抗體的肽和蛋白質(zhì)。此類(lèi)重組蛋白質(zhì)是 "異源的"，即對(duì)于所使用的宿主細(xì)胞是外來(lái)的，例如通過(guò)大腸桿菌產(chǎn)生的人蛋白質(zhì)。多肽可 以產(chǎn)生為不溶性聚集體或者周質(zhì)間隙或細(xì)胞質(zhì)中的可溶性多肽。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"獨(dú)立于規(guī)模的"意為本發(fā)明發(fā)酵工藝的體積容量可以使用任意規(guī)模實(shí)現(xiàn)，例 如如約1升或更大、或者約10升或更大、或者約100升或更大、或者約500升或更大、或者 約1，000升或更大、或者約10, 000升或更大、或者約100, 000升或更大。
[0055] II.實(shí)施本發(fā)明的方法
[0056] 本發(fā)明涉及在原核系統(tǒng)中重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法。本發(fā)明基于防止重組蛋白 質(zhì)生產(chǎn)期間發(fā)現(xiàn)的褐色加合物的形成，所述褐色加合物形成造成某些產(chǎn)物不符合規(guī)格。如 在本文中所提供的實(shí)施例中所示，褐色加合物問(wèn)題起因于收獲操作期間不一致的氧化還原 電勢(shì)。目前令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)在收獲操作期間維持溶解氧環(huán)境大于零或者備選地， 通過(guò)遺傳缺失用于重組產(chǎn)生重組目的蛋白質(zhì)的原核宿主細(xì)胞基因組中的menE基因，來(lái)防 止褐色加合物形成。
[0057] 原核細(xì)胞中重組蛋白質(zhì)的重組產(chǎn)生
[0058] 在上述方法的第一步中，將用于產(chǎn)生重組目的蛋白質(zhì)的異源核酸（例如，cDNA或 基因組DNA)合適地插入到可復(fù)制載體中以在細(xì)菌的合適啟動(dòng)子控制下在細(xì)菌中表達(dá)。對(duì) 于該目的，許多載體都是可用的，并且合適載體的選擇主要取決于待插入到載體中的核酸 的大小，以及用載體轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞。取決于載體的功能（DNA擴(kuò)增或者DNA表達(dá)）以 及與其相容的特定宿主細(xì)胞，每一載體含有多種組分。用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的載體組分包括用于 異源多肽的信號(hào)序列，并且包括信號(hào)序列，并且還包括用于異源多肽的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。如本 文中所用，它們通常還包括復(fù)制起點(diǎn)以及一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因。
[0059] 如果異源多肽是分泌的，那么編碼本文中異源目的多肽的DNA含有信號(hào)序列，例 如成熟異源多肽N-端的信號(hào)序列?？傊盘?hào)序列可以是載體的成分，或者其可以是插入 到載體中的異源多肽DNA的一部分。選擇的異源信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)是宿主細(xì)胞可以識(shí)別和加工 (即，通過(guò)信號(hào)肽酶切割）的信號(hào)序列。由于細(xì)菌宿主細(xì)胞不識(shí)別和加工天然的異源多肽信 號(hào)序列，所以通過(guò)任一熟知的細(xì)菌信號(hào)序列取代該信號(hào)序列。
[0060] 表達(dá)載體含有能使載體在一個(gè)或多個(gè)選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。在多種 細(xì)菌中含有此類(lèi)序列。來(lái)自質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性菌。
[0061] 表達(dá)載體通常還含有選擇基因，也稱(chēng)為選擇標(biāo)記。該基因編碼對(duì)在選擇培養(yǎng)基中 培養(yǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的存活或生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)。沒(méi)有用含選擇基因的載體轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中不會(huì)存活。一般的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，其（a)賦予對(duì)抗生 素或其他毒素，例如氨節(jié)青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素的抗性，（b)互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷,或 (c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不能得到的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌屬的D-丙氨酸消旋酶 的基因。選擇方案的一個(gè)實(shí)例使用藥物來(lái)阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些用異源基因成功轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞產(chǎn)生賦予抗藥性的蛋白質(zhì)，并因此在選擇方案中存活下來(lái)。
[0062] 用于產(chǎn)生異源多肽的表達(dá)載體還含有被宿主細(xì)菌生物識(shí)別的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，并 且其與編碼異源目的多肽的核酸是有效連接的。該表達(dá)載體還含有與編碼水解酶的核酸 有效連接的分離的可誘導(dǎo)或低基礎(chǔ)表達(dá)啟動(dòng)子。適合于細(xì)菌宿主使用的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子 包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)（Chang等人，Nature, 275:615(1978) ;Goeddel等 人，Nature, 281:544(1979))、阿拉伯糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，包括araBAD啟動(dòng)子（Guzman等人，J. Bacteriol. ,174:7716-7728(1992) ;Guzman 等人，J. Bacteriol. ,177:4121-4130(1995); Siegele 和 Hu, Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94:8168-8172(1997))、鼠李糖啟動(dòng)子 (Haldimann 等人，J. Bacteriol. ,180:1277-1286(1998))、（Haldimann 等人，J. Bacteriol.，180:1277-1286 (1998))、堿性磷酸酶啟動(dòng)子、色氨酸（trp)啟動(dòng)子系統(tǒng) (Goeddel，Nucleic Acids Res. ,8:4057 (1980)和 EP 36, 776)、P. sub. LtetO-I 和 P. sub. lac/are-1 啟動(dòng)子（Lutz 和 Bujard, Nucleic Acids Res.，25:1203-1210 (1997))，以及雜合 啟動(dòng)子如 tac 啟動(dòng)子。deBoer 等人，Proc.Nati.Acad. Sci.USA，80:21-25(1983)。然而，其 他已知的細(xì)菌可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和低基礎(chǔ)表達(dá)啟動(dòng)子也是合適的。已經(jīng)公布了它們的核苷酸序 列，從而使得技術(shù)人員可以使用提供任何所需限制位點(diǎn)的連接體或銜接子，將它們與編碼 異源目的多肽的DNA或者與編碼水解酶的核酸（Siebenlist等人，Cell，20:269 (1980))有 效連接。如果使用強(qiáng)的且高滲漏啟動(dòng)子（highly leaky promoter),如trp啟動(dòng)子，那么通 常僅用于表達(dá)編碼異源多肽的核酸，而不用于表達(dá)編碼水解酶的核酸?？梢詫ac和1\啟 動(dòng)子用于表達(dá)異源多肽和編碼水解酶的核酸之一，而不是二者的同時(shí)表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，將堿性磷酸酶（PhoA)啟動(dòng)子用于產(chǎn)物，并且將阿拉伯糖（ara)啟動(dòng)子用于水解酶。 [0063] 在細(xì)菌系統(tǒng)中使用的啟動(dòng)子通常還含有與編碼異源目的多肽的DNA有效連接的 Shine-Dalgarno (SD)序列?？梢酝ㄟ^(guò)限制酶消化，從細(xì)菌來(lái)源DNA中去除啟動(dòng)子，并插入到 含期望DNA的載體中。通過(guò)限制酶消化，可以將phoA啟動(dòng)子從細(xì)菌來(lái)源DNA中去除，并插 入到含期望DNA的載體中。
