改善的脂肪酸衍生物的生產(chǎn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開涉及重組宿主細(xì)胞，其包括有效改善了脂肪酸衍生物的效價(jià)、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)率的菌株修飾。本發(fā)明公開進(jìn)一步涉及包括重組宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的重組宿主細(xì)胞用于發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸衍生物及其組合物。
【專利說明】改善的脂肋酸衍生物的生產(chǎn)
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年4月2日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/619, 324的權(quán)益，并且該 申請W引用方式全文并入本文。
[000引 序列表
[0004] 本發(fā)明包括序列表，該序列表通過EFS-WebWASCn形式提交，并W引用方式全文 并入本文。在2013年4月2日創(chuàng)建的所述的ASCII拷貝命名為LS00042PCT_^.txt，并且 大小為143, 098字節(jié)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本發(fā)明公開涉及包括細(xì)胞株修飾的重組宿主細(xì)胞，其有效地改善了脂肪酸衍生物 的效價(jià)、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)率。本發(fā)明公開進(jìn)一步涉及細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括用于發(fā)酵生產(chǎn)脂肪 衍生物及其組合物的重組宿主細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0006] 包括脂肪酵、脂肪醇、碳氨化合物（焼姪和帰姪）、脂肪醋（例如蠟、脂肪酸醋或脂 肪醋）和麗在內(nèi)的脂肪酸衍生物代表了工業(yè)化學(xué)品和燃料的重要類別。該些分子及其衍生 物具有多種用途，包括但不限于用作表面活性劑、潤滑劑、增塑齊U、溶齊U、乳化齊U、軟化劑、增 稠劑、風(fēng)味劑、香料和燃料。原油是目前用于生產(chǎn)石油化學(xué)品和燃料的原材料的主要來源。 由石油衍生的兩類主要原材料為短鏈帰姪（例如己帰和丙帰）和芳香族（例如苯和二甲苯 異構(gòu)體）。該些原材料通過使用多種方法（例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整）W相當(dāng) 多的花費(fèi)從原油中的長鏈碳氨化合物斷裂而衍生得到。該些原材料可W用于制造石油化學(xué) 品，例如單體、溶劑、洗涂劑和粘合劑，而該些化學(xué)品不能W其他方式由原油直接精煉。由 此，石油化學(xué)品可W用于制造專口的化學(xué)品，例如塑料、樹脂、纖維、彈性體、藥物、潤滑劑、 凝膠等?？蒞由石油化學(xué)品原材料生產(chǎn)的具體的專口化學(xué)品包括但不限于脂肪酸、碳氨化 合物、脂肪酵、脂肪醇、醋和麗。
[0007] 碳氨化合物例如具有許多商業(yè)用途。依此，短鏈焼姪和帰姪用于運(yùn)輸燃料。長鏈 帰姪用于塑料、潤滑劑和合成潤滑劑。此外，帰姪用作生產(chǎn)醇、醋、增塑劑、表面活性劑、叔 胺、增強(qiáng)型石油采收劑、脂肪酸、硫醇、帰基玻巧酸酢、環(huán)氧化物、氯化焼姪、氯化帰姪、蠟、燃 料添加劑和阻流劑的供料。類似地，醋具有多種商業(yè)用途。例如生物柴油（備選燃料）由 醋（例如脂肪酸甲基醋、脂肪酸己基醋等）制成。一些低分子量的醋是具有怡人氣味的揮 發(fā)物，該使它們得W用作香料或風(fēng)味劑。此外，醋用作漆、涂料和清漆的溶劑。此外，一些天 然形成的物質(zhì)（例如蠟、脂肪和油）還由醋制成。醋進(jìn)一步用作樹脂和塑料中的軟化劑、增 塑劑、阻燃劑W及汽油和油中的添加劑。此外，醋可W用于制造聚合物、膜、紡織品、染料和 藥物。
[0008] 酵用于生產(chǎn)多種?？诘幕瘜W(xué)品。例如酵用于生產(chǎn)聚合物、樹脂（例如酷酵樹脂）、 染料、風(fēng)味劑、增塑劑、香精、藥物和其他化學(xué)品，其中一部分可W用作溶劑、防腐劑或消毒 齊u。此外，某些天然和合成的化合物（例如維生素）和用作激素的化合物為酵。此外，許多 糖包括酵基。脂肪酵可W通過化學(xué)或酶還原而轉(zhuǎn)化為脂肪醇。相似地，脂肪醇也具有許多 商業(yè)用途。更短鏈的脂肪醇用于化妝品和食品工業(yè)，例如乳化劑、軟化劑和增稠劑。由于脂 肪醇的兩性本性，脂肪醇起到非離子表面活性劑的作用，其用于個(gè)人護(hù)理和家庭產(chǎn)品，例如 洗涂劑。此外，脂肪醇用于蠟、樹膠、樹脂、藥品軟膏和洗劑、潤滑油添加劑、紡織品抗靜電和 整理劑、增塑劑、化妝品、工業(yè)溶劑和用于脂肪的溶劑。脂肪醇（例如脂肪族的醇）包括8 至22個(gè)碳原子的鏈。脂肪醇通常具有偶數(shù)的碳原子、W及與末端碳連接的單個(gè)醇基（-0H)。 一些脂肪醇是不飽和的，一些脂肪醇是支化的。它們廣泛用于工業(yè)化學(xué)中。大多數(shù)天然的 脂肪醇W蠟的形式被發(fā)現(xiàn)，其為脂肪酸與脂肪醇形成的醋。它們由細(xì)菌、植物和動(dòng)物產(chǎn)生。 目前，脂肪醇是通過脂肪酸（其由天然來源產(chǎn)生，該天然來源例如挪子油、蹤擱油、蹤擱堅(jiān) 果油、牛脂和豬油）的催化氨化或者通過a-帰姪（由石油化學(xué)品供料產(chǎn)生）的化學(xué)水合 而生產(chǎn)。由天然來源衍生的脂肪醇具有可變的鏈長。脂肪醇的鏈長對于具體應(yīng)用而言是重 要的且特異性的。此外，脂肪醇脫水形成a-帰姪還可W通過化學(xué)催化作用來完成。
[0009] 由于勘探、提取、運(yùn)輸和精煉用于化學(xué)和燃料產(chǎn)品的石油提出了固有的挑戰(zhàn)，本領(lǐng) 域需要備選的來源，其可W經(jīng)濟(jì)且高效地產(chǎn)生W用于化學(xué)和燃料生產(chǎn)。此外，特別考慮到居 住在該個(gè)星球上的人口從過去W來一直在增長，所W燃燒石油基燃料已經(jīng)成為環(huán)境的嚴(yán)重 危害。因此，需要石油替代物，其不能與產(chǎn)生勘探、提取、運(yùn)輸和精煉石油所造成的相同類型 的環(huán)境破壞。
[0010] 生產(chǎn)可再生石油的一種選擇是通過改造宿主細(xì)胞來生產(chǎn)可再生的石油。生物衍 生的燃料和化學(xué)品提供了超過石油基燃料的益處。諸如碳氨化合物（例如焼姪、帰姪或快 姪）、脂肪醇、醋、脂肪酸、脂肪酵和麗之類的生物衍生的化學(xué)品由生物質(zhì)直接轉(zhuǎn)化成所需的 化學(xué)產(chǎn)品。然而，為了由商業(yè)上切實(shí)可行的可發(fā)酵的糖或生物質(zhì)得到生物衍生的脂肪酸衍 生物用作用于生產(chǎn)可再生化學(xué)品和燃料的來源，必須優(yōu)化所述的方法W便高效地轉(zhuǎn)化和回 收產(chǎn)品。近年來，在生物衍生的燃料和化學(xué)品的研發(fā)中，有一個(gè)研究和研發(fā)的焦點(diǎn)。然而， 所述的相關(guān)方法和產(chǎn)品仍非常需要改善，W使得生物衍生的燃料和化學(xué)品成為商業(yè)上切實(shí) 可行的選擇。需要改善的領(lǐng)域包括生產(chǎn)方法的能量效率、W及終產(chǎn)品的產(chǎn)率。本發(fā)明公開 解決了該需要。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明公開的一個(gè)方面提供了具有基因改造的多核巧酸序列的重組宿主細(xì)胞， 其中所述的多核巧酸序列編碼一種或多種具有特異性酶活性的多膚。所述的多核巧酸 序列對于宿主細(xì)胞是外源的或內(nèi)源的。依此，本發(fā)明公開提供了具有基因改造的多核 巧酸序列的重組宿主細(xì)胞，其中所述的基因改造的多核巧酸序列編碼一種或多種如下多 膚，其中所述的多膚具有選自W下的活性，包括但不限于3-輕基癸醜基-[acp]脫水酶 巧.C. 4. 2. 1. 60)活性；目-麗脂醜基-ACP合酶I巧.C. 2. 3. 1. 41)活性；目-麗脂醜基-ACP 合酶IUE.C. 2. 3. 1. 179)活性；[acp]S-丙二醜基轉(zhuǎn)移酶{丙二醜基-CoA-ACP醜基轉(zhuǎn) 移酶}巧.(：.2. 3. 1.39)活性；3-氧醜基-{目-麗脂醜基}-ACP還原酶巧.C. 1. 1. 1. 100) 活性；目-麗脂醜基-ACP合酶III(E.C. 2. 3. 1. 180)活性；帰醜基-ACP還原酶（NADH) (E.C. 1. 3. 1. 9)活性；帰醜基-ACP還原酶（NADPHHE.C. 1. 3. 1. 10)活性；3-輕基-醜 基-[acp]脫水酶化C. 4. 2. 1. 59)活性；W及反-2,順-3-癸帰醜基-ACP異構(gòu)酶 巧.C. 5. 3. 3. 14)活性，其中當(dāng)在有效表達(dá)多核巧酸的條件下在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 時(shí)，所述的重組宿主細(xì)胞W比相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞更高的效價(jià)、產(chǎn)率和生產(chǎn)率來生產(chǎn)脂 肪酸衍生物。在相關(guān)的方面中，當(dāng)所述的多膚與至少一種其他的具有酶活性的多膚組合表 達(dá)時(shí)，重組宿主細(xì)胞W更高的效價(jià)、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)率生產(chǎn)脂肪酸衍生物組合物。在另一 個(gè)方面中，當(dāng)所述的多膚與至少5種其他的具有酶活性的多膚組合表達(dá)時(shí)，重組宿主細(xì)胞 W更高的效價(jià)、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)率生產(chǎn)脂肪酸衍生物組合物。在另一個(gè)方面中，當(dāng)所述的 多膚與至少2種、3種、4種、5種、6種或更多的具有酶活性的多膚組合表達(dá)時(shí)，重組宿主細(xì) 胞W更高的效價(jià)、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)率生產(chǎn)脂肪酸衍生物組合物。在另一個(gè)相關(guān)的方面中， 重組宿主細(xì)胞包括進(jìn)一步編碼為醜基載體蛋白質(zhì)（ACP)的多膚的一種或多種基因改造的 多核巧酸序列。ACP可W與一種或多種如下多膚組合表達(dá)，其中所述的多膚編碼任一種酶 活性，其中當(dāng)在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)，ACP進(jìn)一步增加重組宿主細(xì)胞的效價(jià)、產(chǎn)率和/或生 產(chǎn)率。在另一個(gè)相關(guān)的方面中，基因改造的多核巧酸序列進(jìn)一步編碼具有accABCD活性 (E.C. 6. 4. 1. 2)的多膚。accABCD可W與一種或多種編碼任一種酶活性的多膚組合表達(dá)， 其中當(dāng)在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)，accABCD進(jìn)一步增加重組宿主細(xì)胞的效價(jià)、產(chǎn)率和/或生產(chǎn) 率。
[0013] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了具有基因改造的多核巧酸的重組宿主細(xì)胞，其中 所述的基因改造的多核巧酸序列編碼一種或多種多膚，其中所述的多膚具有酶活性，包括 但不限于反-2,順-3-癸帰醜基-ACP異構(gòu)酶活性（化bA或化bM);目-麗脂醜基-ACP合酶 I(化bB);丙二醜基-CoA-ACP醜基轉(zhuǎn)移酶（化bD);目-麗脂醜基-ACP合酶I(化bF或化bB); 目-麗脂醜基-ACP還原酶（化bG);目-麗脂醜基-ACP合酶III(化bH);帰醜基-ACP還原 酶（f油I、f油L、化bV或f油K) ;3-輕基-醜基-[acp]脫水酶（f油A或f油幻；和反-2-帰 醜基-ACP還原酶II(化bK)。在相關(guān)的方面中，多膚選自f油A、f油B、f油D、f油F、f油G、 f油H、f油I、化bL、化bV、化bZ、化bM、化bK和/或它們的組合。在另一個(gè)相關(guān)的方面中，多 膚選自：鼠傷寒沙口氏桿菌（Salmonellatyphimurium)(NP_460041)的F油A;得自大腸埃 希氏菌巧scherichiacoli) (NP_416826)的F油B;得自鼠傷寒沙口氏桿菌（NP_460164)的 F油D;得自鼠傷寒沙口氏桿菌（NP_46016W的F油G;得自鼠傷寒沙口氏桿菌（NP_46016^ 的F油H;得自鼠傷寒沙口氏桿菌（NP_459232)的化bZ;得自變性鏈球菌（Str巧tococ州S mutans) (AAN59379)的F油M;得自肺炎鏈球菌（Streptococ州Spneumoniae) (AAF98273) 的F油K;得自霍亂弧菌（Vibriocholera) (YP_001217283)的F油V;得自丙麗下醇梭菌 (Clostridiumacetobut}di州m) (NP_350156)的F油F;得自枯草芽抱桿菌亞種枯草菌株 168炬acillussubtillissubsp.subtilisstr. 168) (NP_389054)的F油L;得自枯草芽 抱桿菌亞種枯草菌株168(NP_388745)的F油I;得自不動(dòng)桿菌菌種（Acinetobactersp.) ADP1(YP_047630)的F油I;得自MarinobacteraquaeoliVT8(YP_958813)的F油I;得 自不透明紅球菌巧hodococcusopa州s)B4(YP_002784194)的F油I;得自不動(dòng)桿菌菌種 ADP1(YP_046731)的F油H;得自MarinobacteraquaeoliVT8(YP_958649)的F油H;得自不 透明紅球菌B4 (YP_00278448)的F油H或它們的組合。
