用于真核細(xì)胞的培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及選自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、α-羥基異戊酸、α-羥基異己酸和三羥基丁酸以及它們的組合的C2-C6α-羥基酸在用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的培養(yǎng)基中作為生長(zhǎng)和生產(chǎn)促進(jìn)成分的用途。本發(fā)明另外涉及包含在至少0.001mg/l的水平的這些α-羥基酸衍生物的培養(yǎng)基。
【專利說明】用于真核細(xì)胞的培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)真核、具體地動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的生產(chǎn)，以及因此生產(chǎn)的細(xì) 胞培養(yǎng)基，和其用于真核、具體地動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)的的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 通過培養(yǎng)哺乳動(dòng)物、植物或昆蟲細(xì)胞，有價(jià)值的生物化學(xué)品和生物醫(yī)藥品，例如抗 體和抗生素的生產(chǎn)需要適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。已經(jīng)用包含未定義的成分（如胎牛血清（FCS)，幾 種動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)和/或牛來源的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物）的一系列添加物補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基成 分。
[0003] 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中使用的血清或血清來源的物質(zhì)，如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素， 可以包含可能污染培養(yǎng)物以及由這些所獲得的生物醫(yī)藥產(chǎn)品的不需要的試劑。此外，像牛 肉或膠原水解產(chǎn)物的牛來源蛋白產(chǎn)品承受BSE污染的風(fēng)險(xiǎn)。而且，必須對(duì)所有已知的病毒， 包括可以通過血清傳輸?shù)母窝缀虷IV，測(cè)試來源于人類血清中的添加劑。
[0004] 總之，通過未知的試劑可以污染所有血清衍生的產(chǎn)品。在細(xì)胞培養(yǎng)中，在血清或蛋 白質(zhì)添加劑來源于人類或其它動(dòng)物來源的情況下，無數(shù)的問題（例如，不同批次的質(zhì)量和 組成變化，以及病毒、支原體或BSE污染的風(fēng)險(xiǎn)）可以發(fā)生。因此，植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或 植物蛋白胨普遍使用于應(yīng)當(dāng)不含動(dòng)物組分的培養(yǎng)基。
[0005] 然而，在沒有動(dòng)物來源的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的培養(yǎng)基中，動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)率總 是無法令人滿意的。頻繁地觀察到，體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞成團(tuán)（in lump)生長(zhǎng)。這被認(rèn)為 是欠佳的條件，因?yàn)閯儕Z了在團(tuán)的核心的細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物，并且細(xì)胞將會(huì)死亡。在下游處理過 程中，還存在堵塞管路或過濾器的風(fēng)險(xiǎn)。通過它們的外觀也可以評(píng)估細(xì)胞下降的活力。具 有下降的活力的細(xì)胞顯示出不規(guī)則的形狀，即不圓的外形，并且還具有不同于具有完全明 亮的和透明的細(xì)胞內(nèi)含物的健康細(xì)胞的"成粒"細(xì)胞內(nèi)含物。
[0006] W02006/123926涉及在至少一種植物蛋白來源（優(yōu)選地，來自油菜、小麥或香菜） 的基礎(chǔ)上的一種用于生長(zhǎng)和/或培養(yǎng)微生物和/或細(xì)胞的肽組合物。在實(shí)施例中介紹了小 麥水解產(chǎn)物的效果。