[0064] 含一個(gè)或多個(gè)上述組分的合適載體的構(gòu)建使用了本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)連 接技術(shù)。切割、修改分離的質(zhì)?；駾NA片段，并以期望的形式再連接，以產(chǎn)生所需的質(zhì)粒。 [0065] 如本文中所定義，用于要求專(zhuān)利保護(hù)的本發(fā)明的合適的原核宿主細(xì)胞包括使用生 物合成途徑來(lái)制備甲基萘醌的任何原核宿主細(xì)胞。一些非限制性實(shí)例包括，例如大腸桿菌、 腸桿菌屬、固氮菌屬、歐文氏菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、沙 門(mén)氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、根瘤菌屬、透明顫菌屬和副球菌屬。
[0066] 轉(zhuǎn)化意為將DNA作為染色體外元件或者通過(guò)染色體整合引入原核宿主中，以使 DNA可以復(fù)制。取決于所使用的宿主細(xì)胞，使用對(duì)于此類(lèi)細(xì)胞合適的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通 常將使用氯化鈣的鈣處理用于含堅(jiān)固的細(xì)胞壁屏障的細(xì)菌細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的另一方法使用 聚乙二醇/DMS0。還使用的另一技術(shù)是電穿孔。
[0067] 將用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞培養(yǎng)于本領(lǐng)域已知的并且適合用于選 定宿主細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。合適的培養(yǎng)基的實(shí)例包括添加了必需營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物的 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還含有選擇劑，基于構(gòu)建的表達(dá)載 體進(jìn)行選擇，以選擇性地允許含表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，將氨芐青霉素加入到用于 細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，所述細(xì)胞表達(dá)氨芐青霉素抗性基因。還可以以合適的濃度包括除碳、 氮和無(wú)機(jī)磷源之外的任何必需補(bǔ)充物，其可以單獨(dú)地或者以與另一補(bǔ)充物或培養(yǎng)基如復(fù)合 氮源的混合物的形式引入。
[0068] 對(duì)于表達(dá)基因產(chǎn)物的聚積，在足以聚積基因產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。此類(lèi)條 件包括例如，允許細(xì)胞表達(dá)和聚積蛋白質(zhì)的溫度、營(yíng)養(yǎng)和細(xì)胞密度條件。此外，如本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知，此類(lèi)條件是這樣的條件，在該條件下細(xì)胞可以進(jìn)行基本細(xì)胞功能，如轉(zhuǎn)錄、翻 譯，以及蛋白質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞區(qū)室進(jìn)入到另一用于分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞區(qū)室。
[0069] 在合適的溫度培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞。對(duì)于大腸桿菌培養(yǎng)，例如，一般的溫度為約20°C 至約39°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫度為約25°C至約37°C。在另一個(gè)實(shí)施方案中，溫度為約 30。。。
[0070] 主要取決于宿主生物，培養(yǎng)基的pH可以是約5-9的任一 pH。對(duì)于大腸桿菌，pH為 約6. 8至約7. 4,或者約7.0。
[0071] 對(duì)于誘導(dǎo)，通常培養(yǎng)細(xì)胞直到達(dá)到確定的光密度，例如約80-100的A55tl，在此時(shí)開(kāi) 始誘導(dǎo)（例如，通過(guò)添加誘導(dǎo)物，通過(guò)耗竭阻遏物、抑制劑或培養(yǎng)基組分等），以誘導(dǎo)編碼異 源多肽的基因的表達(dá)。
[0072] 產(chǎn)物聚積后，任選地在產(chǎn)物回收之前，將培養(yǎng)基裂解物溫育足夠的時(shí)間，以使細(xì)胞 中含有的異源多肽釋放。在備選的實(shí)施方案中，或者在前面的步驟之后，可以使用本領(lǐng)域已 知的任何機(jī)械方法（其可以包括例如化學(xué)裂解或滲透壓休克）機(jī)械地裂解培養(yǎng)物中存在的 細(xì)胞，以從宿主細(xì)胞中釋放所述蛋白質(zhì)。
[0073] -旦裂解，就將裂解物或勻漿轉(zhuǎn)移到貯料罐中，其中等待更多批次的裂解物/勻 漿的加入和/或其中發(fā)生進(jìn)一步的處理，例如如用水稀釋、添加緩沖液或絮凝劑、PH調(diào)整， 或者改變或維持用于后續(xù)回收步驟的制備物中裂解物/勻漿的溫度。
[0074] 在后續(xù)的步驟中，以最小化共回收的細(xì)胞碎片和產(chǎn)物的方式，從裂解物或勻漿中 回收異源多肽（例如釋放自細(xì)胞基質(zhì)的可溶性或不溶性產(chǎn)物）?？梢酝ㄟ^(guò)任何方法進(jìn)行回 收，但在一個(gè)實(shí)施方案中，可以包括沉降含異源多肽的可折射顆?；蛘呤占扇苄援a(chǎn)物 的上清液。沉降的實(shí)例是離心。因此，在膨脹床吸附（EBA)或者沉降之前，在破壞外層細(xì)胞 壁以增加滲透性并允許回收更多固體的試劑存在的情況下，進(jìn)行回收。此類(lèi)試劑的實(shí)例包 括螯合劑如乙二胺四乙酸（EDTA)或者兼性離子例如偶極離子去垢劑如ZWITTERGENT 316? 去垢劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，在EDTA存在的情況下進(jìn)行回收。
[0075] 如果將離心用于回收，相對(duì)離心力（RCF)是重要的因素。調(diào)整RCF，以最小化 裂解時(shí)細(xì)胞碎片與釋放自細(xì)胞壁的可折射顆粒的共沉降。用于該目的的具體RCF將依 據(jù)例如待回收產(chǎn)物的類(lèi)型改變，但至少為約3000 X g，更優(yōu)選地約3500-6000 X g或者約 4000-6000Xg〇
[0076] 離心的持續(xù)時(shí)間取決于幾個(gè)因素。沉降速率取決于例如可折射（retractile)顆 粒的大小、形狀和密度，以及液體的粘度。固體的沉淀時(shí)間取決于例如沉降距離和速率。期 望連續(xù)圓盤(pán)堆疊（disc-stack)離心可以良好地用于大規(guī)模回收釋放的異源多肽聚集體或 者用于去除細(xì)胞碎片是合理的，這是因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬?duì)大的離心力和相對(duì)小的沉降距離， 這些離心機(jī)可以以高液體速度進(jìn)行處理。