[0014] 本發(fā)明公開進(jìn)一步考慮了具有基因改造的多核巧酸序列的重組宿主細(xì)胞，其中所 述的基因改造的多核巧酸序列編碼ACP多膚，其中當(dāng)在有效表達(dá)ACP多膚的條件下在包括 碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，重組宿主細(xì)胞W比相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞更高的效價(jià)、產(chǎn)率或生 產(chǎn)率生產(chǎn)脂肪酸衍生物。在相關(guān)的方面中，基因改造的多核巧酸序列進(jìn)一步編碼具有磯酸 泛醜琉基己胺基轉(zhuǎn)移酶化C. 2. 7. 8. 7)活性的多膚。此處，基因改造的多核巧酸序列包括 編碼磯酸泛醜琉基己胺基轉(zhuǎn)移酶化C. 2. 7. 8. 7)的S巧基因。在相關(guān)的方面中，基因改造的 多核巧酸序列進(jìn)一步編碼具有accABCD活性化C. 6. 4. 1. 2)的多膚。ACP可W與accABCD 和/或磯酸泛醜琉基己胺基轉(zhuǎn)移酶組合表達(dá)，其中在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)，任何表達(dá)多膚 的組合都會進(jìn)一步使重組宿主細(xì)胞的效價(jià)、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)率增加。在另一個(gè)相關(guān)的方面 中，ACP作為重組宿主細(xì)胞中表達(dá)的終末途徑的酶由同一有機(jī)體衍生得到，其中終末途徑的 酶切割任何的醜基-ACP物質(zhì)，其為脂肪酸生物合成途徑的一部分。ACP對于宿主細(xì)胞而言 是外源的或內(nèi)源的。
[0015] 本發(fā)明公開進(jìn)一步涵蓋了包括如下基因改造的多核巧酸序列的重組宿主細(xì)胞，其 中所述的基因改造的多核巧酸序列包括轉(zhuǎn)座子，其中將轉(zhuǎn)座子插入到y(tǒng)ijp基因中影響位 于yijP基因側(cè)翼的第二基因，其中第二基因編碼受到上調(diào)的或下調(diào)的多核巧酸，并且其中 上調(diào)的或下調(diào)的多核巧酸編碼如下多膚，當(dāng)所述宿主細(xì)胞在有效表達(dá)所述多膚的條件下 在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述上調(diào)的或下調(diào)的多核巧酸編碼的多膚影響脂肪酸衍 生物的生產(chǎn)。yijP基因的任一側(cè)的側(cè)翼上可W具有基因。在相關(guān)的方面中，轉(zhuǎn)座子插入 到^jP基因中使得^jP基因或其多核巧酸失活，該影響位于^jP基因側(cè)翼的一個(gè)或多 個(gè)基因，其中一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼基因編碼如下多膚，當(dāng)所述的宿主細(xì)胞在有效表達(dá)所述多膚 的條件下在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼基因編碼的多膚影響脂肪 酸衍生物組合物的生產(chǎn)。在一個(gè)相關(guān)的方面中，側(cè)翼基因包括多核巧酸，其包括但不限于 ppc,yijO,frwD,pflCpflD或argE。
[0016] 本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了包括基因改造的多核巧酸序列的重組宿主細(xì)胞， 其中所述的基因改造的多核巧酸序列編碼磯酸帰醇式丙麗酸駿化酶（PPC)多膚，其中當(dāng)在 有效表達(dá)PPC多膚的條件下在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述的重組宿主細(xì)胞W比相應(yīng) 的野生型宿主細(xì)胞更高的效價(jià)、產(chǎn)率或生產(chǎn)率產(chǎn)生脂肪酸衍生物組合物。
[0017] 此外，本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提供了細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括本發(fā)明提出的任一種 重組宿主細(xì)胞（上文所述）。將重組宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該樣根據(jù)本發(fā)明提出的基因 改造方法，重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)脂肪酸衍生物組合物（上文所述）。在相關(guān)的方面中，由本發(fā) 明公開的重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪酸衍生物組合物包括但不限于脂肪酸、脂肪醋、脂肪醇、 脂肪酵、焼姪、端帰姪、內(nèi)帰姪和麗。在另一個(gè)相關(guān)的方面中，脂肪酸衍生物為C6、C8、CIO、 C12、C13、C14、C15、C16、C17或C18脂肪酸衍生物。在另一個(gè)相關(guān)的方面中，脂肪酸衍生物 為C10:1、C12:1、C14:1、C16:1或C18:l的不飽和脂肪酸衍生物。在另一個(gè)相關(guān)的方面中， 脂肪酸衍生物組合物包括C8、CIO、C12、C14、C16和C18脂肪酸衍生物中的一種或多種。由 包括本發(fā)明公開的重組宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的脂肪酸衍生物組合物包括脂肪酸、月旨 肪酵、脂肪醇、脂肪醋、焼姪、端帰姪、內(nèi)帰姪和麗。本發(fā)明公開進(jìn)一步涵蓋了；包括脂肪酸衍 生物的脂肪酸衍生物組合物，其中在所述的脂肪酸衍生物中，在距脂肪醇的還原末端的C7 和C8之間，在碳鏈的位置7處具有雙鍵；包括不飽和脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物組合物； 包括飽和脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物組合物；W及包括支鏈脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生 物組合物。
[0018] 本發(fā)明公開進(jìn)一步考慮了包括任一種本發(fā)明提出的重組宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物， 其中當(dāng)相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞在與重組宿主細(xì)胞相同的培養(yǎng)條件下時(shí)，重組宿主細(xì)胞的效 價(jià)比相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞的效價(jià)高至少大約5%。在此，重組宿主細(xì)胞具有大約Ig/L至 大約250g/L的效價(jià)，更具體而言，大約90g/L至大約120g/L的效價(jià)。在相關(guān)的方面中，重 組宿主細(xì)胞的產(chǎn)率為至少大約10%至大約40%。在一個(gè)方面中，重組宿主細(xì)胞的產(chǎn)率為大 約25%。此外，本發(fā)明還涵蓋了包括任一種本發(fā)明提出的重組宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中 細(xì)胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)率為大約0. 7mg/L/虹至大約3g/L/虹或更高。
[0019]本發(fā)明公開的另一個(gè)方面提出了制備重組宿主細(xì)胞的方法，包括對重組宿主細(xì)胞 進(jìn)行基因改造，使得該細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下表達(dá)由一種或多種多核巧酸序列編碼的多 膚序列，其中所述的多核巧酸序列編碼具有特異酶活性的一種或多種多膚。
[0020] 附圖簡述
[0021] 當(dāng)組合附圖一起閱讀本發(fā)明公開時(shí)，可W更好地理解，其中所述的附圖起到示意 優(yōu)選的實(shí)施方案的作用。此外，應(yīng)該理解的是本發(fā)明公開不限于附圖中公開的具體的實(shí)施 方案。
[0022] 圖1提出了在重組微生物有機(jī)體中W醜基CoA作為前體來生產(chǎn)脂肪酸衍生物的示 例性生物合成途徑。該循環(huán)由丙二醜基-ACP和己醜基-CoA的縮合來引發(fā)。
[0023] 圖2提出了示例性脂肪酸的生物合成循環(huán)，其中通過丙二醜基-CoA的轉(zhuǎn)醜基作用 形成丙二醜基-ACP來生產(chǎn)丙二醜基-ACP(通過丙二醜基-CoA:ACP醜基轉(zhuǎn)移酶（化bD)的 催化）；然后，目-麗脂醜基-ACP合酶III府地）引發(fā)丙二醜基-ACP和己醜基-CoA的縮 合。延長循環(huán)開始于目-麗脂醜基-ACP合酶I(fabB)和目-麗脂醜基-ACP合酶II(fab巧 催化的丙二醜基-ACP與醜基-ACP的縮合，從而生產(chǎn)目-麗-醜基-ACP，該目-麗-醜 基-ACP接著被目-麗脂醜基-ACP還原酶（化bG)還原，從而生產(chǎn)目-輕基-醜基-ACP，其 通過目-輕基醜基-ACP脫水酶（化bA或f油幻脫水形成反-2-帰醜-醜基-ACP。F油A還 可W使反-2-帰醜基-醜基-ACP異構(gòu)化形成順-3-帰醜基-醜基-ACP，其可W繞過化bl， 并可W被化bB利用（脂肪族鏈長通常至多為C16)，從而生產(chǎn)目-麗-醜基-ACP。各循環(huán) 中的最后步驟是由帰醜基-ACP還原酶（化bl)催化的，其將反-2-帰醜基-醜基-ACP轉(zhuǎn)化 為醜基-ACP。在上文所述的方法中，脂肪酸合成的終止是通過硫醋酶將醜基由醜基-ACP上 移除從而釋放游離的脂肪酸（FFA)來進(jìn)行的。硫醋酶（例如tesA)水解硫醋鍵，該是通過 硫氨基鍵在醜基鏈與ACP之間進(jìn)行的。
[0024] 圖3示出了己醜基-CoA駿化酶（accABCD)的酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能。BirA使 accB(其為生物素駿基載體蛋白質(zhì)）生物素化，其為己醜基-CoA駿化酶的酶復(fù)合物的一部 分。
[00巧]圖4提出了W醜基-ACP為起始來生產(chǎn)脂肪醇的示例性生物合成途徑的概況，其中 脂肪酵的生產(chǎn)是由醜基-ACP還原酶（AAR)或硫醋酶（TE)、W及駿酸還原酶（Car)的酶活性 來催化的。脂肪酵通過酵還原酶（也稱為醇脫氨酶）轉(zhuǎn)化為脂肪醇。
[0026] 圖5提出了W醜基-ACP為起始來生產(chǎn)脂肪醋的示例性生物合成途徑的概況，其中 脂肪醋的生產(chǎn)是通過單酶系統(tǒng)或H酶系統(tǒng)來完成的。
[0027] 圖6提出了W醜基-ACP為起始來生產(chǎn)碳氨化合物的示例性生物合成途徑的概況； 內(nèi)帰姪的生產(chǎn)是由OleABCD的酶活性來催化的；焼姪的生產(chǎn)是通過酵脫駿基酶（ADC)將脂 肪酵酶轉(zhuǎn)化形成焼姪來催化的；端帰姪的生產(chǎn)是通過駿化酶將脂肪酸酶轉(zhuǎn)化形成端帰姪來 催化的。
[002引圖7示出了由具有化祀基因衰減（即，刪除）的MG1655大腸桿菌菌株生產(chǎn)的脂 肪酸衍生物（總的脂肪物質(zhì)）與大腸桿菌MG1655生產(chǎn)的脂肪酸衍生物的比較。圖7提出 的數(shù)據(jù)顯示化祀基因衰減不會影響脂肪酸衍生物的生產(chǎn)。
[0029] 圖8示出了在對數(shù)期的DAMl_i377中的丙二醜基-CoA水平，其中所述的DAM1_ i377表達(dá)8種不同的谷氨酸棒狀桿菌（C.glutamicum)己醜基-CoA駿化酶（Acc)操縱子構(gòu) 建體。
[0030] 圖9示出了在對數(shù)期的大腸桿菌DAMl_i377中的細(xì)胞內(nèi)短鏈-CoA水平，其中所述 的大腸桿菌DAMl_i377 表達(dá)ptrcl/3_accDACB-birA+panK操縱子構(gòu)建體。accDACB+birA 在本發(fā)明中還稱為accD+。
[0031] 圖10示出了大腸桿菌菌株DV2中的脂肪酸甲基醋（FAME)的生產(chǎn)，其中所述的大 腸桿菌菌株DV2表達(dá)由姪海桿菌（M.hy化ocarbonoclasticus)得到的醋合酶9和由谷氨酸 棒狀桿菌得到的己醜基-CoA駿化酶復(fù)合物的成分。