[0007] W02006/128764公開了用于培養(yǎng)生產(chǎn)復(fù)合蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其中，向 細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)料一種或多種植物來源的蛋白胨。舉例證明了植物來源大豆、棉籽和豌豆。 在伴隨實(shí)施例中顯示了大豆水解產(chǎn)物對(duì)CH0細(xì)胞培養(yǎng)的影響。
[0008] W02009/020389公開了向日葵屬（向日葵）物質(zhì)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物作為用于培養(yǎng) 真核、具體地動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基組分的用途。
[0009] US2003/0203448A1描述了用于細(xì)胞培養(yǎng)的無蛋白質(zhì)的和無血清的培養(yǎng)基，包含大 豆水解產(chǎn)物和可選地添加的游離氨基酸。
[0010] Nicoll 等人，Connective Tissue Research,第 42 卷，第 1 期，第 59-69 頁公 開了乳酸在人類皮膚的成纖維細(xì)胞中對(duì)于軟骨形成（軟骨發(fā)展）的誘導(dǎo)的影響的研究。其 中，細(xì)胞在包含用10%胎牛血清（FBS)、青霉素、鏈霉素以及80mM乳酸補(bǔ)充的最小必需培養(yǎng) 基（MEM)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
[0011] Morishima 等人，Neuroscience Research,第 61 卷，第 1 期，第 18-26 頁研究 了在培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中，乳酸對(duì)水通道蛋白質(zhì)水通道蛋白（AQP4)的表達(dá)和定位 的影響。對(duì)于這種影響，在包含達(dá)爾貝科改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基（DMED)、10%胎牛血清（FBS) 以及15-45mM乳酸或乳酸鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞。
[0012] Lampe 等人，Biotechnology and Bioengineering,第 103 卷，第 6 期，第 1214-1223頁公開了乳酸對(duì)于神經(jīng)前體細(xì)胞的影響的調(diào)查研究。其中，在包括DMEM、青霉 素、鏈霉素、N2、L-谷氨酰胺、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)以及至多達(dá)10mg/ml的乳酸 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0013] Kromenaker 等人，J. Biotechnol?，第 34 卷，1994，第 13-34 頁描述了乳酸濃度對(duì) 于雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體生產(chǎn)的細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)的影響。在包括DMEM、青霉素、鏈霉素、熱 滅活的馬血清以及至多達(dá)140mM的乳酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
[0014] Ballez等人公開了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，包含用0. 1%普朗尼 克（pluronic)F68、0. 04pM亞硒酸鈉和500iiM檸檬酸鐵補(bǔ)充的基礎(chǔ)確定的培養(yǎng)基（BDM) (第105頁，頂部），以及稻谷或小麥蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
[0015] US2002/0039787公開了用于在體外培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，所述方法包括， 在存在有效量的人類血清下，培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的富集群。
[0016] 植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的功能性是它的化學(xué)成分的直接結(jié)果。它受到如原料、加工 因素、過程控制和儲(chǔ)存條件的幾個(gè)因素的影響。因此，它導(dǎo)致一種持久的仍很少研究的定義 為"批次間偏差"的現(xiàn)象。