[0077] 然后可以從污染的蛋白質(zhì)中進(jìn)一步純化初始回收步驟中捕獲的異源多肽。在一個(gè) 實(shí)施方案中，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 288, 931中所公開(kāi)，分離聚集的異源多肽，然后同時(shí)進(jìn)行多肽 的增溶和再折疊。備選地，通過(guò)如下所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)回收可溶性產(chǎn)物。
[0078] -般的層析方法及其用途是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)例如， Chromatography, 5th edition, Part A:Fundamentals and Techniques,Heftmannj E. (ed)，Elsevier Science Publishing Company,New York, (1992) ；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences,Deylj Z. (ed. ), Elsevier Science BVj Amsterdam,The Netherlands, (1998) ；Chromatography Today,Poole,C.F.和 Poole，S.K.，Elsevier Science Publishing Company,New York, (1991) ;Scopes，Protein Purification Principles and Practice(1982)； Sambrookj J.,等人（ed)，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 或者 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelj F. M.,等人(eds), John Wiley&Sons，Inc.，New York。以下方法是用于從周質(zhì)或胞質(zhì)中釋放的可溶性異源多肽的合 適純化方法的示例，并且是本領(lǐng)域熟知的：免疫親和或離子交換柱上分級(jí)分離；乙醇沉淀； 反相HPLC ;二氧化硅上或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂例如DEAE上層析；層析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨 沉淀；以及使用例如SEPHADEX?G-75的凝膠過(guò)濾。
[0079] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)發(fā)酵方法大量進(jìn)行抗體產(chǎn)生。可將多種大規(guī)模分批發(fā) 酵方法用于重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選地約1，〇〇〇至 100, 000升的容量。這些發(fā)酵罐使用葉輪攪拌器分配氧和營(yíng)養(yǎng)物，特別是葡萄糖（優(yōu)選的碳 /能量源）。小規(guī)模發(fā)酵通常指在大約20升以下容量的發(fā)酵罐中的發(fā)酵。
[0080] 如本文中所討論，可將要求專(zhuān)利保護(hù)的本發(fā)明用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，包括例如肽 和蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包括抗體。
[0081] 可以通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的重組肽和蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于分子例如，腎 素、生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)激素釋放因子、甲狀旁腺激素、促甲狀腺 激素、脂蛋白、α 1-抗胰蛋白酶、胰島素 A-鏈、胰島素 B-鏈、胰島素原、血小板生成素、促 卵泡激素、降鈣素、黃體生成素、胰高血糖素、凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和 和von Willebrand因子、抗凝血因子如蛋白C、心房鈉尿肽（atrial naturietic factor)、 肺表面活性物質(zhì)、纖溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物（t-PA)、 蛙皮素、凝血酶、造血生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α和-β、腦啡肽酶、血清白蛋白如人血 清白蛋白、Muellerian抑制物質(zhì)、松弛素 A鏈、松弛素 B鏈、前松弛素（prorelaxin)、小鼠 促性腺激素相關(guān)肽、微生物蛋白質(zhì)，例如β-內(nèi)酰胺酶、DNase、抑制素、激活素、血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子（VEGF)、激素或生長(zhǎng)因子的受體、整聯(lián)蛋白、蛋白A或D、類(lèi)風(fēng)濕因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 因子，例如腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6 (N T-3、N T-4、 N T-5或N T-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-β、心肌營(yíng)養(yǎng)蛋白（心臟肥大因子）如心營(yíng)養(yǎng) 蛋白-I (CT-I)、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如aFGF和bFGF、表 皮生長(zhǎng)因子（EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF)，例如TGF- α和TGF- β，包括TGF- β I、TGF- β 2、TGF1 3、TGF1 4或 TGF-β 5、胰島素樣生長(zhǎng)因子 I 和 II(IGF-I 和 IGF-II)、 des (1-3) -IGF-I (腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白、CD蛋白，例如CD-3、CD-4、CD-8和 CD-19、促紅細(xì)胞生成素、骨誘導(dǎo)因子、免疫毒素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)、干擾素，例如干擾 素- α、-β和-γ、集落刺激因子（CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF、白細(xì)胞介素（IL)，例 如IL-I到IL-13、抗-HER-2抗體、超氧化物歧化酶、T細(xì)胞受體、表面膜蛋白、衰變（decay) 加速因子、病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、歸巢受體、地址素（adderssin)、 調(diào)節(jié)蛋白。
[0082] 通過(guò)要求專(zhuān)利保護(hù)的本發(fā)明產(chǎn)生的抗體可以是針對(duì)特定抗原決定簇（例如，癌細(xì) 胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白質(zhì)、肽、糖、化學(xué)物質(zhì)、核酸以及它們的片段）的同質(zhì)性 抗體群體的單克隆抗體?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)（其通過(guò)提供培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系 來(lái)產(chǎn)生抗體分子）制備針對(duì)目的靶標(biāo)的單克隆抗體（Mb)。這些技術(shù)包括但不限于，最初由 Kdhler和Milstein (1975) Nature 256:495-497描述的雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù) (Kozbor 等人（1983) Immunology Today 4:72)，以及 EBV-雜交瘤技術(shù)（Cole 等人（1985) 在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.，pp. 77-96 中）。此類(lèi) 抗體可以是任何免疫球蛋白種類(lèi)包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD，及其任何亞類(lèi)?？梢泽w外 或體內(nèi)培養(yǎng)在本發(fā)明中使用的產(chǎn)生Mab的雜交瘤。