[0032] 圖11示出了大腸桿菌的脂肪醇生產(chǎn)，其中所述的大腸桿菌在P化質(zhì)粒上表達(dá)細(xì)長 聚球藻（Synechococ州Selongatus)PCC7942AARW及由谷氨酸棒狀桿菌得到的accD+操縱 子。其中顯示了accD+菌株的3個(gè)重復(fù)樣品。
[003引圖12A和12B示出當(dāng)質(zhì)粒p&_Pta_tesA轉(zhuǎn)化至如圖所示的各包括iFAB的菌株中 時(shí)，由2個(gè)重復(fù)的平板篩選得到的總脂肪物質(zhì)的生產(chǎn)數(shù)據(jù)（mg/L)，并在FA2培養(yǎng)基中發(fā)酵 20小時(shí)，從而在32C(圖12A)和37C(圖12B)完成誘導(dǎo)至收獲。
[0034]圖13示出具有質(zhì)粒PDS57和整合的化地1操縱子的大腸桿菌DAM1的FAME生 產(chǎn)。f油H/I基因得自MarinobacteraquaeoliVT8或得自貝氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baylyi)ADPl。關(guān)于該些菌株的化bH/I操縱子的更多細(xì)節(jié)參見表7。
[00巧]圖14示出具有質(zhì)粒PDS57、W及不同構(gòu)造的谷氨酸棒狀桿菌acc基因及整合的f油HI操縱子的大腸桿菌DAM1的FAME生產(chǎn)。該菌株包括得自不透明紅球菌或貝氏不動(dòng)桿 菌ADP1的fabH/I基因。關(guān)于fabH/I和acc操縱子的更多細(xì)節(jié)參見表7。
[0036] 圖15示出2種大腸桿菌DAMlpDS57菌株與對照菌株大腸桿菌DAMlpDS57相比的 FAME和FFA效價(jià)，其中所述的大腸桿菌DAM1 PDS57菌株選自圖13中的整合的化bH/I基因 菌株。
[0037] 圖16為iFAB138基因座的圖示，其包括整合在iFAB138前面的cat-loxF-Pie盒的 示意圖（圖16A) 及PT5_iFAB138區(qū)（圖16B)的示意圖。
[0038] 圖17示出了菌株V668,其具有修復(fù)的巧h和ilvG基因，生產(chǎn)比EG149更高水平的 FFA，其中所述的EG149不具有任一修復(fù)的巧h和ilvG基因。
[0039] 圖18為插入在菌株1X535的^jP基因中的轉(zhuǎn)座子盒（轉(zhuǎn)座子匹配物68F11)的 圖示。其中示出位于轉(zhuǎn)座子盒內(nèi)的啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子可W影響相鄰基因的表達(dá)。
[0040] 圖19示出表達(dá)細(xì)長聚球藻醜基-ACP還原酶（AAR)并共表達(dá)多種藍(lán)細(xì)菌醜基載體 蛋白質(zhì)（ACP)的大腸桿菌DV2的脂肪醇的生產(chǎn)。關(guān)于ACP來源的細(xì)節(jié)在表12中提供。
[0041] 圖20示出表達(dá)無前導(dǎo)序列的大腸桿菌硫醋酶'tesA并共表達(dá)藍(lán)細(xì)菌醜基載體蛋 白質(zhì)（cAC巧和枯草芽抱桿菌S巧的大腸桿菌DV2的脂肪酸的生產(chǎn)。
[004引發(fā)明詳述
[0043] 綜述
[0044] 本發(fā)明公開至少部分基于該樣的發(fā)現(xiàn)；在重組宿主細(xì)胞中，脂肪酸生物合成途徑 的多個(gè)方面的修飾有利于增強(qiáng)該宿主細(xì)胞生產(chǎn)脂肪酸衍生物。本發(fā)明公開涉及具有所需特 征的脂肪酸衍生物的組合物及生產(chǎn)該脂肪酸衍生物的方法。此外，本發(fā)明公開涉及重組宿 主細(xì)胞（例如微生物有機(jī)體）、重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物、制備和使用重組宿主細(xì)胞的方法， 例如在培養(yǎng)的重組宿主細(xì)胞在發(fā)酵生產(chǎn)具有所需特性的脂肪酸衍生物中的用途。
[0045] 更具體而言，所需的脂肪酸衍生物組合物（例如醜基-CoA、脂肪酸、脂肪酵、短鏈 和長鏈的醇、碳氨化合物、脂肪醇、醋（例如蠟、脂肪酸醋或脂肪醋）、端帰姪、內(nèi)帰姪和麗） 的生產(chǎn)通過修飾一種或多種基因（與脂肪酸、脂肪醋、焼姪、帰姪、帰姪（olefin)或脂肪醇的 生物合成途徑、生產(chǎn)、降解和/或分泌有關(guān)）的表達(dá)而增強(qiáng)。本發(fā)明公開提供了重組宿主 細(xì)胞，其經(jīng)改造，從而提供相對于未改造的或天然的宿主細(xì)胞（例如作為對照細(xì)胞的野生 型宿主細(xì)胞）而言增強(qiáng)的脂肪酸生物合成，該種增強(qiáng)是通過例如菌株的改善來完成的。依 此，本發(fā)明公開鑒定用于本發(fā)明公開的重組宿主細(xì)胞、方法和組合物的多核巧酸。通常公認(rèn) 的是，與此類多核巧酸絕對一致的序列不是必須的。例如可W對特定多核巧酸序列進(jìn)行改 變，并針對活性篩選編碼的多膚。該種改變通常包括保守突變和沉默突變（例如密碼子優(yōu) 化）?？蒞使用本領(lǐng)域已知的方法，針對所需的功能篩選基因改造的或修飾的多核巧酸、W 及編碼的變體多膚，其中所述的功能包括但不限于增強(qiáng)的催化活性、增強(qiáng)的穩(wěn)定性或降低 的抑制作用（例如降低的反饋抑制作用）。
[0046] 本發(fā)明公開鑒定根據(jù)酶分類巧C)號、與本發(fā)明所述的脂肪酸生物合成途徑的多 個(gè)步驟（即，反應(yīng)）有關(guān)的酶活性，并提供通過所述的EC號分類的示例性多膚（例如酶）、 W及編碼此類多膚的示例性多核巧酸。此類示例性多膚和多核巧酸（其通過本發(fā)明的編號 和/或序列識別號（SEQIDNO)識別）可用于改造親代宿主細(xì)胞中的脂肪酸途徑，從而獲 得本發(fā)明所述的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明所述的多膚和多核巧酸是示例性的并且是非限定 的。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可W通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得本發(fā)明所述的示例性多膚的同源序列 (例女口theNationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)提供的rhwEntrez 數(shù)據(jù)庫，theSwissInstituteofBioinformatics提供的ExF*asy數(shù)據(jù)庫，theTechnical UniversityofE5raunschweig提供的BRENDA數(shù)據(jù)庫，W及theBioinformaticsCenterof KyotoUniversityandUniversityofTokyo提供的KEGG數(shù)據(jù)庫，所有該些均可在the WorldWideWeb上獲得）。
[0047] 定義
[0048] 除非明確地作出另外的指示，如本說明書和所附的權(quán)利要求書所用，單數(shù)形式 "一"、"一個(gè)"和"一種"包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如"重組宿主細(xì)胞"包括兩種或更多種此 類重組宿主細(xì)胞，"脂肪醇"包括一種或多種脂肪醇或脂肪醇的混合物，"編碼序列的核酸" 包括一種或多種編碼序列的核酸；"酶"包括一種或多種酶等。
[0049] 編號：在整個(gè)說明書中使用的序列編號得自由NCBI(化tionalCenter化r BiotechnologyInformation)提供的數(shù)據(jù)庫（其由the^tionalInstitutes of化al化U.S.A.維護(hù)）（該編號在本發(fā)明中確認(rèn)為"NCBI編號"或備選地確認(rèn) 為"GenBank編號"），W及得自由theSwissInstituteofBioinformatics提供的 UniProtKnowledgebase(UniProt邸)andSwiss-Prot數(shù)據(jù)庫（該編號在本發(fā)明中確認(rèn)為 "化iProt邸編號，，）。
[0050]酶分類巧C)號；EC號由theNomencla1:ureCommitteeoftheInternational UnionofBiochemistryandMolecularBiology(lUBMB)建立，其描述可W在國際互聯(lián)網(wǎng) 的lUBMBEnzymeNomencla化re網(wǎng)站上獲得。EC號是根據(jù)酶催化的反應(yīng)將酶分類。
[0051]如本文所用，術(shù)語"核巧酸"是指多核巧酸的單體單元，其由雜環(huán)堿基、糖和一個(gè)或 多個(gè)磯酸基構(gòu)成。天然形成的堿基（鳥嘿嶺佑)、腺嘿嶺（A)、胞嚼巧（C)、胸腺嚼巧（T)和 尿嚼巧扣)）通常為嘿嶺或嚼巧的衍生物，但是應(yīng)該理解的是天然和非天然形成的堿基類 似物也被包括在內(nèi)。天然形成的糖為戊糖（五碳糖）、脫氧核糖（其形成DNA)或核糖（其 形成RNA)，但是應(yīng)該理解的是天然和非天然形成的糖類似物也被包括在內(nèi)。核酸通常通過 磯酸鍵連接，從而形成核酸或多核巧酸，但是本領(lǐng)域已知許多其他的鍵（例如磯硫醜鍵、測 焼磯酸鍵等）。
[0052] 如本文所用，術(shù)語"多核巧酸"是指核巧酸（RNA)和脫氧核巧酸值NA)的聚合物，其 可W是單鏈的或雙鏈的，并且其可W包括非天然或改變的核巧酸。術(shù)語"多核巧酸"、"核酸 序列"和"核巧酸序列"在本發(fā)明中可W交換使用，其是指任何長度的核巧酸（RNA或DNA)的 聚合形式。該些術(shù)語是指分子的一級結(jié)構(gòu)，因此包括雙鏈和單鏈DNA、W及雙鏈和單鏈RNA。 該術(shù)語包括由核巧酸類似物和修飾多核巧酸（例如但不限于甲基化的和/或加帽的多核巧 酸）形成的RNA或DNA的類似物作為等價(jià)物。多核巧酸可W為任何形式，包括但不限于質(zhì) 粒、病毒、染色體、EST、cDNA、mRNA和rRNA。
[0053] 如本文所用，術(shù)語"多膚"和"蛋白質(zhì)"可W交換使用，其是指氨基酸殘基的聚合物。 術(shù)語"重組多膚"是指通過重組技術(shù)生產(chǎn)的多膚，其中通常，將編碼所表達(dá)蛋白質(zhì)的DNA或 RNA插入到合適的表達(dá)載體中，該載體依此轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)多膚。
[0054] 如本文所用，術(shù)語"同源"和"同源的"是指包括如下序列的多核巧酸或多膚，其 中所述的序列與相應(yīng)的多核巧酸或多膚序列具有至少大約50%的一致性。優(yōu)選的是，同 源的多核巧酸或多膚具有如下多核巧酸序列或氨基酸序列，該多核巧酸序列或氨基酸序列 與相應(yīng)的氨基酸序列或核巧酸序列具有至少大約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96% )、97%、98%或者至少大約 99% 的同源性。如本文所用，術(shù)語序列"同源性"和序列"一致性"可W交換使用。
[00巧]本領(lǐng)域的任一普通技術(shù)人員很好地知道測定兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同源性的方 法。簡言之，計(jì)算兩個(gè)序列之間的"同源性"可W按W下方式進(jìn)行。為了達(dá)到最佳比較的目 的，將序列進(jìn)行比對（例如可W在第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或二者中引入空位 W達(dá)到最佳比對的目的，并且可W忽視非同源的序列W達(dá)到比較目的）。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，用于比較目的的、比對的第一序列的長度為第二序列的長度的至少大約30%、優(yōu)選至少 大約40%、更優(yōu)選地至少大約50%、甚至更優(yōu)選地至少大約60%、甚至更優(yōu)選地至少大約 70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%或者大 約100%。然后，比較在第一和第二序列的相應(yīng)的氨基酸位置或核巧酸位置處的氨基酸殘 基或核巧酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄械奈恢帽坏诙蛄兄邢鄳?yīng)位置處的相同氨基酸殘基或核巧酸占據(jù) 時(shí)，則分子在該位置處是相同的。兩個(gè)序列之間的百分同源性為序列所共有的相同位置的 數(shù)量的函數(shù)，其考慮了空位的數(shù)量和各空位的長度，必須引入空位的數(shù)量和各空位的長度 W達(dá)到兩個(gè)序列的最佳比對的目的。