[0017] 生物制藥工業(yè)對(duì)其表示了重要的關(guān)注，其是這些水解產(chǎn)物的消費(fèi)者，因?yàn)樗梢?意味著在產(chǎn)品收率上10%至25%的偏差以及它具有直接的財(cái)政后果。本發(fā)明旨在解決這 些憂慮。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 已發(fā)現(xiàn)特定c2-c6 a-羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯以及它們的組合對(duì)于真核 細(xì)胞、特別是動(dòng)物細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)具有強(qiáng)的生長(zhǎng)和生產(chǎn)促進(jìn)效果。這些化合物的最低 水平的存在導(dǎo)致一致的并且因此商業(yè)上有吸引力的產(chǎn)品性能。包含這些衍生物的培養(yǎng)基極 其適用于培養(yǎng)真核、具體地動(dòng)物細(xì)胞。因此本發(fā)明提供了一種包含這些特定a-羥基酸、它 們的鹽或它們的酯的細(xì)胞培養(yǎng)基，以及生產(chǎn)這些培養(yǎng)基的方法和使用包含作為培養(yǎng)基組分 的這些a -羥基酸、它們的鹽或它們的酯的組合物用于在體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的方法。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)用于培養(yǎng)真核細(xì)胞、具體地動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的方法，涉及 選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、a-羥 基異戊酸、ct-輕基異己酸以及三輕基丁酸（赤酮酸，erythronic acid)的一種或多種 C2_C6 a-羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的酯以及它們的組合作為生長(zhǎng)促進(jìn)或生產(chǎn)改進(jìn)成 分的用途。本發(fā)明也涉及用于培養(yǎng)真核、具體地動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，基于干重，包含至少 0? 02ppm(0. 02mg/kg)，優(yōu)選地至少0? 2mg/kg，更優(yōu)選地至少2mg/kg，甚至更優(yōu)選地至少 20mg/kg，最優(yōu)選地至少50ppm(50mg/kg)的一種或多種上述的a-輕基酸或它們的衍生物。
[0020] 在本文描述的任何地方，給定的本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的成分的量都是基于干重， 通過任意地取5% (50g/l)的干固體含量可以得出在液體培養(yǎng)基中的最終濃度，并且反之 亦然。因此，為了得到優(yōu)選的水平，l〇〇mg/kg干物質(zhì)的量對(duì)應(yīng)5mg/l的最終的液體培養(yǎng) 基。這決不意味著液體培養(yǎng)基的干固體含量應(yīng)當(dāng)是5%。取決于特定細(xì)胞培養(yǎng)濃度，干固 體的水平可以選擇為例如〇. 5wt %至30wt %，優(yōu)選地0. 5wt %至15wt %，更優(yōu)選地lwt %至 15wt %，最優(yōu)選地lwt %至5wt %。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明供使用的c2-c6 a -羥基酸在c2-c6主鏈處可以可選地被取代。適合的 取代基包括鹵素、酯、醚、羥基、氨基以及芳香族基團(tuán)。
[0022] 優(yōu)選的鹽是本發(fā)明的C2_C6 a -羥基酸的鈉、鉀、鈣、鎂或銨鹽。
[0023] 優(yōu)選的酯是本發(fā)明的C2_C6a_羥基酸的直鏈或支鏈的酯。
[0024] 具體地，根據(jù)本發(fā)明供使用的優(yōu)選的化合物是粘酸和甲基-L-3-苯基乳酸酯。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明使用的a-羥基酸、它們的鹽以及它們的酯可以像這樣使用。大部分 組分是商購的?；蛘?，它們可以通過通常已知的合成或半合成過程產(chǎn)生。大部分的衍生物 也可以從適合的蛋白質(zhì)部分或水解產(chǎn)物，特別地植物來源的蛋白質(zhì)如從大豆、豌豆、扁豆、 小麥（麩質(zhì)）、棉籽（棉子）、稻谷、向日葵、紅花等中分離得到。從蛋白質(zhì)部分、或更方便地 從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中提取或富集它們。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的。