[0083] 有用的單克隆抗體包括但不限于，人單克隆抗體、人源化單克隆抗體、抗體片段或 嵌合的人-小鼠（或其他物種）單克隆抗體?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任一種技術(shù)（Teng等人 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:7308-7312 ;Kozbor 等人（1983) Immunology Today 4:72-79;和 Olsson 等人（1982)Methods in Enzymology 92:3-16)制備人單克隆抗體。
[0084] 抗體還可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體具有一個(gè)臂中的雜合的免疫球蛋白 重鏈（具有第一結(jié)合特異性）和在另一臂中的雜合的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)（提供 第二結(jié)合特異性）。這種不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)有助于從不想要的免疫球蛋白鏈組合中分離期望的 雙特異性化合物，因?yàn)槊庖咔虻鞍纵p鏈在一半雙特異性分子中的存在提供了分離的方便 方法（W0 94/04690 ;Suresh 等人（1986)Methods in Enzymology, 121:210 ;Rodrigues 等人（1993)J. of Immunology 151:6954-6961 ;Carter 等人（1992)Bio/Technology 10:163-167 ;Carter 等人（1995) J. of Hematotherapy 4:463-470 !Merchant 等人（1998) Nature Biotechnology 16:677-681)。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的 (Milstein 等人（1983)Nature 305:537-539 ;W0 93/08829 Jraunecker 等人（1991)EMB0 J. 10:3655-3659)。使用此類(lèi)技術(shù)，可以將雙特異性抗體綴合為抗體藥物綴合物（ADC)，其治 療或預(yù)防如本文中所定義的疾病。
[0085] 所定義的抗體可以是與癌細(xì)胞抗原、病毒抗原或微生物抗原免疫特異地結(jié)合 的抗體的有功能的活性片段、衍生物或類(lèi)似物或者是與腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)結(jié)合抗體。在 這點(diǎn)上，"有功能的活性"意為片段、衍生物或類(lèi)似物能引發(fā)識(shí)別相同抗原的抗-抗獨(dú)特 型抗體，所述抗原是抗體、衍生物或類(lèi)似物所衍生的。特別地，在示例性實(shí)施方案中，通 過(guò)缺失構(gòu)架區(qū)和CDR序列可以增強(qiáng)免疫球蛋白分子的獨(dú)特型的抗原性，所述CDR序列 是特異性識(shí)別抗原的CDR序列的C-端。為了確定哪個(gè)CDR序列結(jié)合抗原，可以通過(guò)本 領(lǐng)域已知的任何結(jié)合測(cè)定法，例如BIA core測(cè)定法（Kabat等人，（1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health，Bethesda，Md. ;Kabat 等人（1980)J.of Immunology 125(3):961_969)，使用抗原， 將合成的含CDR序列的肽用于結(jié)合測(cè)定法。
[0086] 其他有用的抗體包括抗體的片段，例如但不限于F(ab' )2片段，其含有可變區(qū)、 輕鏈恒定區(qū)和可以通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的重鏈的CHl結(jié)構(gòu)域，以及可以通過(guò) 減少F(ab' ) 2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。其他有用的抗體是抗體的重鏈和輕鏈，或 者其最小片段如Fvs或單鏈抗體（SCA)(例如，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No. 4, 946, 778 ;Bird(1988) Science 242:423-42 ;Huston 等人，（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:5879-5883 ;和 Ward等人（1989)Nature 334:544-54中所述），或者具有與抗體相同特異性的任何其他分 子。
[0087] 抗體可以是抗體的融合蛋白質(zhì)或者其有功能的活性片段，例如其中抗體通過(guò)共價(jià) 鍵（例如，肽鍵）在N-端或C-端與非抗體的另一蛋白質(zhì)（或其部分，例如蛋白質(zhì)的至少10 個(gè)、20個(gè)或50個(gè)氨基酸部分）的氨基酸序列融合?？贵w或其片段可以在恒定域的N-端與 其他蛋白質(zhì)共價(jià)連接。
[0088] 在本文中，單克隆抗體包括"嵌合"抗體以及此類(lèi)抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出期 望的生物學(xué)活性，在嵌合抗體中重鏈和/或輕鏈部分與來(lái)源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種 類(lèi)或亞類(lèi)的抗體中相應(yīng)的序列相同或同源，而鏈的剩余部分與來(lái)源于其他物種或?qū)儆诹硪?抗體種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的相應(yīng)序列相同或同源（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 816, 567 ;和Morrison等人 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，81:6851-6855)。嵌合抗體是這樣的分子，其中不同部 分來(lái)源于不同的動(dòng)物物種，例如具有來(lái)源于鼠單克隆的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)那些 嵌合抗體（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 816, 567 ;4, 816, 397)。嵌合抗體包括"靈源化的（primatized) " 抗體，其包括來(lái)源于非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物（例如，舊世界猴（Old World Monkey)、類(lèi)人猿等）可 變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
[0089] 可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備包含人類(lèi)和非人部分的嵌合和人源化單克隆 抗體（(WO 87/02671 ;EP 184, 187 ;EP 171496 ;EP 173494 ;W0 86/01533 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4,816,567 ;EP 12023 ;Berter 等人（1988)Science 240:1041-1043 ;Liu 等人（1987) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A. 84:3439-3443 ;Liu 等人（1987) J. Immunol. 139:3521-3526 ; Sun 等人（1987)Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A. 84: 214-218 ;Nishimura 等人（1987) Cancer. Res. 47:999-1005 ;Wood 等人（1985) Nature 314:446-449 ;和 Shaw 等人（1988) J.Natl. Cancer Inst.80:1553-1559 ;Morrison(1985)Science 229:1202-1207 ;0i 等 人（1986)BioTechniques 4:214 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5,225,539 Jones 等人（1986)Nature 321:552-525 ;Verhoeyan 等人（1988)Science 239:1534;和 Beidler 等人（1988) J. Immunol. 141:4053-4060 ;所述每一文獻(xiàn)在此處以其整體并入本文作為參考）。