[0056] 序列的比較W及兩個(gè)序列之間的百分同源性的確定可W使用數(shù)學(xué)算法來完成，例 如BLAST(Altschuletal.，J.Mol.Biol, 215(3) :403-410(1990))。此外，兩個(gè)氨基酸序 列之間的百分同源性還可W使用Needleman和Wunsch算法來確定，其中所述的算法被引 入到GCG軟件包的GAP程序中，其中使用了Blossum62矩陣或PAM250矩陣，W及16、14、 12、10、8、6 或 4 的空位權(quán)重和 1、2、3、4、5 或 6 的長度權(quán)重（NeedlemanandWunsch，J.Mol. Biol.，48:444-453 (1970))。此外，兩個(gè)核巧酸序列之間的百分同源性還可W使用GCG軟件 包中的GAP程序來確定，其中使用了NWSgap化a.CMP矩陣W及40、50、60、70或80的空位權(quán) 重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。本領(lǐng)域的任一普通技術(shù)人員可W進(jìn)行最初的同源性計(jì)算， 并相應(yīng)地調(diào)整算參數(shù)。優(yōu)選的參數(shù)組（和如果操作者不確定應(yīng)當(dāng)應(yīng)用哪些參數(shù)來確定分子 是否在所要求的同源性限制內(nèi)而應(yīng)該使用的參數(shù)組）是具有12的空位罰分、4的空位延伸 罰分和5的移碼空位罰分的Blossum62評分矩陣。序列比對的其他方法是生物【技術(shù)領(lǐng)域】 已知的（例如參見Rosenberg,BMCBioinformatics, 6:278(2005) ;Altschul,etal.,陽BS J. ,272 (20):5101-5109(2005))〇
[0057] 如本文所用，術(shù)語"在低嚴(yán)謹(jǐn)性、中嚴(yán)謹(jǐn)性、高嚴(yán)謹(jǐn)性或極高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下雜交" 描述了用于雜交和洗涂的條件。實(shí)施雜交反應(yīng)的指導(dǎo)可W見于化rrentProtocolsin MolecularBiology,JohnWil巧&Sons，N.Y. (1989)，6.3.1-6.3.6。該參考文獻(xiàn)中描述了 水性和非水性方法并且可W使用任一種方法。本發(fā)明所指的具體的雜交條件如下；1)低嚴(yán) 謹(jǐn)性雜交條件一在大約45C下、在6x氯化軸/巧樣酸軸（SSC)中，然后在至少5(TC下、在 0. 2XSSC、0. 1%SDS中洗涂兩次（對于低嚴(yán)謹(jǐn)性條件，洗涂溫度可W升至55C) ;2)中嚴(yán)謹(jǐn) 性雜交條件一在大約45C下、在6xSSC中，然后在6(TC的0. 2xSSC、0. 1%SDS中洗涂一次 或多次；3)高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件一在大約45C的6xSSC中，然后在65C下、在0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗涂一次或多次；W及4)極高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件一在65°C的0. 5M磯酸軸、7%SDS，然 后在65C下、在0. 2xSSC、l%SDS中洗涂一次或多次。除非另外指示，極高的嚴(yán)謹(jǐn)性條件 (4)是優(yōu)選的條件。
[005引"內(nèi)源的"多膚是指由宿主細(xì)胞（例如親代微生物細(xì)胞）的基因組編碼的多化其 中重組細(xì)胞由所述的宿主細(xì)胞改造或衍生得到。
[0059]"外源的"多膚是指由親代微生物細(xì)胞的基因組編碼的多膚。變體（即，突變體） 多膚為外源多膚的實(shí)例。
[0060] 術(shù)語"異源的"通常是指由不同的物種衍生得到或有不同的有機(jī)體衍生得到。如 本文所用，異源的是指并非天然存在于特定的有機(jī)體中的核巧酸序列或多膚序列。異源表 達(dá)是指將蛋白質(zhì)或多膚憑經(jīng)驗(yàn)加入到通常不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中。依此，異源的是指該 樣的事實(shí)：被轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)最初由與受體不同類型的細(xì)胞或不同的物種衍生得到。例如可 W通過重組方法將與植物細(xì)胞異源的多核巧酸序列引入到細(xì)菌宿主細(xì)胞中，然后該植物多 核巧酸在重組細(xì)菌宿主細(xì)胞中為異源多核巧酸。
[0061] 如本文所用，術(shù)語多膚的"片段"是指全長多膚或蛋白質(zhì)的較短的部分，其大小為4 個(gè)氨基酸殘基至整個(gè)氨基酸序列減去1個(gè)氨基酸殘基。在本發(fā)明公開的某些實(shí)施方案中， 片段是指多膚或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域（例如底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域或催化結(jié)構(gòu)域）的整個(gè)氨基酸序 列。
[0062] 如本文所用，術(shù)語"誘變"是指一種方法，通過該方法有機(jī)體的遺傳信息W穩(wěn)定的 方式被改變。編碼蛋白質(zhì)的核酸序列的誘變產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。此外，誘變還指非編碼核 酸序列的改變，而該種改變會導(dǎo)致修飾的蛋白質(zhì)活性。
[0063] 如本文所用，術(shù)語"基因"是指編碼RNA產(chǎn)物或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的核酸序列；W及影響 RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)的可操作地連接的核酸序列（例如此類序列包括但不限于啟動(dòng)子或增 強(qiáng)子序列）或編碼會影響RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)的序列的、可操作地連接的核酸序列（例如 此類序列包括但不限于核糖體結(jié)合位點(diǎn)或翻譯控制序列）。
[0064] 表達(dá)控制序列是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多聚腺巧酸信號、 轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRE巧等，它們提供了多核巧酸序列在宿主細(xì)胞中的 表達(dá)。表達(dá)控制序列特異性地與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用（Maniatisetal.,Sc ience, 236:1237-1245(1987))。示例性的表達(dá)控制序列例如Goeddel,GeneExpression Technology:MethodsinEnzymology,Vol. 185,AcademicPress,SanDiego,Calif. (1990) 中所述。
[0065] 在本發(fā)明公開的方法中，表達(dá)控制序列與多核巧酸序列可操作地連接。"可操作地 連接"是指多核巧酸序列和表達(dá)控制序列W該樣的方式連接，使得在合適的分子（例如轉(zhuǎn)錄 活化蛋白質(zhì)）與表達(dá)控制序列結(jié)合時(shí)，允許基因表達(dá)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向，可操作地連 接的啟動(dòng)子位于所選的多核巧酸序列的上游?？刹僮鞯剡B接的增強(qiáng)子可W位于所選的多核 巧酸的上游、內(nèi)部或下游。
[0066] 如本文所用，術(shù)語"載體"是指能夠運(yùn)送所連接的另一種核酸（即，多核巧酸序列） 的核酸分子。一種類型的有用的載體為附加體（即，能夠在染色體外復(fù)制的核酸）。有用 的載體為能夠使所連接的核酸自主復(fù)制和/或表達(dá)的那些。能夠使可操作地連接的基因 定向表達(dá)的載體在本發(fā)明中還稱為"表達(dá)載體"。總體而言，用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載 體通常為"質(zhì)粒"形式，其通常是指環(huán)狀雙鏈的DNA環(huán)，該DNA環(huán)作為載體形式不能與染色 體結(jié)合。術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"在本發(fā)明中可W交換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒為最常用的載體形式。 然而，還包括此類其他形式的表達(dá)載體，該些載體發(fā)揮著等價(jià)的功能并且到目前為止是本 領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，重組載體進(jìn)一步包括與多核巧酸序列可操作地連接的啟 動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是發(fā)育調(diào)節(jié)的、細(xì)胞器特異性的、組織特異性的、誘導(dǎo)型 的、構(gòu)成型的或者是細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子。重組載體通常包括至少一個(gè)序列，其包括（a)與 多核巧酸序列可操作地綴合的表達(dá)控制序列；化）與多核巧酸序列可操作地綴合的選擇標(biāo) 記；（C)與多核巧酸序列可操作地綴合的標(biāo)記序列；（d)與多核巧酸序列可操作地綴合的純 化部分；（e)與多核巧酸序列可操作地綴合的分泌序列；W及（f)與多核巧酸序列可操作地 綴合的祀向序列。在某些實(shí)施方案中，核巧酸序列被穩(wěn)定地引入到宿主細(xì)胞的基因組DNA 中，并且核巧酸序列的表達(dá)處于受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子區(qū)的控制之下。本發(fā)明所述的表達(dá)載體包 括適用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)多核巧酸序列的形式的、本發(fā)明所述的多核巧酸序列。本領(lǐng)域 的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可W取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需 多膚的表達(dá)水平之類的因素。本發(fā)明所述的表達(dá)載體可W被引入到宿主細(xì)胞中，從而生產(chǎn) 由本發(fā)明所述的多核巧酸序列編碼的多膚，包括融合多膚。
[0067] 在原核生物（例如大腸桿菌）中表達(dá)編碼多膚的基因最通常的是使用包括構(gòu)成型 或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體來實(shí)施，其中所述的啟動(dòng)子指導(dǎo)融合或非融合多膚的表達(dá)。融合載 體將一定數(shù)量的氨基酸加入到其中編碼的多膚中，通常加入到重組多膚的氨基末端或駿基 末端。該種融合載體通常起到W下3種目的中的一種或多種；（1)增加重組多膚的表達(dá)；（2) 增加重組多膚的溶解性；W及（3)通過在親和純化中起到配體的作用而有助于重組多膚的 純化。通常，在融合表達(dá)的載體中，在融合部分與重組多膚的連接處引入蛋白水解的切割位 點(diǎn)。該使得在純化融合多膚后，重組多膚與融合部分分離。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開 的多核巧酸序列與由瞻菌體T5衍生的啟動(dòng)子可操作地連接。
[0068] 在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞，表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。用于在 釀酒酵母僅cerevisiae)中表達(dá)的載體的實(shí)例包括pY巧Seel炬aldarietal.,EMB0 J. ,6:229-234 (1987))、pMFa(Kurjanetal.，細(xì)胞，30:933-943 (1982))、pJRY88(Schultz etal.,Gene, 54: 113-123(1987))、pYES2(InvitrogenCo;rp.,SanDiego,CA)和 picZ(InvitrogenCorp. ,SanDiego,CA)。
[0069] 在其他的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞，表達(dá)載體為桿狀病毒表達(dá)載體?？?用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞（例如S巧細(xì)胞）中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括例如pAc 系列（Smithetal.，Mol.細(xì)胞Biol. ,3:2156-2165 (1983))和P化系列（Lucklowet al.，Virology, 170:31-39(1989))。
[0070] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的多核巧酸序列可W使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。用于原核和真核細(xì)胞的其他合適的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的，例如 參見Sambrooketal. ,"MolecularCloning:ALaboratoryManual,"再片反，ColdSpring HarborLaboratory, (1989)。