[0026] 本發(fā)明因此涉及一種通過向培養(yǎng)基的另外的組分添加以下物質(zhì)生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基 的方法：一定量的選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥 基丁酸、羥基異戊酸、羥基異己酸以及三羥基丁酸的一種或多種C 2_C6 a-羥基酸， 這些酸的鹽，這些酸的酯以及它們的組合，使得根據(jù)本發(fā)明并且在下面詳細(xì)描述的每種單 獨(dú)的a -輕基酸或衍生物在培養(yǎng)基中的最終濃度為至少〇.〇〇lmg/l，優(yōu)選地至少0. 01mg/l， 更優(yōu)選地至少〇. lmg/1，最優(yōu)選地至少lmg/1。優(yōu)選地，每種單獨(dú)的a-羥基酸、這種酸的鹽 或這種酸的酯在培養(yǎng)基中最終濃度為至多50g/l，優(yōu)選地至多l(xiāng)g/1，更優(yōu)選地至多100mg/ 1?？梢韵襁@樣添加衍生物，例如純化的和/或合成的產(chǎn)品。優(yōu)選地，這樣的純化和/或合 成的組分具有至少80 %，更優(yōu)選地至少90 %，最優(yōu)選地至少95 %的純度?；蛘?，可以作為濃 縮物添加化合物，即通過濃縮或富集根據(jù)本發(fā)明的一種或多種a -羥基酸或其衍生物的溶 液至按重量計(jì)至少〇. 01%，優(yōu)選地至少〇. 1%，更優(yōu)選地至少1%，最優(yōu)選地至少10%，或者 甚至至少25 %，和優(yōu)選地按重量計(jì)至多80 %，更優(yōu)選地至多70 %的水平，或者具有優(yōu)選地 至少0. lmg，更優(yōu)選地至少lmg，甚至更優(yōu)選地至少10mg，甚至更優(yōu)選地至少lg，還更優(yōu)選地 至少10g，最優(yōu)選地至少100g每kg的干物質(zhì)的濃度可獲得的產(chǎn)品。
[0027] 在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語"培養(yǎng)基的另外的組分"和"另外的常規(guī)培養(yǎng)基組分"是指 本領(lǐng)域通常已知的作為細(xì)胞培養(yǎng)基的組分的化合物，如植物或動(dòng)物細(xì)胞因子和/或生長(zhǎng)因 子（條件是這些不是動(dòng)物來源的）、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、緩沖鹽、微量元素（痕量元素， trace element)、核苷、核苷酸、植物激素、包括葡萄糖的糖，抗生素等。植物激素包括生長(zhǎng) 激素、赤霉素、脫落酸以及它們的組合。取決于設(shè)想的細(xì)胞系和細(xì)胞方面，技術(shù)人員能夠選 擇期望的或需要的另外的培養(yǎng)基組分的類型和數(shù)量。
[0028] 本發(fā)明另外涉及通過這種方法可獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基。更具體地，本發(fā)明涉及一 種用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的培養(yǎng)基，包含至少〇.〇〇lmg/l，優(yōu)選地至少0. 01mg/l，更優(yōu)選地至 少0. lmg/1，甚至更優(yōu)選地至少每lmg/1，最優(yōu)選地至少5mg/l的最終液體培養(yǎng)基的選自 L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、a-羥基異戊 酸、a-羥基異己酸以及三羥基丁酸的一種或多種C 2-C6a-羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的 酯或它們的組合，其中，濃度是每種單獨(dú)的組分。優(yōu)選地，每種所述單獨(dú)的組分在培養(yǎng)基中 的最終濃度為至多50g/l，優(yōu)選地至多l(xiāng)g/1，更優(yōu)選地至多100mg/l。就本發(fā)明的細(xì)胞培 養(yǎng)基的干重而言，它包含至少〇. 〇2mg/kg，優(yōu)選地至少0. 2mg/kg，更優(yōu)選地至少2mg/kg，甚 至更優(yōu)選地至少20mg/kg，最優(yōu)選地至少250mg/kg的干物質(zhì)，以及至多1000g，優(yōu)選地至多 2〇g，更優(yōu)選地至多2g每kg的干物質(zhì)的選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡 糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、a -羥基異戊酸、a -羥基異己酸以及三羥基丁酸的一種或多 種C2_C6a -羥基酸，這些酸的鹽、這些酸的酯或它們的組合，其中，濃度是每種單獨(dú)的組分。
[0029] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含5mg/l至30g/l每種單獨(dú)的組分， 或者100mg至600g，優(yōu)選地250mg至150g每kg干物質(zhì)的濃度的一種或多種上述a -輕基 酸或它們的酯或鹽。更優(yōu)選的水平是l〇mg/l至lg/1或者200mg至100g，優(yōu)選地500mg至 50g每kg的干物質(zhì)，甚至更優(yōu)選地20mg/l至500mg/l或者lg至25g每kg干物質(zhì)。
