烷醇酰胺及酰胺胺的微生物生產(chǎn)及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開涉及重組微生物體，其經(jīng)基因工程化以表達催化伯胺和酰基硫酯轉(zhuǎn)化為脂肪酰胺的酶。本發(fā)明公開進一步包括通過將重組微生物體在碳源存在下進行培養(yǎng)而產(chǎn)生脂肪酰胺的方法。
【專利說明】燒醇醜胺及醜胺胺的微生物生產(chǎn)及其用途
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求美國臨時申請?zhí)?1/623,711 (提交于2012年4月13日）的權(quán)益，其 全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[000引 序列表
[0004] 本申請包含序列表，其已經(jīng)通過EFS-WebWASCII形式提交并且通過引用將其全 部并入本文。所述ASCII拷貝在2013年3月11日生成，名稱為LS00041PCT_^.txt并且 大小為69, 769字節(jié)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明公開涉及微生物體，所述微生物體經(jīng)基因工程化而表達酶，從而當在碳源 存在下進行培養(yǎng)時產(chǎn)生脂肪醜胺。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 脂肪醜胺是動植物脂質(zhì)中的內(nèi)源組分，其具有廣泛的生物化學及生理學功能 炬achur等人（1965)J.Biol.Chem. 240:1019-1024)。內(nèi)源脂肪醜胺如N-蹤擱酸己醇胺 (PEA)、N-花生四帰己醇胺（anandamide)、N-油醜己醇胺（OEA)W及N-花生四帰多己胺 (NADA)在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中起信號傳導分子的作用（見例如Tan等人（2006)AAPS J. 8(3) :E461-E465;和LoVerme等人（2004)Mol.Wiarmacol. 67(1): 15-19)。有研究表明 PEA發(fā)揮抗炎及抗傷害感受的活性，用來治療疼痛的PEA藥物制劑可在歐洲購得，商標名 為NORMAST(Petrosino等人（2010)Biochimie92 化）：724-7;及Bacci等人（201DISRN Surgery, 2011 期，文章ID917350, 6 頁；doi:10. 5402/2011/917350)。
[0008] 脂肪醜胺如脂肪焼醇醜胺和脂肪氨基醜胺也有廣泛的非藥用商業(yè)用途。脂肪焼醇 醜胺和脂肪氨基醜胺在個人護理產(chǎn)品（例如香波、沐浴露和潔面乳）、化妝品制劑（例如腮 紅、睫毛膏和唇膏）W及家用清潔產(chǎn)品（例如洗衣劑、餐具洗潔精和表面清潔組合物）的生 產(chǎn)中用作起泡劑、表面活性劑或其中間產(chǎn)物。脂肪焼醇醜胺和脂肪氨基醜胺也可用作燃料 添加劑。據(jù)估計，每年全球市場要消耗100, 000噸的焼醇醜胺（Adlercreutz等人（2010) IndustrialBiotechnology6(4):204-211)。
[0009] 用于商業(yè)用途的脂肪焼醇醜胺的經(jīng)典生產(chǎn)方法是通過來源于原料如天然油類或 脂肪及原油的脂肪酸或脂肪酸甲醋與鏈焼醇胺進行有機合成反應進行的，該過程成本消 耗大（Adlercreutz等人，同上，W及Rros^Sullivan,"NonionicSurfactantsinthe ImlustrialTriad" (2002))。例如，可通過來源于挪子油的蹤擱醜脂肪酸與單己醇胺發(fā)生 Schotten-Baumann反應生產(chǎn)PEA,如下所示：
[0010]
【權(quán)利要求】
1. 重組微生物體，其包含編碼催化伯胺和?；蝓マD(zhuǎn)化為脂肪酰胺的多肽的核酸序 列，其中所述微生物體在碳源存在下進行培養(yǎng)。
2. 權(quán)利要求1的重組微生物體，其中所述多肽為棕櫚酰腐胺合酶（PPS)多肽。
3. 權(quán)利要求2的重組微生物體，其中所述PPS多肽包含與SEQIDNO: 1的氨基酸序列 具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少 約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或 至少約99%的序列同一性的氨基酸序列。
4. 權(quán)利要求2的重組微生物體，其中所述PPS多肽具有包含SEQIDNO: 1的氨基酸序 列。
5. 權(quán)利要求2的重組微生物體，其中所述PPS多肽由包含SEQIDNO: 2的核酸序列編 碼。
6. 權(quán)利要求1的重組微生物體，其中所述多肽為N-(4-氨基-2-羥丁基）十四酰胺合 酶（AhtS)多肽。