[0071] 本發(fā)明所指的術(shù)語"相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞"是指作為對照細(xì)胞的細(xì)胞。例如如果 重組宿主細(xì)胞中的多膚受到上調(diào)，則相同的多膚在對照細(xì)胞中W更低的水平存在。相反，女口 果重組宿主細(xì)胞中的多膚受到下調(diào)，則相同的多膚在對照細(xì)胞中W更高的水平存在。此外， "重組的或改造的宿主細(xì)胞"為用于生產(chǎn)一種或多種脂肪酸衍生物的微生物有機(jī)體，其中所 述的脂肪酸衍生物包括例如醜基-CoA、脂肪酸、脂肪酵、短鏈和長鏈的醇、碳氨化合物、脂肪 醇、醋（例如蠟、脂肪酸醋或脂肪醋）、端帰姪、內(nèi)帰姪和麗。在一些實(shí)施方案中，重組宿主細(xì) 胞包括一種或多種多核巧酸，各種多核巧酸均編碼具有脂肪酸生物合成酶活性的多膚。
[0072] 如本文所用，"醜基-CoA"是指在焼基鏈的撰基碳與輔酶A(CoA)的4' -磯酸泛醜 亞硫醜基部分的硫氨基之間形成醜基硫醋，其具有下式R-C(0)S-C〇A，其中R為具有至少4 個(gè)碳原子的任何焼基。
[0073] 如本文所用，"醜基-ACP"是指在焼基鏈的撰基碳與醜基載體蛋白質(zhì)（ACP)的磯 酸泛醜琉基己胺基部分的硫氨基之間形成醜基硫醋。磯酸泛醜琉基己胺基部分在翻譯后通 過全-醜基載體蛋白質(zhì)合酶（ACP巧（一種磯酸泛醜琉基己胺基轉(zhuǎn)移酶）的作用與ACP上的 保守絲氨酸殘基連接。在一些實(shí)施方案中，醜基-ACP為完全飽和的醜基-ACP的合成中的 中間體。在其他的實(shí)施方案中，醜基-ACP為不飽和的醜基-ACP的合成中的中間體。在一 些實(shí)施方案中，碳鏈具有大約 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25或26個(gè)碳。該些醜基-ACP的每一種都是將它們轉(zhuǎn)化為脂肪酸衍生物的酶的底物。
[0074] 如本文所用，術(shù)語"脂肪酸衍生物"是指"脂肪酸"或"脂肪酸衍生物"，其可W稱為 "脂肪酸或其衍生物"。術(shù)語"脂肪酸"是指具有式RC00H的駿酸。R表示脂肪族基團(tuán)，優(yōu)選為 焼基。R可W包括大約4至大約22各碳原子。脂肪酸可W是飽和的、單不飽和的或多不飽 和的。"脂肪酸衍生物"為部分由生產(chǎn)宿主有機(jī)體的脂肪酸生物合成途徑形成的產(chǎn)物。"脂 肪酸衍生物"包括部分由醜基-ACP或醜基-ACP衍生物形成的產(chǎn)率。示例性的脂肪酸衍生 物包括例如醜基-CoA、脂肪酸、脂肪酵、短鏈和長鏈的醇、脂肪醇、碳氨化合物、醋（例如蠟、 脂肪酸醋或脂肪醋）、端帰姪、內(nèi)帰姪和麗。
[00巧]本發(fā)明所指的"脂肪酸衍生物組合物"是由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的，并且通常包括脂 肪酸衍生物的混合物。在一些情況下，所述的混合物包括多于一種類型的產(chǎn)物（例如脂肪 酸和脂肪醇、脂肪酸和脂肪酸醋、或者焼姪或帰姪）。在其他的情況下，脂肪酸衍生物組合物 可W包括例如具有不同鏈長、且飽和或支化特征的脂肪醇（或者另一種脂肪酸衍生物）的 混合物。在其他的情況下，脂肪酸衍生物組合物包括多于一種類型的產(chǎn)物、W及具有不同鏈 長且飽和或支化特征的產(chǎn)物的混合物。
[0076] 如本文所用，術(shù)語"脂肪酸生物合成途徑"是指生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物的生物合成 途徑。脂肪酸生物合成途徑除了包括本發(fā)明所討論的生產(chǎn)具有所需特征的脂肪酸衍生物的 酶或多膚W外，還可W包括其他的具有酶活性的酶或多膚。
[0077] 如本文所用，"脂肪酵"是指具有式ROTO的酵，其特征在于撰基（C= 0)。在一些 實(shí)施方案中，脂肪酵為由脂肪醇形成的任何的酵。在某些實(shí)施方案中，R基的長度為至少5、 至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、 至少17、至少18或者至少19個(gè)碳。備選地或此外，R基的長度為20或更少、19或更少、18 或更少、17或更少、16或更少、15或更少、14或更少、13或更少、12或更少、11或更少、10或 更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少的碳。因此，R基可W具有上述任何兩個(gè)端點(diǎn) 限定的R基。例如R基可W為6-16個(gè)碳的長度、10-14個(gè)碳的長度或者12-18個(gè)碳的長度。 在一些實(shí)施方案中，脂肪酵為C6、C7、C8、C9、CIO、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、 C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26脂肪酵。在某些實(shí)施方案中，脂肪酵為C6、C7、C8、 C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17 或C18 脂肪酵。
[0078] 如本文所用，"脂肪醇"是指具有式R0H的醇。在一些實(shí)施方案中，R基的長度為至 少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至 少16、至少17、至少18或者至少19個(gè)碳。備選地或此外，R基的長度為20或更少、19或更 少、18或更少、17或更少、16或更少、15或更少、14或更少、13或更少、12或更少、11或更少、 10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少的碳。因此，R基可W具有上述任何兩個(gè) 端點(diǎn)限定的R基。例如R基可W為6-16個(gè)碳的長度、10-14個(gè)碳的長度或者12-18個(gè)碳的 長度。在一些實(shí)施方案中，脂肪醇為C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、 C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26脂肪醇。在某些實(shí)施方案中，脂肪醇為C6、C7、 C8、C9、CIO、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17 或C18 脂肪醇。
[0079]脂肪酸衍生物（例如脂肪醇）的R基可W為直連或支鏈。支鏈可W具有多于一個(gè) 的支化點(diǎn)，并且可W包括環(huán)狀支。在一些實(shí)施方案中，支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化 的脂肪醇為C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、 C23、C24、C25或C26的支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化的脂肪醇。在具體的實(shí)施方案 中，支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化的脂肪醇為C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、 C15、C16、C17或C18的支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化的脂肪醇。在某些實(shí)施方案中， 支化的脂肪酸、支化的脂肪酵或支化的脂肪醇的輕基在第一位置（C1)處。
[0080] 在某些實(shí)施方案中，支化的脂肪酸衍生物為異脂肪酸衍生物，例如異脂肪酵、異脂 肪醇或反異脂肪酸衍生物、反異脂肪酵或反異脂肪醇。在示例性的實(shí)施方案中，支化的脂肪 酸衍生物選自異C7:0、異C8:0、異C9:0、異C10:0、異C11:0、異C12:0、異C13:0、異C14:0、異 (：15:0、異(：16:0、異(：17:0、異(：18:0、異(：19:0、反異〔7:0、反異〔8:0、反異〔9:0、反異(：10:0、 反異C11:0、反異C12:0、反異C13:0、反異C14:0、反異C15:0、反異C16:0、反異C17:0、反異 C18:0和反異C19:0的支化的脂肪醇。
[0081] 支化的或非支化的脂肪酸衍生物的R基可W是飽和的或不飽和的。如果是不飽和 的，則R基可W具有多于一個(gè)的不飽和點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，不飽和的脂肪酸衍生物是單 不飽和的脂肪酸衍生物。在某些實(shí)施方案中，不飽和的脂肪酸衍生物為C6:l、C7:l、C8:l、 C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、C21:1、 C22:1、C23:1、C24:1、C25:1或C26:l的不飽和的脂肪酸衍生物。在某些實(shí)施方案中，不飽 和的脂肪酸衍生物為CIO: 1、C12:1、C14:1、C16:1或C18:1的不飽和脂肪酸衍生物。在其 他的實(shí)施方案中，不飽和的脂肪酸衍生物在位置處是不飽和的。在某些實(shí)施方案中， 不飽和的脂肪酸衍生物包括順式雙鍵。
[0082] 如本文所用，術(shù)語"克隆"通常是指起源于單一的共同祖先并與該祖先基本上是遺 傳一致的細(xì)胞或一組細(xì)胞，例如由單一的細(xì)菌細(xì)胞形成的克隆細(xì)菌菌落的細(xì)菌。
[0083] 如本文所用，術(shù)語"培養(yǎng)物"通常是指包括活細(xì)胞的液體培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案 中，培養(yǎng)物包括在受控的條件下在預(yù)定的培養(yǎng)物培養(yǎng)基中再生產(chǎn)的細(xì)胞，例如在包括所選 的碳源和氮的液體培養(yǎng)基中生長的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。動(dòng)詞形式的"培養(yǎng)"或名詞形式 的"培養(yǎng)"是指使重組細(xì)胞細(xì)胞群體在液體或固體培養(yǎng)基中在合適的條件下生長。在具體的 實(shí)施方案中，培養(yǎng)是指底物W發(fā)酵方式生物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。培養(yǎng)用的培養(yǎng)基是公知的，并且 此類培養(yǎng)物培養(yǎng)基的單個(gè)成分可得自商業(yè)來源，例如Difco?和BBL?商標(biāo)。在一個(gè)非限定 性的實(shí)例中，水性營養(yǎng)培養(yǎng)基為包括氮、鹽和碳的復(fù)合來源的"富集培養(yǎng)基"，例如YP培養(yǎng) 基，其包括此類培養(yǎng)基的lOg/L蛋白腺W及l(fā)Og/L酵母提取物。根據(jù)美國專利5, 000, 000 ; 5, 028, 539 ;5, 424, 202 成 482, 846 ;5, 602, 030 ;W0 2010127318 中所述的方法，培養(yǎng)物的宿 主細(xì)胞可W另外改造，從而高效地同化碳并使用纖維素材料作為碳源。此外，在一些實(shí)施方 案中，宿主細(xì)胞被改造從而表達(dá)轉(zhuǎn)化酶，該樣藏糖可W被用作碳源。
[0084] 如本文所用，術(shù)語"在有效表達(dá)基因改造的多核巧酸序列的條件下"是指允許宿主 細(xì)胞生產(chǎn)所需的脂肪酸衍生物的任何條件。合適的條件包括例如發(fā)酵條件。
[0085] 如本文所用，在重組宿主細(xì)胞中，"修飾的"或"改變水平"的蛋白質(zhì)（例如酶）活 性是指在相對于親代或天然宿主細(xì)胞測定的活性中存在的一個(gè)或多個(gè)特征的差異。通常， 活性的差異是在重組宿主細(xì)胞（具有修飾的活性）與相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞之間測定的 (例如重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物相對于相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞的比較）。修飾的活性可W是W 下情況的結(jié)果，例如：重組宿主細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)的量改變（例如編碼蛋白質(zhì)的DNA序列 的拷貝數(shù)量升高或降低、編碼蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄子的數(shù)量升高或降低、和/或由mRNA形成 蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)翻譯的量升高或降低的結(jié)果）；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變（例如一級結(jié)構(gòu)改變，女口 蛋白質(zhì)的編碼序列的改變，其導(dǎo)致底物特異性的改變、所見的動(dòng)力學(xué)參數(shù)改變）及蛋白 質(zhì)的穩(wěn)定性改變（例如蛋白質(zhì)降解的升高或降低）。在一些實(shí)施方案中，所述的多膚為本發(fā) 明所述的任一種多膚的突變體或變體。在某些情況下，用于本發(fā)明所述的多膚的編碼序列 為為了在特定的宿主細(xì)胞中的表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。例如就在大腸桿菌中的表達(dá)而言，可 W根據(jù)例如Grosjeanetal. ,Gene18:199-209 (1982)中所述優(yōu)化一個(gè)或多個(gè)密碼子。