[0090] 可以通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的治療性單克隆抗體包括但不限于，曲妥珠單 抗（HERCEPTIN?, Genentech，Inc. ,Carter 等人（1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，89:4285-4289 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 725, 856);抗-CD20 抗體如嵌合的 抗-CD20"C2B8"（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 736, 137);利妥昔單抗（RITUXAN? ) > ocreIizumab、 2H7抗體的嵌合或人源化變體（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5, 721，108 ;W0 04/056312)或托西莫單抗 (BEXXAR?);抗-IL-8(St John 等人（1993)Chest，103:932,和 WO 95/23865);靶 向其他白介素的抗體，例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、 IL-13 ;抗-VEGF抗體包括人源化和/或親和力成熟的抗-VEGF抗體如人源化抗-VEGF抗體 huA4. 6. 1 貝伐單抗（AVASTIN?，Genentech, Inc.，Kim 等人（1992)Growth Factors 7:53-64、WO 96/30046、W0 98/45331);抗-PSCA 抗體（W0 01/40309);抗-CD40 抗體，包括 S2C6 及其人源化變體（W0 00/75348);抗-CDlla(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 622, 700 ;W0 98/23761 ; Steppe 等人(1991)Transplant Inti. 4:3-7 ;Hourmant 等人(1994)Transplantation 58:377-380);抗-IgE (Presta 等人（1993)J. Immunol. 151:2623-2632 ;W0 95/19181); 抗-CD18 (美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 622, 700 ;W0 97/26912);抗-IgE，包括 E25、E26 和 E27 (美國(guó) 專(zhuān)利號(hào) 5, 714, 338 ;5, 091，313 ;W0 93/04173 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 714, 338);抗-Apo-2 受 體抗體（W0 98/51793);抗-TNF- α 抗體包括 CA2 ( REMICADE? )、CDP571 和 MAK-1%(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 672，：M7 ;Lorenz 等人（1"6)J· Immunol. 156(4) : IM6-I653 ; Dhainaut 等人（1995)Crit. Care Med. 23(9):1461-1469);抗-組織因子（TF) (EP 0 420 937 BI);抗-人 α 4 β 7 整聯(lián)蛋白（W0 98/06248);抗-EGFR、嵌合的或 人源化225抗體（TO 96/40210);抗-CD3抗體如0ΚΤ3(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4, 515, 893); 抗-CD25 或抗-tac 抗體如 CHI-621 SIMULECT?:和 ΖΕΝΑΡΑΧ? (美國(guó) 專(zhuān)利號(hào) 5,693,762);抗-CD4 抗體如 cM-7412 抗體（Choy 等人（1996)Arthritis Rheum 39(1):52-56);抗-CD52 抗體如 CAMPATH-1H(Riechmann 等人（1988)Nature 332:323-337);抗-Fe受體抗體如靶向Fe γ RI的M22抗體，如在Graziano等人（1995) J. Immunol. 155 (10) : 4996-5002 中；抗-癌胚抗原（CEA)抗體如 hMN-14 (Sharkey 等 人（1995)Cancer Res. 55(23Suppl) :5935s-5945s ;靶向乳腺上皮細(xì)胞的抗體包括 hufcE-3、hu-Mc 3 和 CHL6 (Ceriani 等人（1995) Cancer Res. 55(23) :5852s-5856s; 和 Richman 等人（1995) Cancer Res. 55 (23Supp): 5916s_5920s);與結(jié)腸癌細(xì)胞結(jié)合的 抗體如 C242 (Litton 等人（1996) Eur J. Tmmunol. 26 (I) : 1-9);抗-CD38 抗體，例如 AT 13/5 (Ellis 等人（1995) J. Immunol. 155 (2) :925-937);抗-CD33 抗體如 Hu M195 (Jurcic 等人（1995)Cancer Res 55(23Suppl) :5908s-5910s 和 CMA-676 或 CDP771 ;抗-CD22 抗 體如 LL2 或 LymphoCide (Juweid 等人（1995) Cancer Res 55 (23Suppl) :5899s_5907s); 抗-EpCAM抗體如17-1A ( PANOREX⑧）；抗-GpIIb/IIIa抗體如阿昔單抗或 c7E3Fab ( REOPRO? );抗-RSV 抗體如 MEDI-493 ( SYNAGIS? );抗-CMV 抗 體如（PROTOV1R? );抗-Hiv抗體如PR0542 ;抗-肝炎抗體如抗-H印B抗體 (OSTAVIR? );抗-CA 125抗體OvaRex ;抗-獨(dú)特型⑶3表位抗體BEC2 ;抗-人腎細(xì) 胞癌抗體如ch-G250 ;ING-1 ;抗-人17-1A抗體（3622W94);抗-人結(jié)直腸腫瘤抗體（A33); 靶向GD神經(jīng)節(jié)苷脂的抗-人黑素瘤抗體R24;抗-人鱗狀細(xì)胞癌（SF-25);和抗-人白細(xì)胞 抗原（HLA)抗體如 Smart IDlO 和抗-HLA DR 抗體 Oncolym(Lym-I)。
[0091] III.方法和測(cè)定法
[0092] 分析方法/測(cè)定法
[0093] 澄清度、乳濁度和顯色（COC)測(cè)定法
[0094] 考慮到均一的乳濁溶液和懸浮液的亞顯微光密度，還可以通過(guò)吸收光或散射光的 儀器測(cè)量來(lái)測(cè)定乳濁的程度。此類(lèi)技術(shù)是濁度測(cè)定法和比濁法。對(duì)于有色樣品的濁度測(cè) 量，使用比率比濁法和具有比率選擇的濁度測(cè)定法。可以通過(guò)觀察透射光（比濁法）或散 射光（濁度測(cè)定法），測(cè)量懸浮顆粒的光散射效應(yīng)。比率比濁法組合了濁度測(cè)定法和比濁法 的原理。對(duì)于測(cè)量稍乳濁的懸浮液，比濁法和濁度測(cè)量法是有用的。必須使用在明確限定 的條件下產(chǎn)生的參照懸浮液。對(duì)于確認(rèn)合適的顏色分配，在U.S. Pharmacopeia 2012 (USP Monograph 631, Color and Achromicity)中或 European Pharmacopoeia 5. 0 (EP Method 2. 2. 2, Degree of Coloration of Liquids)中列舉了標(biāo)準(zhǔn)比色溶液。對(duì)于定量測(cè)量，校 準(zhǔn)曲線的構(gòu)建是必需的，因?yàn)閼腋∫旱墓鈱W(xué)特性與分散相的濃度之間的關(guān)系最好是半經(jīng)驗(yàn) 的。使用比率比濁度或具有比率選擇的濁度測(cè)定法進(jìn)行有色液體濁度的測(cè)定，因?yàn)轭伾?供了負(fù)干涉，減弱了入射光和散射光，并且降低了濁度值。對(duì)于不能使用常規(guī)濁度計(jì)的中等 有色樣品，該影響是非常大的。澄清度和乳濁度的儀器評(píng)估提供了更易區(qū)分的測(cè)試，其不再 取決于分析者的視敏度。對(duì)于質(zhì)量監(jiān)測(cè)和工藝控制，特別是在穩(wěn)定性研究中，數(shù)值結(jié)果是更 有用的。例如，可以參照以前的穩(wěn)定性數(shù)值數(shù)據(jù)，以測(cè)定給定批次的劑量制劑或者活性藥物 成分是否會(huì)在有效期之前超出貯藏期限限制。