7. 權(quán)利要求6的重組微生物體，其中所述AhtS多肽包含與SEQIDNO: 3的氨基酸序列 具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少 約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或 至少約99%的序列同一性的氨基酸序列。
8. 權(quán)利要求6的重組微生物體，其中所述AhtS多肽具有包含SEQIDN0:3的氨基酸序 列。
9. 權(quán)利要求6的重組微生物體，其中所述AhtS多肽由包含SEQIDNO: 22的核酸序列 編碼。
10. 權(quán)利要求1-9中任何一項的重組微生物體，其中所述碳源為碳水化合物。
11. 權(quán)利要求1-10中任何一項的重組微生物體，其中所述伯胺選自：3_二甲氨 基-1-丙胺、（±) -1-氨基-2-丙醇、2-甲氧基乙胺、3-氨基-1-丙醇、2-氨基-1，3-丙二 醇、3-甲氧基丙胺、N-(2-羥乙基）乙二胺、丁胺、和1，4-二氨基丁烷、或其組合。
12. 權(quán)利要求1-11中任何一項的重組微生物體，其中所述酰基硫酯為脂肪?；?ACP或 脂肪酰基-CoA。
13. 權(quán)利要求12的重組微生物體，其中所述脂肪?；?ACP或脂肪酰基-CoA由所述微 生物體產(chǎn)生。
14. 權(quán)利要求1-13中任何一項的重組微生物體，其中所述重組微生物體包含編碼脂 肪酸生物合成多肽、硫酯酶多肽（EC3. 1. 2. 14或EC3. 1. 1. 5)及?；?CoA合成多肽（EC 2. 3. 1. 86)中的一種或多種的核酸序列。
15. 權(quán)利要求14的重組微生物體，其中所述微生物體包含編碼硫酯酶多肽和?；?CoA 合酶多肽的核酸序列。
16. 權(quán)利要求14或15的重組微生物體，其中所述編碼硫酯酶多肽的核酸序列包含 'tesA的核酸序列。
17. 權(quán)利要求14-16中任何一項的重組微生物體，其中所述編碼酰基-CoA合酶多肽的 核酸序列為fadD。
18. 權(quán)利要求14-17中任何一項的重組微生物體，其中所述脂肪酸生物合成多肽選自 編碼accABCD、FabD、FabH、FabG、FabB、FabA、FabZ、FabF、FabI或FadR的核酸序列。
19. 權(quán)利要求1-18中任何一項的重組微生物體，其中所述微生物體為細菌、藍細菌、藻 類或真菌。
20. 權(quán)利要求19的重組微生物體，其中所述微生物體為真菌。
21. 權(quán)利要求20的微生物體，其中所述真菌為酵母或絲狀真菌。
22. 權(quán)利要求1-19中任何一項的重組微生物體，其中所述微生物為釀酒酵母、解脂假 絲酵母、大腸埃希氏菌、節(jié)桿菌、紅酵母、不動桿菌、解脂假絲酵母、布朗葡萄藻、弗尼斯弧 菌、藤黃微球菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌、惡臭假單胞菌、熒光假 單胞菌、天藍色鏈霉菌、聚球藻屬物種PCC7002、細長嗜熱藍細菌BP-1、桑椹型無綠藻、克魯 格尼原藻、大型無綠藻，中型無綠藻或原殼小球藻細胞。
23. 權(quán)利要求22的重組微生物體，其中所述微生物體為節(jié)桿菌AK19、不動桿菌屬物種 M-1株、大腸桿菌B、大腸桿菌C、大腸桿菌K或大腸桿菌W細胞。
24. 權(quán)利要求1-23中任何一項的重組微生物體，其中所述催化伯胺和酰基硫酯轉(zhuǎn)化為 脂肪酰胺的多肽對微生物體是內(nèi)源的。
25. 權(quán)利要求1-23中任何一項的重組微生物體，其中所述催化伯胺和?；蝓マD(zhuǎn)化為 脂肪酰胺的多肽對微生物體是外源的。
26. 權(quán)利要求1-25中任何一項的重組微生物體，其中所述脂肪酰胺為脂肪烷醇酰胺或 脂肪酰胺胺。
27. 權(quán)利要求1-26中任何一項的重組微生物體，其中所述微生物體表達絲氨酸脫羧酶 多肽。
28. 用于產(chǎn)生脂肪酰胺的方法，其包括： (a) 提供根據(jù)權(quán)利要求1-27中任何一項的重組微生物體；并且 (b) 將所述重組微生物體在適合于編碼催化伯胺和酰基硫酯轉(zhuǎn)化為脂肪酰胺的多肽的 核酸序列的表達的條件下在至少一種多肽底物存在下進行培養(yǎng)。
29. 權(quán)利要求28的方法，其進一步包括從培養(yǎng)基中分離脂肪酰胺。
30. 權(quán)利要求28或29的方法，其中所述脂肪酰胺為C8、C9、CIO、Cll、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19 或C20 脂肪烷醇酰胺。
31. 權(quán)利要求28或29的方法，其中所述脂肪酰胺為C8、C9、CIO、Cll、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19 或C20 脂肪酰胺胺。
【文檔編號】C12N9/12GK104379735SQ201380026545
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月13日
【發(fā)明者】賈森·J·魯特斯, 斯蒂芬·德爾卡戴雷 申請人:Reg生命科學有限責任公司, 賈森·J·魯特斯, 斯蒂芬·德爾卡戴雷