[0086] 如本文所用，術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"通常是指DNA中堿基的序列，該序列與編碼蛋白質(zhì) 的DNA序列可操作地連接，其中所述的堿基序列最終控制蛋白質(zhì)的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例 包括但不限于RNA啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（例如增 強(qiáng)子元件）、影響RNA穩(wěn)定性的核巧酸序列W及翻譯調(diào)節(jié)序列（例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)（例如 原核生物中的化ine-Dalgarno序列或真核生物中的Kozak序列）、起始密碼子、終止密碼 子）。
[0087] 術(shù)語"改變的表達(dá)水平"和"修飾的表達(dá)水平"可W交換使用，并且是指在相同的 條件下，與多核巧酸、多膚或碳氨化合物在相應(yīng)的野生型細(xì)胞中的濃度相比，多核巧酸、多 膚或碳氨化合物在改造的宿主細(xì)胞中W不同的濃度存在。
[0088]如本文所用，術(shù)語"效價(jià)"是指每單位體積的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的脂肪酸衍 生物的量。在本發(fā)明所述的組合物和方法的任何方面中，脂肪酸衍生物W大約25mg/L、 大約 50mg/L、大約 75mg/L、大約lOOmg/L、大約 125mg/L、大約 150mg/L、大約 175mg/L、大 約 200mg/L、大約 225mg/L、大約 250mg/L、大約 275mg/L、大約 300mg/L、大約 325mg/L、大 約 350mg/L、大約 375mg/L、大約 400mg/L、大約 425mg/L、大約 450mg/L、大約 475mg/L、大 約 500mg/L、大約 525mg/L、大約 550mg/L、大約 575mg/L、大約 600mg/L、大約 625mg/L、大 約 650mg/L、大約 675mg/L、大約 700mg/L、大約 725mg/L、大約 750mg/L、大約 775mg/L、大 約 800mg/L、大約 825mg/L、大約 850mg/L、大約 875mg/L、大約 900mg/L、大約 925mg/L、大約 950mg/L、大約 975mg/L、大約lOOOmg/L、大約 1050mg/L、大約 1075mg/L、大約llOOmg/L、大 約 1125mg/L、大約 1150mg/L、大約 1175mg/L、大約 1200mg/L、大約 1225mg/L、大約 1250mg/ L、大約 1275mg/L、大約 1300mg/L、大約 1325mg/L、大約 1350mg/L、大約 1375mg/L、大約 1400mg/L、大約 1425mg/L、大約 1450mg/L、大約 1475mg/L、大約 1500mg/L、大約 1525mg/L、大 約 1550mg/L、大約 1575mg/L、大約 1600mg/L、大約 1625mg/L、大約 1650mg/L、大約 1675mg/ L、大約 1700mg/L、大約 1725mg/L、大約 1750mg/L、大約 1775mg/L、大約 1800mg/L、大約 1825mg/L、大約 1850mg/L、大約 1875mg/L、大約 1900mg/L、大約 1925mg/L、大約 1950mg/L、大 約 1975mg/L、大約 2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、lOg/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、 70徑/1、8〇3/1、9〇3/1、10〇3/1或上述任意兩個(gè)值所限定的范圍的效價(jià)生產(chǎn)。在其他的實(shí)施方 案中，脂肪酸衍生物W高于lOOg/U高于200g/L、高于300g/L或更高（例如500g/L、700g/ L、lOOOg/L、1200g/L、1500g/L或2000g/L)的效價(jià)生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明公開的方法由重組宿主 細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪酸衍生物的效價(jià)為5g/L至200g/L、lOg/L至150g/L、20g/L至120g/L、W及 30g/L至lOOg/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明公開的方法由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪 酸衍生物的效價(jià)為大約Ig/L至大約250g/L、并且更具體為90g/L至大約120g/L。所述的 效價(jià)可W指由給定的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的特定的脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的 組合。
[0089] 如本文所用，"由宿主細(xì)胞生產(chǎn)的脂肪酸衍生物的產(chǎn)率"是指輸入的碳源在宿主細(xì) 胞中被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物（即，脂肪醇或脂肪酵）的效率。根據(jù)本發(fā)明公開的方法經(jīng)改造從而生 產(chǎn)脂肪酸衍生物的宿主細(xì)胞的產(chǎn)率為至少3 %、至少4 %、至少5 %、至少6 %、至少7 %、至少 8%、至少9%、至少10%、至少11 %、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、 至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21 %、至少22%、至少23%、至少24%、至 少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%或者由上述任意兩個(gè)值所限 定的范圍。在其他的實(shí)施方案中，一種或多種脂肪酸衍生物W高于30%、40%、50%、60%、 70%、80%、90%或更高的產(chǎn)率生產(chǎn)。備選地或此外，產(chǎn)率為大約30%或更低、大約27%或 更低、大約25%或更低、大約22%或更低。因此，產(chǎn)率可W由上述任意兩個(gè)端點(diǎn)來限定。例 如根據(jù)本發(fā)明公開的方法由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的一種或多種脂肪酸衍生物的產(chǎn)率可W為 5%至 15%、10%至 25%、10%至 22%、15%至 27%、18%至 22%、20%至 28%、或 20%至 30%。在具體的實(shí)施方案中，由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的一種或多種脂肪酸衍生物的產(chǎn)率為大 約10%至大約40%。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的一種或多種脂肪 酸衍生物的產(chǎn)率為大約25%。所述的產(chǎn)率可W指由給定的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的特定 的脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的組合。
[0090] 如本文所用，術(shù)語"生產(chǎn)率"是指每單位時(shí)間內(nèi)每單位體積的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生 產(chǎn)一種或多種脂肪酸衍生物的量。在本發(fā)明所述的組合物和方法的任何方面中，由重組宿 主細(xì)胞生產(chǎn)的一種或多種脂肪酸衍生物的生產(chǎn)率為至少lOOmg/L/小時(shí)、至少200mg/L/小 時(shí)、至少300mg/L/小時(shí)、至少400mg/L/小時(shí)、至少500mg/L/小時(shí)、至少600mg/L/小時(shí)、 至少700mg/L/小時(shí)、至少800mg/L/小時(shí)、至少900mg/L/小時(shí)、至少lOOOmg/L/小時(shí)、至 少llOOmg/L/小時(shí)、至少1200mg/L/小時(shí)、至少1300mg/L/小時(shí)、至少1400mg/L/小時(shí)、至 少1500mg/L/小時(shí)、至少1600mg/L/小時(shí)、至少1700mg/L/小時(shí)、至少1800mg/L/小時(shí)、至 少1900mg/L/小時(shí)、至少2000mg/L/小時(shí)、至少2100mg/L/小時(shí)、至少2200mg/L/小時(shí)、至 少2300mg/L/小時(shí)、至少2400mg/L/小時(shí)、或至少2500mg/L/小時(shí)。例如根據(jù)本發(fā)明所述 的方法由重組宿主細(xì)胞生產(chǎn)的一種或多種脂肪酸衍生物的生產(chǎn)率可W為500mg/L/小時(shí)至 2500mg/L/小時(shí)、或700mg/L/小時(shí)至2000mg/L/小時(shí)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，產(chǎn)率為大 約0. 7mg/L/h至大約3g/L/h。所述的生產(chǎn)率可W指由給定的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的特 定的脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的組合。
[0091] 如本文所用，術(shù)語"總脂肪物質(zhì)"和"總脂肪酸產(chǎn)物"在本發(fā)明中可W交換使用， 其是指脂肪醇、脂肪酵和脂肪酸的量，其可W通過GC-FID來評價(jià)，如國際專利申請公開 W02008/119082中所述。相同的術(shù)語用于指脂肪醋分析時(shí)，可W用于指脂肪醋和游離脂肪 酸。
[0092] 如本文所用，術(shù)語"葡萄糖利用率"是指每單位時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)物使用的葡萄糖的量， 其報(bào)告為克/升/小時(shí)（g/L/虹）。如本文所用，術(shù)語"碳源"是指適于用作原核或簡單的 真核細(xì)胞生長所需的碳源的底物或化合物。碳源可W為多種形式，包括但不限于聚合物、碳 水化合物、酸、醇、酵、麗、氨基酸、膚和氣體（例如C0和C〇2)。示例性的碳源包括但不限于： 單糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳 糖；多糖，例如淀粉、纖維素、膠質(zhì)和木聚糖；二糖，例如藏糖、麥芽糖、纖維二糖和松二糖； 纖維素材料和變體，例如半纖維素、甲基纖維素和駿甲基纖維素軸；飽和的或不飽和的脂肪 酸、玻巧酸鹽、乳酸鹽和醋酸鹽；醇，例如己醇、甲醇和甘油；或它們的混合物。此外，碳源還 可W為光合成產(chǎn)物，例如葡萄糖。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源為生物質(zhì)。在其他優(yōu)選的 實(shí)施方案中，碳源為葡萄糖。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源為藏糖。
[0093] 如本文所用，術(shù)語"生物質(zhì)"是指可W衍生得到碳源的任何生物材料。在一些實(shí)施 方案中，適于生物轉(zhuǎn)化的生物質(zhì)被加工成碳源。在其他的實(shí)施方案中，生物質(zhì)不需要進(jìn)一步 加工成碳源。碳源可w轉(zhuǎn)化為生物燃料。示例性的生物質(zhì)來源為植物物質(zhì)或蔬菜，例如谷 物、甘藏或柳枝稷。另一種示例性的生物質(zhì)來源為代謝廢物，例如動(dòng)物物質(zhì)（例如牛糞便）。 其他的示例性生物質(zhì)來源包括藻類和其他海生植物。此外，生物質(zhì)還包括由工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林 業(yè)和家庭得到的廢物，包括但不限于發(fā)酵廢物、未干的襪草、稻草、木材、污物、垃圾、纖維素 城市廢物和食物剩余物。此外，術(shù)語"生物質(zhì)"還指碳源，例如碳水化合物（例如單糖、二糖 或多糖）。
[0094] 如本文所用，對產(chǎn)物（例如脂肪酸及其衍生物）而言的術(shù)語"分離的"是指由細(xì)胞 成分、細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基、或者化學(xué)或合成的前體分離得到的產(chǎn)物。通過本發(fā)明所述的方法 生產(chǎn)的脂肪酸及其衍生物在發(fā)酵液及細(xì)胞質(zhì)中相對而言可W是不可混合的。因此，所述的 脂肪酸及其衍生物可W在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外收集于有機(jī)相中。
