使用醛肟脫水酶從萜肟產(chǎn)生萜腈的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用肟脫水酶從肟生物催化地產(chǎn)生腈的新方法和具有肟脫水酶活性的新突變體及其在用于生物催化產(chǎn)生腈的方法，如特別地用于從檸檬醛肟、橙花醛肟、香葉醛肟或香茅醛肟產(chǎn)生檸檬醛腈、橙花醛腈、香葉醛腈或香茅腈的方法中的用途；和可用于此的肟脫水酶、其核苷酸序列和包含所述核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體或微生物。
【專利說明】使用醛肟脫水酶從萜肟產(chǎn)生萜腈的方法
[0001] 本發(fā)明涉及使用肟脫水酶從肟以生物催化方式產(chǎn)生腈的新方法和具有肟脫水酶 活性的新突變體及其用于生物催化產(chǎn)生腈的方法，如尤其用于從檸檬醛肟、橙花醛肟、香葉 醛肟或香茅醛肟產(chǎn)生檸檬醛腈、橙花醛腈、香葉醛腈或香茅腈的方法中的用途；和可用于此 的肟脫水酶、其核苷酸序列和包含它們的表達(dá)構(gòu)建體或微生物。

【背景技術(shù)】
[0002] 萜類是源自異戊二烯骨架并且尤其在自然界中作為生物中存在的次級(jí)物質(zhì)、尤其 作為植物中的次生物質(zhì)存在的有機(jī)化合物。萜類經(jīng)常是有香味或芳香的物質(zhì)，并且可以例 如從植物衍生的精油獲得。因此，使用萜類和萜衍生物作為化妝品、身體護(hù)理領(lǐng)域產(chǎn)品的成 分或用于清潔產(chǎn)品，例如在香水、護(hù)膚液、沐浴露、皂類、洗滌劑或清潔劑中作為香味物質(zhì)或 芳香物質(zhì)的混合物。取決于所用的化合物，可以產(chǎn)生多種香韻，例如相應(yīng)產(chǎn)品的刺激性的、 清新、柑橘樣或花香味。
[0003] 由化學(xué)工業(yè)為相應(yīng)產(chǎn)品的混合物所提供的相應(yīng)起始產(chǎn)物經(jīng)常是萜類或萜衍生物 的腈。例子是具有強(qiáng)烈清新、柑橘樣氣味的香葉腈或具有玫瑰樣芳香的香茅腈。
[0004] 相應(yīng)的腈作為天然產(chǎn)物分離或從合適前體化學(xué)地合成。因此， 申請(qǐng)人:的WO 2006/106141描述了從作為前體的不飽和腈產(chǎn)生飽和腈。EPO 491 127描述了添加不飽和 腈到己烯醇上，獲得修飾的腈。在這兩種情況下，均使用已經(jīng)包含腈基團(tuán)的起始化合物。因 此，需要還可以使用除腈之外的前體的方法。DE 3139358描述了通過肟化學(xué)反應(yīng)為相應(yīng)的 腈產(chǎn)生香味的方法。在這種方法的情況下，必需的脫水作用要求極端反應(yīng)條件，尤其是苛性 脫水劑和沸騰溫度。
[0005] 因此需要從肟產(chǎn)生腈的替代性方法，尤其在較溫和反應(yīng)條件下發(fā)生的方法。另外， 需要用于實(shí)施這種方法的合適試劑。
[0006] 發(fā)明簡(jiǎn)沭
[0007] 上文提到的第一個(gè)問題由一種用于產(chǎn)生通式I的腈的生物催化方法解決，
[0008]
[0009] 其中

【權(quán)利要求】
1. 用于產(chǎn)生通式I的腈的生物催化方法 其中
R代表直鏈或單次或多重分支的、飽和或單不飽和或多不飽和的、任選地單次或多重取 代的具有4至19個(gè)碳原子的脂族烴殘基；和 n代表1或2 ; 其中 a) 通式II的肟
其中R和n具有上文給出的含義，其中式II的化合物處于立體異構(gòu)純形式或作為立體 異構(gòu)體的混合物， 在脂族醛肟脫水酶（4. 99. 1. 5)、苯基乙醛肟脫水酶（PAOx) (EC4. 99. 1. 7)或吲哚乙醛 肟脫水酶（4. 99. 1. 6)存在下轉(zhuǎn)化成式I的化合物，其中式I的化合物處于立體異構(gòu)純形式 或作為立體異構(gòu)體的混合物，和 b) 任選地，然后進(jìn)一步純化反應(yīng)產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中PAOx是來自紅球菌屬物種（Rhodococcus sp.)、 玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae)或特別地來自芽孢桿菌屬物種（Bacillus sp.)的酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中PAOx具有根據(jù)SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或 與這個(gè)序列至少60 %同一的氨基酸序列。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中使式II的肟反應(yīng)，式II中殘基R，連 同與之結(jié)合的碳原子，衍生自非環(huán)狀廠殘基，選自半廠（C5)、單廠（Cltl)、倍半廠（C 15)、二廠 (c2。)、二倍半萜（C25)、三萜（C3tl)或四萜（C 4tl)殘基（特別地被部分或完全氫化），或衍生自 已經(jīng)縮短1至3個(gè)碳原子的相應(yīng)萜殘基。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中使式II的肟反應(yīng)，其中n代表1并且 殘基R具有上文給出的含義之一。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中使選自檸檬醛肟、橙花醛肟、香葉醛 肟、香茅醛肟和它們的部分或完全氫化的類似物如6, 7-二氫香茅肟的式II化合物轉(zhuǎn)化成 相應(yīng)的腈。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中式IIa的香茅醛肟
其中式IIa的化合物以立體異構(gòu)純形式或作為立體異構(gòu)混合物如特別地作為R/S和/ 或E/Z混合物使用。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中反應(yīng)在PAOx、含有PAOx的蛋白質(zhì)混合 物存在下或在功能性表達(dá)PAOx的重組微生物、從其衍生的含有PAOx的細(xì)胞勻漿或其含有 PAOx的級(jí)分存在下酶促地進(jìn)行。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中PAOx或功能性表達(dá)PAOx的微生物在 反應(yīng)混合物中以游離形式或以固定化形式存在。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中重組微生物是功能性表達(dá)PAOx的細(xì)菌菌株， 特別地是大腸桿菌菌株。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中重組微生物攜帶具有編碼PAOx的核酸序列的表 達(dá)構(gòu)建體，所述核酸序列任選地適應(yīng)于所述微生物的密碼子選擇。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中微生物額外地表達(dá)至少一種支持 PAOx功能性表達(dá)（正確折疊）的伴侶蛋白。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中重組微生物是除了表達(dá)PAOx之外還表達(dá)一種或 多種選自GroEL和GroES的伴侶蛋白的細(xì)菌菌株。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在作為反應(yīng)介質(zhì)的底物中實(shí)施反應(yīng)。
15. 編碼PAOx的根據(jù)SEQ ID NO:3的核酸序列，其中該核酸序列適應(yīng)于微生物大腸桿 菌的密碼子選擇。
16. 表達(dá)構(gòu)建體，其根據(jù)權(quán)利要求11至14的任一項(xiàng)中定義或包含根據(jù)權(quán)利要求15所 述的核酸序列。
17. 重組微生物，其根據(jù)權(quán)利要求8至13的任一項(xiàng)中定義或包含根據(jù)權(quán)利要求15所述 的核酸序列或根據(jù)權(quán)利要求16所述的表達(dá)構(gòu)建體。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK104364387SQ201380024702
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月13日
【發(fā)明者】A·皮亞特西, W·塞格爾, K-U·鮑爾代紐斯 申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司