[0095] HPLC 測(cè)定法
[0096] 高效液相層析（也稱(chēng)為高壓液相層析，簡(jiǎn)稱(chēng)為HPLC)是液相層析的特殊形式，并且 目前廣泛用于生物化學(xué)和分析化學(xué)。在高壓下，使分析物在液體（流動(dòng)相）中通過(guò)固定相 的柱子，所述液體減少了分離的組分保留在固定相上的時(shí)間，以及因此它們必須在柱中擴(kuò) 散的時(shí)間。這導(dǎo)致得到的層析譜中更窄的峰，并因此與LC相比較更好的分辨率和靈敏度。 選擇流動(dòng)相，以確保樣品溶質(zhì)的溶解性。對(duì)于固定相，優(yōu)選使用微粒狀二氧化硅（裸露的或 化學(xué)修飾的），因?yàn)槠浯蟊砻娣e增強(qiáng)了溶質(zhì)-固定相相互作用之間的差異。使用相對(duì)于溶質(zhì) 流動(dòng)相相互作用而言，與溶質(zhì)強(qiáng)相互作用的流動(dòng)相導(dǎo)致了非常長(zhǎng)的停留時(shí)間，這種情況在 分析上是沒(méi)有用的。因此，必須選擇固定相，以提供相對(duì)于流動(dòng)相中的那些溶質(zhì)而言，弱至 中等的溶質(zhì)相互作用。結(jié)果，溶質(zhì)性質(zhì)決定了所選擇的LC的類(lèi)型。在流動(dòng)相中應(yīng)當(dāng)發(fā)生更 強(qiáng)的相互作用，以確保樣品溶解性并且便于洗脫，而固定相應(yīng)當(dāng)響應(yīng)溶質(zhì)間更細(xì)微的差異。 例如，使用極性流動(dòng)相以及非極性固定相（其區(qū)分溶質(zhì)分散特征的細(xì)微差異）通?？梢愿?好地分析極性中性化合物。HPLC的一個(gè)強(qiáng)大方面是可以變化流動(dòng)相來(lái)改變停留機(jī)制?？梢?將修飾劑加入流動(dòng)相，以控制停留。例如，PH是含水流動(dòng)相中重要的變量。
[0097] 反相層析（RP-HPLC)要求使用非極性固定相和極性流動(dòng)相（含一種或多種極性溶 齊U，例如水、甲醇、乙腈和四氫呋喃）。
[0098] 疏水相互作用層析（HIC)HPLC :該層析方法可以很好地用于分析基于其疏水性的 蛋白質(zhì)或抗體/蛋白質(zhì)生物綴合物。疏水相互作用層析的原理是通過(guò)使用含水的高鹽流動(dòng) 相使蛋白質(zhì)與樹(shù)脂結(jié)合。鹽條件有助于易溶作用，其允許蛋白質(zhì)與較低表面覆蓋度的疏水 配體結(jié)合。通過(guò)降低鹽濃度的簡(jiǎn)單技術(shù)洗脫蛋白質(zhì)。大多數(shù)治療性靶標(biāo)都在低鹽或無(wú)鹽緩 沖液中洗脫。因此，可以在更極性并且較少變性的環(huán)境中洗脫化合物。例如，已經(jīng)將HIC廣 泛地用于分析抗體-藥物或蛋白質(zhì)-藥物綴合物的載藥量。
[0099] NMR測(cè)定法
[0100] 核磁共振（NMR)檢測(cè)基于某些核具有奇數(shù)質(zhì)子（mass)包括H和13C，以隨機(jī)方式 繞軸旋轉(zhuǎn)的事實(shí)。然而，當(dāng)放置在強(qiáng)磁體的極點(diǎn)之間時(shí)，旋轉(zhuǎn)與磁場(chǎng)平行或者反平行排列， 其中平行方向是有利的，因?yàn)槠淠芰可晕⒏汀Ｈ缓?，用電磁輻射照射核，電磁輻射被吸?并使平行的核置于更高的能級(jí)；因此，它們現(xiàn)在與輻射處于"共振"。由于分子中的全部核都 被電子云圍繞，所述電子云改變了所包圍的磁場(chǎng)，并從而改變了吸收頻率，取決于H或C的 位置以及鄰近分子或者化合物中的元素，每一 H或C產(chǎn)生不同的光譜。
[0101] 質(zhì)譜法
[0102] 質(zhì)譜法是用于測(cè)量離子的質(zhì)荷比（m/z或m/q)的分析技術(shù)。通過(guò)產(chǎn)生表示樣品組 分的質(zhì)量的質(zhì)譜法，其最常用于分析物理樣品的組成。該技術(shù)具有幾個(gè)應(yīng)用，包括通過(guò)化合 物和/或其片段的質(zhì)量鑒定未知化合物、測(cè)定化合物中一種或多種元素的同位素組成、通 過(guò)觀察化合物的斷裂測(cè)定化合物的結(jié)構(gòu)、使用精心設(shè)計(jì)的方法定量樣品中化合物的量（質(zhì) 譜法本身并不是定量的）、研究氣相離子化學(xué)（真空中離子和中子的化學(xué)）的原理，以及使 用多種其他方法測(cè)定化合物的其他物理、化學(xué)或者甚至生物學(xué)特性。
[0103] 質(zhì)譜儀是用于質(zhì)譜的設(shè)備，并且其產(chǎn)生了樣品的質(zhì)譜，以分析其組成。這通常通過(guò) 離子化樣品并分離不同質(zhì)子的離子，并且通過(guò)測(cè)量離子流的強(qiáng)度記錄器相對(duì)豐度來(lái)實(shí)現(xiàn)。 一般的質(zhì)譜儀包含三部分：離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器。
[0104] 離子源的類(lèi)型是強(qiáng)烈影響可以通過(guò)質(zhì)譜分析的樣品類(lèi)型的關(guān)鍵因素。將電子電離 和化學(xué)電離用于氣體和蒸汽。在化學(xué)電離源中，通過(guò)化學(xué)電離源中碰撞期間化學(xué)離子-分 子反應(yīng)電離分析物。通常將兩種技術(shù)用于液體和固體生物學(xué)樣品，包括電噴射離子化（ESI) 和基質(zhì)輔助激光解析/離子化（MLDI)。其他技術(shù)包括快速原子轟擊（FAB)、熱噴霧、大氣 壓化學(xué)電離（APCI)、次級(jí)離子質(zhì)譜（SIMS)和熱電離。
[0105] UV光譜學(xué)
[0106] 紫外-可見(jiàn)光譜法或紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV-Vi s或UV/Vi s)指紫外-可見(jiàn)光 譜區(qū)中的吸收光譜法或反射光譜法。其意為它使用可見(jiàn)和鄰近（近-UV和近-紅外（NIR)) 范圍中的光線?？梢?jiàn)范圍中的吸收或反射直接影響所涉及化學(xué)物質(zhì)的感知顏色。在該區(qū)域 的電磁波譜中，分子經(jīng)歷了電子躍遷。該技術(shù)與熒光光譜學(xué)互補(bǔ)，因?yàn)闊晒馓幚韽募ぐl(fā)態(tài)至 基態(tài)的躍遷，而吸收測(cè)量了從基態(tài)至激發(fā)態(tài)的躍遷。UV分光光度計(jì)是使用來(lái)自可見(jiàn)和/或 UV光源（著色成紅色（colored red))的光束的儀器，所述可見(jiàn)和/或UV光源通過(guò)棱鏡或 衍射光柵分離成其組分的波長(zhǎng)。每一單色（單一波長(zhǎng)）光線通過(guò)半透明反光鏡裝置依次分 裂成兩個(gè)等同強(qiáng)度的光束。一束光線（樣品光線（著色成紅紫色））穿過(guò)小透明容器（比 色杯），其含有透明溶劑中存在的待研究化合物的溶液。另外的一束光線（參照（著色成藍(lán) 色））穿過(guò)僅含有溶劑的相同比色杯。然后通過(guò)電子檢測(cè)器測(cè)量這些光束的強(qiáng)度，并進(jìn)行比 較。將應(yīng)當(dāng)具有很小的光吸收或者無(wú)光吸收的參照光線的強(qiáng)度定義為10。將樣品光束的強(qiáng) 度定義為I。短時(shí)間后，分光光度計(jì)自動(dòng)以所述方式自動(dòng)掃描全部組分波長(zhǎng)。掃描的紫外 (UV)區(qū)域通常為200至400nm，并且可見(jiàn)部分為400至800nm。
[0107] IV.實(shí)施例
[0108] 以下是本發(fā)明的方法和組合物的實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解，考慮到以上提供的一般說(shuō)明，可 以實(shí)踐多種其他實(shí)施方案。