[0095] 如本文所用，術(shù)語動(dòng)詞性的"純化"、形容詞性的"純化的"或名詞性的"純化"是指 通過例如分離或隔離將分子從其環(huán)境中移出或分離。"基本上純化的"分子為至少大約60% 游離于（例如至少大約70%游離于、至少大約75%游離于、至少大約85%游離于、至少大約 90%游離于、至少大約95%游離于、至少大約97游離于、至少大約99%游離于）它們所關(guān) 聯(lián)的其他組分。如本文所用，該些術(shù)語還指從樣品中去除污染物。例如污染物的去除可W 使樣品中脂肪酸衍生物的百分率增加。例如當(dāng)在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生脂肪酸衍生物時(shí)，可 W通過去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)來純化脂肪酸衍生物。純化后，樣品中脂肪酸衍生物的百分率 增加。術(shù)語動(dòng)詞性的"純化"、形容詞性的"純化的"或名詞性的"純化"是相對的術(shù)語，其不 需要絕對的純度。因此，例如當(dāng)在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生脂肪酸衍生物時(shí)，純化的脂肪酸衍生 物是基本與其他細(xì)胞成分（例如核酸、多膚、脂質(zhì)、碳水化合物或其他碳氨化合物）隔離的 脂肪酸衍生物。
[009引 菌株改良
[0097] 為了形成脂肪酸衍生物的高效價(jià)、產(chǎn)率和/或生產(chǎn)率，對生產(chǎn)型宿主細(xì)胞進(jìn)行 了多種修飾?；痙R是與脂肪酸降解和脂肪酸生物合成途徑的重要調(diào)節(jié)因子（化onanet al,MolMicrobiol, 29 (4) :937-943 (1998))。大腸桿菌ACS酶化曲和脂肪酸運(yùn)送蛋白 質(zhì)化化為脂肪酸吸收系統(tǒng)的成分?；閷?dǎo)了脂肪酸運(yùn)送至細(xì)菌細(xì)胞，而化曲介導(dǎo)了 醜基-CoA醋的形成。當(dāng)沒有其他碳源可W利用時(shí)，外源脂肪酸被細(xì)菌吸收，并轉(zhuǎn)化為醜 基-CoA醋，其可W與運(yùn)送因子化dR結(jié)合，并抑制fad基因的表達(dá)，其中所述的fad基因編 碼負(fù)責(zé)脂肪酸運(yùn)送（Fa化）、激活（Fa曲）和目-氧化的蛋白質(zhì)（FadA，F(xiàn)a地，F(xiàn)a祀和化地）。 當(dāng)有備選的碳源可W利用時(shí)，細(xì)菌合成脂肪酸作為醜基-ACP，其用于磯脂的合成，但是不是 目-氧化的底物。因此，醜基-CoA和醜基-ACP為脂肪酸的獨(dú)立來源，該可W得到不同的終 產(chǎn)物（Cavigliaetal，JBiol.Chem.，279 (12) :1163-1169 (2004))。
[0098] 在本領(lǐng)域中，關(guān)于宿主細(xì)胞（例如大腸桿菌）中的脂肪酸生物合成的限定因素具 有矛盾的推斷。一種建議是對用于脂肪酸生物合成的主要前體的限定，例如己醜基-CoA和 丙二醜基-CoA可W使得脂肪酸衍生物的合成減少。增加通過脂肪酸生物合成的流量的一 種方法是操縱該途徑中的多種酶（參見圖1和2)。實(shí)施例3描述了多個(gè)研究，該研究顯示 fab操縱子的構(gòu)建W及向大腸桿菌宿主細(xì)胞的染色體中的整合，其中所述的fab操縱子編 碼生物合成途徑中的酶，該些酶用于將丙二醜基-CoA轉(zhuǎn)化為醜基-ACP。不想被理論所束 縛，該可W增加脂肪酸生物合成的流量。通過己醜基-CoA駿化酶（acc)復(fù)合物和脂肪酸生 物合成（化b)途徑由己醜基-CoA供應(yīng)醜基-ACP是限定脂肪酸衍生物的生產(chǎn)速率的另一個(gè) 步驟（參見圖3)。實(shí)施例2顯示出優(yōu)化形式的大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌accABCD(±birA) 過表達(dá)的效果，其證明此類基因修飾可W使大腸桿菌中的己醜基-coA和丙二醜基-CoA的 生產(chǎn)增加。
[0099] 在另一個(gè)方法中，顯示大腸桿菌宿主細(xì)胞中的r地和ilvG基因突變使得游離的脂 肪酸（FFA)的產(chǎn)更高，該轉(zhuǎn)化為脂肪醇的生產(chǎn)更高，如實(shí)施例4所示。在另一個(gè)方法中，獲 得轉(zhuǎn)座子誘變和高通量的篩選，從而發(fā)現(xiàn)可W增加效價(jià)或產(chǎn)率的有利突變。如實(shí)施例5所 示，將轉(zhuǎn)座子插入到y(tǒng)ijP基因中可W改善脂肪醇中搖瓶和分批供料的發(fā)酵中的產(chǎn)率。
[0100] 由重組宿主細(xì)胞生成脂肪酸衍生物
[0101] 本發(fā)明公開提供了多膚（例如酶）的多個(gè)實(shí)例，其中所述的多膚（例如酶）具有 適用于本發(fā)明所述的脂肪酸生物合成途徑的活性。此類多膚在本發(fā)明中統(tǒng)稱為"脂肪酸生 物合成多膚"或"脂肪酸生物合成酶"。本發(fā)明提供了脂肪酸途徑的多膚的非限定性實(shí)例， 其中所述的多膚適用于本發(fā)明公開的重組宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開包括 含有如下多核巧酸序列的重組宿主細(xì)胞，其中所述的多核巧酸序列編碼脂肪酸生物合成的 多膚。所述的多核巧酸序列可W被整合到重組宿主細(xì)胞的染色體中，引入到存在于重組宿 主細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)中，或兩者，其中所述的多核巧酸序列包括編碼脂肪 酸生物合成的多膚的開放閱讀框W及可操作地連接的調(diào)節(jié)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪 酸生物合成的多核巧酸序列編碼多膚，該多膚對于被改造的重組宿主細(xì)胞的親代宿主細(xì)胞 (即，對照細(xì)胞）而言是外源的。一些此類的外源多膚在重組宿主細(xì)胞中是過表達(dá)的。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，脂肪酸生物合成的多核巧酸序列編碼外源或異源的多膚。換言之，由多核 巧酸編碼的多膚對于親代宿主細(xì)胞而言是外源的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾的宿主 細(xì)胞過表達(dá)編碼如下多膚（蛋白質(zhì)）的基因，其中所述的多膚（蛋白質(zhì)）增加宿主細(xì)胞生 產(chǎn)脂肪酸生物合成酶的底物（即，脂肪醜基硫醋底物）的速率。在某些實(shí)施方案中，由所表 達(dá)的基因編碼的酶與脂肪酸的生物合成直接有關(guān)。此類重組宿主細(xì)胞可W被進(jìn)一步改造， 從而包括編碼一種或多種脂肪酸生物合成的多膚（即，與脂肪酸生物合成有關(guān)的酶）的多 核巧酸序列。此類多膚的實(shí)例為具有硫醋酶活性的多膚或蛋白質(zhì)，其中所述的重組宿主細(xì) 胞合成脂肪酸；或者具有硫醋酶活性和駿酸還原酶（CAR)活性的多膚或蛋白質(zhì)，其中重組 宿主細(xì)胞合成脂肪酵和脂肪醇；或者具有硫醋酶活性、駿酸還原酶活性和醇脫氨酶活性的 多膚或蛋白質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞合成脂肪醇；或者具有醜基-CoA還原酶（AAR)活性的多 膚或蛋白質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞合成脂肪酵和脂肪醇；或者具有醜基-CoA還原酶（AAR)活 性和醇脫氨酶活性的多膚或蛋白質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞合成脂肪醇；或者具有形成脂肪醇 的醜基CoA還原酶（FAR)活性的多膚或蛋白質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞合成脂肪醇；或者具有硫 醋酶活性、駿酸還原酶活性和酵脫駿基酶活性的多膚或蛋白質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞合成焼 姪；或者具有醜基-CoA還原酶活性和酵脫駿基酶活性的多膚和蛋白質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞 合成焼姪；或者具有醋合酶活性的多膚和蛋白質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞合成脂肪醋（例如單 酶系統(tǒng)；參見圖5);或者具有硫醋酶活性、醜基-CoA合酶活性和醋合酶活性的多膚和蛋白 質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞合成脂肪醋（例如H酶系統(tǒng)；參見圖5);或者具有OleA活性的多膚 和蛋白質(zhì)，其中重組宿主細(xì)胞合成脂肪族麗；或者具有OleABCD活性的多膚和蛋白質(zhì)，其中 重組宿主細(xì)胞合成內(nèi)帰姪；或者具有硫醋酶活性和脫駿酶活性的多膚和蛋白質(zhì)，其中重組 宿主細(xì)胞合成端帰姪；或者它們的組合。在一些實(shí)施方案中，由脂肪酸生物合成的多核巧酸 編碼的一種多膚是外源（或異源）多膚（例如由除了親代宿主細(xì)胞W外的有機(jī)體起源的多 膚，或者原產(chǎn)于親代微生物細(xì)胞的多膚的變體），或者內(nèi)源多膚（即，原產(chǎn)于親代宿主細(xì)胞 的多膚），其中內(nèi)源多膚在重組宿主細(xì)胞中是過表達(dá)的。
[0102] 下表1提供了示例性蛋白質(zhì)的列表，其中所述的蛋白質(zhì)可W在重組宿主細(xì)胞中表 達(dá)從而有利于特定脂肪酸衍生物的生產(chǎn)。
[0103] 表1 ;基因名稱
[0104]

【權(quán)利要求】
1. 一種包括如下基因改造的多核苷酸序列的重組宿主細(xì)胞，其中所述的基因改造的 多核苷酸序列編碼一種或多種多肽，其中所述的多肽具有選自以下的活性：3_羥基癸酰 基-[acp]脫水酶（E. C. 4. 2. 1. 60)活性，0 -酮脂?；?ACP 合酶 I (E. C. 2. 3. 1. 41)活 性，0 -酮脂酰基-ACP合酶II (E. C. 2. 3. 1. 179)活性，[acp] S-丙二酰基轉(zhuǎn)移酶{丙二酰 基-CoA-ACP?；D(zhuǎn)移酶} (E.C. 2. 3. 1.39)活性，3-氧?；?{0-酮脂酰基}-ACP還原酶 (E. C. 1. 1. 1. 100)活性，@ -酮脂酰基-ACP 合酶 III (E. C. 2. 3. 1. 180)活性，烯酰基-ACP 還 原酶（NADH) (E. C. 1. 3. 1. 9)活性，烯?；?ACP 還原酶（NADPH) (E. C. 1. 3. 1. 10)活性，3-羥 基-?；?[acp]脫水酶（E. C. 4. 2. 1. 59)活性，以及反-2,順-3-癸烯?；?ACP異構(gòu)酶 (E. C. 5. 3. 3. 14)活性；并且其中當(dāng)在有效表達(dá)所述的多核苷酸的條件下在包括碳源的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述的重組宿主細(xì)胞以比相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞更高的效價(jià)、產(chǎn)率或生產(chǎn) 率來生產(chǎn)脂肪酸衍生物組合物。
2. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中當(dāng)所述的多肽與具有所述的活性的至少一種 其他多肽組合表達(dá)時(shí)，所述的重組宿主細(xì)胞以更高的效價(jià)、產(chǎn)率或生產(chǎn)率生產(chǎn)所述的脂肪 酸衍生物。
3. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中當(dāng)所述的多肽與具有所述的活性的至少5種 其他多肽組合表達(dá)時(shí)，所述的重組宿主細(xì)胞以更高的效價(jià)、產(chǎn)率或生產(chǎn)率生產(chǎn)所述的脂肪 酸衍生物。
4. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的反_2,順-3-癸烯?；?ACP異構(gòu)酶活 性為fabA或fabM。
5. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的P -酮脂?；?ACP合酶II為fabF。
6. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的丙二?；?CoA-ACP?；D(zhuǎn)移酶為 fabD〇
7. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的P -酮脂?；?ACP合酶I為fabF或 fabB〇
8. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中￠-酮脂?；?ACP還原酶為fabG。
9. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中P -酮脂?；?ACP合酶III為fabH。
10. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中烯?；?ACP還原酶為fabl、fabL、fabV或 fabK〇
11. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中3-羥基-?；?[acp]脫水酶為fabA或 fabZ〇
12. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中反-2-烯?；?ACP還原酶II為fabK。
13. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的多肽選自fabA、fabB、fabD、fabF、 fabG、fabH、fabl、fabL、fabV、fabZ、fabM 和 fabK。
14. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的多肽選自得自鼠傷寒沙門氏桿菌 (Salmonella typhimurium)(NP_460041)的FabA;得自大腸埃希氏菌（Escherichia coli) (NP_416826)的FabB ;得自鼠傷寒沙門氏桿菌（NP_460164)的FabD ;得自鼠傷寒沙門氏 桿菌（NP_460165)的FabG ;得自鼠傷寒沙門氏桿菌（NP_460163)的FabH ;得自鼠傷寒沙 門氏桿菌（NP_459232)的 FabZ;得自變性鏈球菌（Streptococcus mutans)(AAN59379) 的 FabM ;得自肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae) (AAF98273)的 FabK ;得自霍 亂弧菌（Vibrio cholera) (YP_001217283)的 FabV;得自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum) (NP_350156)的FabF ;得自枯草芽抱桿菌亞種枯草菌株168 (Bacillus subtillis subsp. subtilis str. 168) (NP_389054)的 FabI ;得自枯草芽抱桿菌亞種枯草 菌株 168(NP_388745)的 FabI;得自不動(dòng)桿菌菌種（Acinetobacter sp.)ADPl(YP_047630) 的 FabL ;得自 Marinobacter aquaeoli VT8(YP_958813)的 FabI ;得自不透明紅球菌 (Rhodococcus opacus)B4(YP_0〇2784194)的 FabI ;得自不動(dòng)桿菌菌種 ADP1(YP_046731) 的 FabH ;得自 Marinobacter aquaeoli VT8 (YP_958649)的 FabH ;得自不透明紅球菌 B4 (YP_00278448)的FabH或它們的組合。
15. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其中由所述的基因改造的多核苷酸序列編碼的 所述的多肽是外源的。
16. 權(quán)利要求1所述的重組宿主細(xì)胞，其進(jìn)一步包括編碼酰基載體蛋白質(zhì)（ACP)的基因 改造的多核苷酸序列。
17. 權(quán)利要求16所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的ACP進(jìn)一步增加了所述的效價(jià)、產(chǎn)率 或生產(chǎn)率。
18. -種包括如下基因改造的多核苷酸序列的重組宿主細(xì)胞，其中所述的基因改造的 多核苷酸序列編碼ACP多肽，其中當(dāng)在有效表達(dá)所述的ACP多肽的條件下在包括碳源的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述的重組宿主細(xì)胞以比相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞更高的效價(jià)、產(chǎn)率或生產(chǎn) 率來生產(chǎn)脂肪酸衍生物組合物。
19. 權(quán)利要求18所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼如下 多肽的重組多核苷酸，其中所述的多肽具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶（E. C. 2. 7. 8. 7)活 性。
20. 權(quán)利要求19所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的多核苷酸編碼sfp基因。
21. 權(quán)利要求1或18所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的重組宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼 多肽的重組多核苷酸，其中所述的多肽具有accAB⑶活性（E. C. 6. 4. 1. 2)。
22. 權(quán)利要求1或18所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的ACP衍生自在所述的重組宿主 細(xì)胞中表達(dá)作為終末途徑酶的相同的有機(jī)體。
23. 權(quán)利要求18所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的ACP是外源的。
24. -種包括如下基因改造的多核苷酸序列的重組宿主細(xì)胞，其中所述的基因改造的 多核苷酸序列包括轉(zhuǎn)座子，其中所述的轉(zhuǎn)座子插入到y(tǒng)ijP基因中影響位于位于所述yijP 基因的側(cè)翼的第二基因，其中所述的第二基因編碼受到上調(diào)或下調(diào)的多核苷酸，并且其中 所述的上調(diào)或下調(diào)的多核苷酸編碼如下多肽，當(dāng)所述的宿主細(xì)胞在有效表達(dá)所述的多肽的 條件下在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述的上調(diào)或下調(diào)的多核苷酸編碼的多肽影響脂肪 酸衍生物組合物的生產(chǎn)。
25. 權(quán)利要求24所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的轉(zhuǎn)座子插入到所述的yijP基因中使 得所述的yijP基因或其多核苷酸失活，而影響位于所述yijP基因的側(cè)翼的第二基因，其中 所述的第二基因編碼如下多肽，當(dāng)所述的宿主細(xì)胞在有效表達(dá)所述的多肽的條件下在包括 碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述的第二基因編碼的多肽影響脂肪酸衍生物組合物的生產(chǎn)。
26. 權(quán)利要求24所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的第二基因或其多核苷酸選自ppc、 yi jO、frwD、pflC、pflD 或 argE〇
27. -種包括如下基因改造的多核苷酸序列的重組宿主細(xì)胞，其中所述的基因改造的 多核苷酸序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc)多肽，其中在有效表達(dá)所述的ppc多肽 的條件下在包括碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，所述的重組宿主細(xì)胞以比相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞 更高的效價(jià)、產(chǎn)率或生產(chǎn)率來生產(chǎn)脂肪酸衍生物組合物。
28. -種包括根據(jù)權(quán)利要求1至27的任意一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。
29. 權(quán)利要求28所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的培養(yǎng)基包括脂肪酸衍生物組合物。
30. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括選自脂肪 酸、脂肪酯、脂肪醇、脂肪醛、烷烴、端烯烴、內(nèi)烯烴、酮中的至少一種的脂肪酸衍生物。
31. 權(quán)利要求28所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物為C6、C8、C10、C12、C13、 C14、C15、C16、C17或C18脂肪酸衍生物。
32. 權(quán)利要求28所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物為CIO: 1、C12:1、C14:1、 C16:l或C18:l不飽和脂肪酸衍生物。
33. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括C8、C10、 C12、C14、C16和C18脂肪酸衍生物中的一種或多種。
34. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括脂肪酸。
35. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括脂肪醛。
36. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括脂肪醇。
37. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括脂肪酯。
38. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括烷烴。
39. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括端烯烴。
40. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括內(nèi)烯烴。
41. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括酮。
42. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括脂肪酸衍生 物，該脂肪酸衍生物在由所述的脂肪醇的還原末端開始的C7和C8之間，在所述的碳鏈的位 置7處具有雙鍵。
43. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括不飽和的脂 肪酸衍生物。
44. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括飽和的脂肪 酸衍生物。
45. 權(quán)利要求29所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的脂肪酸衍生物組合物包括支鏈的脂肪 酸衍生物。
46. 權(quán)利要求28所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中當(dāng)在與重組宿主細(xì)胞相同的條件下培養(yǎng)時(shí)， 所述的重組宿主細(xì)胞具有比所述的相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞的效價(jià)高至少大約5%的效價(jià)。
47. 權(quán)利要求46所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的重組宿主細(xì)胞具有大約lg/L至大約 250g/L的效價(jià)。
48. 權(quán)利要求47所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的重組宿主細(xì)胞具有大約90g/L至大約 120g/L的效價(jià)。
49. 權(quán)利要求28所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的重組宿主細(xì)胞具有大約10 %至大約 40%的產(chǎn)率。
50. 權(quán)利要求49所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述的重組宿主細(xì)胞具有大約25%的產(chǎn) 率。
51. 權(quán)利要求28所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述的生產(chǎn)率為大約0. Yrng/L/hr至大約3g/ L/hr〇
【文檔編號】C12N9/90GK104395464SQ201380026304
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月2日
【發(fā)明者】德里克·L·格林菲爾德, 安德烈亞斯·W·席爾默, 伊利莎白·J·克拉克, 伊萊·S·格羅班, 伯納多·M·達(dá)科斯塔, Z·胡, 凱文·霍爾登, 諾厄·赫爾曼 申請人:Reg生命科學(xué)有限責(zé)任公司, 德里克·L·格林菲爾德, 安德烈亞斯·W·席爾默, 伊利莎白·J·克拉克, 伊萊·S·格羅班, 伯納多·M·達(dá)科斯塔, Z·胡, 凱文·霍爾登, 諾厄·赫爾曼