[0109] 實(shí)施例1 :加合物檢測(cè)
[0110] 在產(chǎn)生特定重組蛋白質(zhì)期間，產(chǎn)生了 7個(gè)用于儲(chǔ)存的經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物（FBS)，其中 7個(gè)中的5個(gè)儲(chǔ)備物獲得了針對(duì)產(chǎn)品外觀標(biāo)準(zhǔn)的一般結(jié)果。根據(jù)生產(chǎn)說(shuō)明，產(chǎn)物特異性測(cè)試 需要使用黃（Y)色系列，通過(guò)COC測(cè)定法評(píng)價(jià)產(chǎn)物樣品，所述COC測(cè)定法是用于測(cè)定澄清度 /乳濁度、顯色度和外觀的方法。然而，兩個(gè)儲(chǔ)備物（Run 2和3)呈現(xiàn)為褐色，并且不滿足 COC測(cè)定法期望的彡Y7的黃色系列顏色標(biāo)準(zhǔn)。圖1中顯示了 Run 1-3的COC結(jié)果的比較。 為了研究該差異，進(jìn)一步濃縮了 7個(gè)FBS樣品，以增加顏色的強(qiáng)度。針對(duì)U. S. Pharmacopeia 2012 (USP Monograph 631,Color and Achromicity)中和 European Pharmacopoeia 5. 0(EP Method 2. 2. 2, Degree of Coloration of Liquids)中的全部標(biāo)準(zhǔn)比色溶液比較 了濃縮的樣品，以確認(rèn)合適的顏色分配。制備參照樣品后，將樣品在漫射自然光（diffused daylight)中比較5分鐘，針對(duì)黑色背景垂直觀察。光的漫射必須使參照樣品I可以容易地 與水區(qū)分，并且參照懸浮液II可以容易地與參照懸浮液I區(qū)分。當(dāng)在上述條件下檢查時(shí)， 如果液體的澄清度與水R或者所使用的溶劑的澄清度相同，或者如果液體的乳濁度不比參 照樣品I的乳濁度更顯著，那么認(rèn)為液體是澄清的。
[0111] 由于Run 2和3的著色原因未知，所以完成了多個(gè)調(diào)查研究，以測(cè)定非典型性褐 色的來(lái)源和原因。分析了來(lái)自Run 1-3的樣品中的金屬、痕量元素（除金屬以外）和生色 團(tuán)。這些研究顯示，Run 2和3中觀察到的顯色并不歸因于金屬或其他痕量元素（數(shù)據(jù)未 顯示）。
[0112] 為了測(cè)定生色團(tuán)是否與FBS中觀察到的不期望顏色相關(guān)，使用具有Icm路徑比色 杯，用紫外和可見(jiàn)（UV/vis)光譜學(xué)分析Run 1-3。對(duì)于所分析的樣品，UV光譜（200-600nm) 并沒(méi)有顯示出任何顯著差異。
[0113] 為了增加 UV分光光度計(jì)的靈敏度，使用IOcm路徑比色杯重復(fù)了實(shí)驗(yàn)。由于樣品 的吸光度與分光光度計(jì)計(jì)量光束（meter light beam)中吸收分子的數(shù)量成比例，所以IOcm 比色杯相對(duì)于Icm比色杯提供了增加的靈敏度。在200-700nm之間掃描樣品，以測(cè)定Run 1-3的吸收光譜。Run 2和3的光譜形狀與Run 1不同：大約在320nm和460nm處觀察到 了新的吸收峰，其在Run 1并不明顯（圖2A)。當(dāng)將Run 3的光譜減去Run 1的光譜時(shí)，該 差異可以更清楚地觀察到（圖2B)。Run 2和3在460nm處觀察到的峰與黃素（例如，維生 素）指紋圖譜一致。
[0114] 基于IOcm UV/vis結(jié)果，在來(lái)自Run 1-3的FBS上進(jìn)行了可選擇進(jìn)行MS檢測(cè)的 RP-HPLC和IEC全光譜分析。
[0115] 使用RP-HPLC的全光譜檢測(cè)，Run 1-3都沒(méi)有觀察到色譜差異（數(shù)據(jù)未顯示）。然 而，對(duì)于310nm處的IEC，觀察到了較小差異。如圖3中所示，Run 2和3觀察到了主峰后面 的小峰，而Run 1的圖譜與參照物質(zhì)類(lèi)似。
[0116] 將完整的樣品進(jìn)行2D LC-MS，并在280nm和310nm處監(jiān)測(cè)。2D LC-MS分析由兩部 分組成-第一維（dimension)通過(guò)RP-HPLC分離，并且第二維分級(jí)的峰用于質(zhì)譜分析。根 據(jù)該實(shí)驗(yàn)，觀察到了 Run 1的期望質(zhì)量，并且觀察到了 Run 2和3的期望質(zhì)量和大約+157Da 的其他質(zhì)量（圖4)。
[0117] 實(shí)施例2 :加合物的說(shuō)明
[0118] 為了更好地說(shuō)明加合物，選擇Run 3用于分級(jí)分離（收集來(lái)自IEC測(cè)定法的較小 峰（圖3))并進(jìn)一步通過(guò)2D-LC MS以及使用MS檢測(cè)得到的胰蛋白酶肽圖進(jìn)行質(zhì)量鑒定來(lái) 分析該加合物。
[0119] 根據(jù)2D LC-MS分析（圖5)，除期望的質(zhì)量外，再次觀察到針對(duì)分級(jí)的肩峰的大約 +156Da質(zhì)量增加。基于樣品的在線還原（使用DTT)，觀察到了期望的減少的質(zhì)量。在還原 的和天然的分析物之間觀察都的4個(gè)額外的道爾頓歸因于二硫鍵的破壞以及4個(gè)氫的添 力口。再次觀察到額外的質(zhì)量表明修飾是不可逆的或者共價(jià)的。
[0120] 根據(jù)胰蛋白酶肽圖，在214nm和3IOnm處收集樣品。如圖6中所示，在45-55分鐘區(qū) 域中新的峰是增強(qiáng)的。LC-MS-MS分析48. 8分鐘310nm處觀察到的新峰測(cè)定為+154. 006Da 的具有修飾的半胱氨酸殘基的T20肽。通過(guò)質(zhì)量提取還檢測(cè)到了修飾的（在半胱氨酸處， +154. 006Da)和未修飾的T6和T16肽。沒(méi)有檢測(cè)到還原的T21或修飾的T21，但這可能歸 因于低水平存在。當(dāng)與參照比較時(shí)，在洗脫50至56分鐘之間310nm處觀察到的其他兩個(gè) 峰并不含有任何獨(dú)特種類(lèi)。
[0121] 收集了 ID和2D IH NMR分析，以測(cè)定加合物結(jié)構(gòu)。使用TOSCY(Total Correlation Spectroscopy)、HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)、HMBC (HeteronucIear Multiple Bond Correlation)和 ROESY(Rotating-frame Overhauser Effect Spectroscopy (nOe))獲取了其他數(shù)據(jù)。
[0122] TOCSY產(chǎn)生了相互偶聯(lián)的全部質(zhì)子與給定旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)內(nèi)全部其他質(zhì)子之間的相關(guān) 性。HSQC實(shí)驗(yàn)使直接結(jié)合的核（即兩種類(lèi)型的化學(xué)原子核）的化學(xué)位移相互關(guān)聯(lián)，而HMBC 實(shí)驗(yàn)使通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵相互分離的兩種類(lèi)型核化學(xué)位移相互關(guān)聯(lián)。ROESY應(yīng)用使用 空間的n〇e，而不通過(guò)化學(xué)鍵來(lái)確認(rèn)精確的分子構(gòu)型（即，分子的三維結(jié)構(gòu)）。收集的肽在 182ppm觀察到了芳香族（苯醌）質(zhì)子與C = O之間的長(zhǎng)距離1H-13C偶聯(lián)。收集的肽在芳 香族區(qū)域中的1H-13C HSQC化學(xué)位移與合成的模式化合物中觀察到的那些1H-13C HSQC化 學(xué)位移相當(dāng)匹配，該合成的模式化合物與萘-1，4-二酮（dione)結(jié)合。TOCSY指定了產(chǎn)物 中的Q、V和R共振。如圖7中所述，產(chǎn)物的1H-15N HSQC數(shù)據(jù)與合成肽（NH2-IVQCR-C00H) 的比較顯示了產(chǎn)物中Cys NH相關(guān)性的缺失。通過(guò)Cys的CH與Arg的NH之間觀察到的強(qiáng) nOe確認(rèn)了提出的結(jié)構(gòu)（圖8)。基于收集的NMR數(shù)據(jù)，圖9中顯示了推測(cè)的結(jié)構(gòu)。
[0123] 基于MS、NMR和遺傳數(shù)據(jù)，鑒定形成褐色重組蛋白質(zhì)加合物的有色種類(lèi)為1，4-二 羥基-2-萘甲酸（DHNA)。NMR數(shù)據(jù)確認(rèn)DHNA通過(guò)半胱氨酸殘基與重組蛋白質(zhì)連接。DHNA 是來(lái)源于大腸桿菌細(xì)胞的甲基萘醌生物合成途徑的產(chǎn)物（圖10)。甲基萘醌存在于大腸桿 菌中，但當(dāng)培養(yǎng)物處在厭氧和/或微氧條件中時(shí)，其產(chǎn)量是增加的。甲基萘醌在有限的氧環(huán) 境中用于電子傳遞，并且在厭氧（微氧）條件中用于將形成二硫鍵的蛋白質(zhì)DsbB轉(zhuǎn)變成活 化的氧化狀態(tài)。
[0124] 實(shí)施例3 :減少DHNA-產(chǎn)物加合物形成的Hi-dO工藝
[0125] 研發(fā)了控制策略，以防止產(chǎn)物的游離巰基產(chǎn)生，以及隨后DHNA-產(chǎn)物加合物的形 成。確認(rèn)了顏色形成的原因是由于收獲操作期間低氧化還原環(huán)境，因?yàn)镽un2和3顯示出最 高的滴度和細(xì)胞密度、為了稀釋勻漿，進(jìn)行了較長(zhǎng)的保持時(shí)間、為了使勻漿達(dá)到15°C以下的 靶溫度，持續(xù)了較長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間，并且具有亞最佳勻漿混合時(shí)間和速率（數(shù)據(jù)未顯示）。這 些因素有助于產(chǎn)生低氧環(huán)境，所述低氧環(huán)境促進(jìn)了產(chǎn)物二硫鍵的還原，并允許了 DHNA與蛋 白質(zhì)產(chǎn)物的游離巰基連接的可能。
[0126] 由于DHNA-蛋白質(zhì)加合物是在產(chǎn)生還原性二硫鍵（即游離巰基）的收獲操作期 間，在低氧化還原環(huán)境中形成的，所以研發(fā)了防止游離巰基產(chǎn)生以及DHNA-蛋白質(zhì)加合物 形成的方法。這種增強(qiáng)的工藝控制（稱(chēng)為Hi-dO)在收獲操作中使溶解的氧水平維持大于 零（>〇%)，以消除還原環(huán)境（即沒(méi)有游離巰基產(chǎn)生）。
[0127] DHNA-蛋白質(zhì)加合物的形成是復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)，其需要發(fā)酵和收獲操作期間多 個(gè)事件的組合。發(fā)酵工藝的產(chǎn)出是相當(dāng)水平的和/或可利用的DHNA的產(chǎn)生。以下示意圖 顯示了一般收獲操作的三個(gè)主要階段：發(fā)酵后階段、勻漿階段，然后是勻漿后階段。
【權(quán)利要求】
1. 產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，其包括（a)發(fā)酵原核宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)用編碼所述重組 蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和（b)在溶解氧（d02)水平大于0%的條件下收獲所 述重組蛋白質(zhì)，以及（c)將所述重組蛋白質(zhì)純化成用于儲(chǔ)存的經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物（FBS)，其中 通過(guò)分析測(cè)定法如離子交換層析（IEC)測(cè)定法在310nm處所測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不 含可檢測(cè)的1，4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA)-重組蛋白質(zhì)加合物。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述分析測(cè)定法是HPLC、RP HPLC、HIC HPLC、NMR、質(zhì)譜法 或UV光譜學(xué)。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述d02在所述步驟（b)的收獲操作中持續(xù)維持在大于0% 的水平。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述收獲操作包括勻漿階段。
5. 權(quán)利要去4的方法，其中所述d02在勻漿之前維持在約30%至約75%。
6. 權(quán)利要求4的方法，其中所述d02在勻漿之前維持在大于75%的水平。
7. 權(quán)利要求4或5的方法，其中所述d02在勻漿后維持在約50%。
8. 權(quán)利要去4或5的方法，其中所述d02在勻漿后維持在大于50%的水平。
9. 權(quán)利要求5的方法，其中維持所述d02大于或等于1. 5個(gè)小時(shí)。
10. 權(quán)利要求6的方法，其中維持所述d02大于或等于2個(gè)小時(shí)。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中用覆蓋的或噴射的氣體、用增加的反壓或者用攪拌速率維 持所述d02。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述覆蓋的氣體為約0. 4vvm至約0. 8vvm。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述覆蓋的氣體為0. 6vvm。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中所述增加的反壓為約1. 0至30psi之間。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述增加的反壓為19psi。
16. 權(quán)利要求11的方法，其中所述攪拌速率為約6瓦特/L至約8瓦特/L。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述攪拌速率為約6瓦特/L。
18. 產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，其包括（a)發(fā)酵缺失menE基因的原核宿主細(xì)胞，其中已 經(jīng)用編碼所述重組蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化所述原核宿主細(xì)胞，和（b)收獲所述重組蛋白質(zhì)，以 及（c)將所述重組蛋白質(zhì)純化成FBS，其中如通過(guò)離子交換層析（IEC)測(cè)定法在310nm處所 測(cè)量，所述經(jīng)過(guò)濾的儲(chǔ)備物不含可檢測(cè)的1，4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA)-重組蛋白質(zhì)加合 物。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中與使用對(duì)照原核宿主細(xì)胞得到的產(chǎn)量相比，所述重組蛋 白質(zhì)產(chǎn)量增加了約20%或更多、約30%或更多、約40%或更多、約50%或更多、約60%或更 多。
20. 權(quán)利要求1-19的方法，其中所述發(fā)酵是獨(dú)立于規(guī)模的。
21. 權(quán)利要求1或18的方法，其中所述重組蛋白質(zhì)是重組多肽或分離的抗體。
22. 權(quán)利要求1或18的方法，其中所述原核宿主細(xì)胞是大腸桿菌（Escherichia coli(E.coli))、腸桿菌屬（Enterobacter)、固氮菌屬（Azotobacter)、歐文氏菌 屬（Erwinia)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、克雷伯氏菌 屬（Klebsiella)、變形桿菌屬（Proteus)、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella)、沙雷氏菌屬 (Serratia)、志賀氏菌屬（Shigella)、根瘤菌屬（Rhizobia)、透明顫菌屬（Vitreoscilla) 和副球菌屬（Paracoccus)。
【文檔編號(hào)】C12P21/00GK104350156SQ201380027623
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月27日
【發(fā)明者】M·W·萊爾德, R·圣約翰, J·V·甘森, K·凱爾艾斯, D·納達(dá)拉賈, R·亞當(dāng)斯, B·R·斯內(nèi)德克 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司