[0030] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的a-羥基酸、它們的鹽或它們的酯用 作一種或多種植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的部分。
[0031] 在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種或多種a-羥基酸、它們的鹽或它們的酯、 或它們的組合與一種或多種植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合使用或添加至一種或多種植物蛋白 質(zhì)水解產(chǎn)物。
[0032]在液體培養(yǎng)基中（基本上水可溶性的）水解產(chǎn)物的量可以由技術(shù)人員確定，但是 包含優(yōu)選地〇?〇〇l_l〇.〇wt/vol%，更優(yōu)選地0? 01-10. Owt/vol%，更優(yōu)選地0? 01-4. Owt/ vol%，甚至更優(yōu)選地0? 05-2. Owt/vol%，或0? 05-1. Owt/vol%，甚至更優(yōu)選地0? 1-1. Owt/ vol%，并且最優(yōu)選地0? 2-0. 6wt/vol%。
[0033] 通過本領(lǐng)域已知的方法，例如通過壓制、磨制、剝殼和/或粉碎，通過處理豆、豆 莢、種子等，若需要緊接著脫脂，例如使用如己烷的有機(jī)溶劑，可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。優(yōu) 選地，脫脂的種子材料包含至少20wt%的蛋白質(zhì)。脫脂的種子材料優(yōu)選地具有不到10wt% 的脂肪含量。
[0034] 通常，通過酶促蛋白水解作用獲得蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，也可以將其稱為蛋白水解產(chǎn) 物（proteolysate)。（脫脂的）植物種子材料（可選地粉碎的）經(jīng)受使用來自于細(xì)菌、真 菌、植物或動(dòng)物來源的內(nèi)切和/或外切蛋白酶或它們的混合物的水解作用；然而，優(yōu)選地， 酶不來自于動(dòng)物來源。使用重組DNA技術(shù)可以生產(chǎn)酶。優(yōu)選的酶是內(nèi)切蛋白酶。更優(yōu)選地， 酶包含堿性蛋白酶。適合的蛋白酶包含枯草桿菌蛋白酶（Alcalase)，絲氨酸內(nèi)切蛋白酶。 特別適合的酶包含來自Novozymes的枯草桿菌蛋白酶，和/或來自于Merck的木瓜蛋白酶。 其它適合的酶包含，例如中性蛋白酶（Neutrase)。
[0035] 水解作用的條件包括30分鐘至30小時(shí)；優(yōu)選地1-6小時(shí)，最優(yōu)選地2-4小時(shí)的反 應(yīng)時(shí)間；溫度是20至65°C，優(yōu)選地40°C至60°C，全部取決于特定的蛋白質(zhì)來源和期望的水 解程度。pH值可以調(diào)整為6.0至8. 5,優(yōu)選地6. 6至8.0,最優(yōu)選地為7.0-8. 0。在溶液中 待水解的蛋白質(zhì)的濃度是1至10 %，優(yōu)選地2-8，最優(yōu)選地3-6wt %的蛋白質(zhì)?；诘孜?，使 用的酶的量為〇? 5-10wt%，優(yōu)選地l-5wt%，最優(yōu)選地1. 5-3. 5wt%。
[0036] 優(yōu)選地，進(jìn)行水解作用直至獲得5至50%，優(yōu)選地10至40%，最優(yōu)選地10至 30%的水解程度。使用熱處理停止水解反應(yīng)。優(yōu)選地，熱處理包括80至100°C 15至90 分鐘的加熱時(shí)間（批量熱處理），或在100-120°Cl-5分鐘的加熱時(shí)間。采用常規(guī)的甲醛 滴定可以確定水解的程度，如在實(shí)施例中所確定的。在水解反應(yīng)終止之后，可以可選地精 煉（polish)反應(yīng)混合物以去除不可溶的部分，例如使用離心作用或者諸如硅藻土（例如 Celitex，Dicaliteu, Hyfl〇K )的在本領(lǐng)域中已知的過濾助劑。優(yōu)選地，基于干物質(zhì)，水 解產(chǎn)物包含不到l〇wt%的不可溶于水的材料，更優(yōu)選地不到5wt%，最優(yōu)選地不到2wt%。 例如，通過噴霧干燥或冷凍干燥可以干燥水解產(chǎn)物?？梢韵襁@樣使用或者可以進(jìn)一步分餾 水解產(chǎn)物。
[0037]基于總蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，水解產(chǎn)物包含20至80wt %，特別地20至60wt %的具有 100-500Da的分子量的肽和/或10至30wt%的500至lOOODa的分子量的肽。就肽長(zhǎng)度而 言，基于總蛋白質(zhì)，水解產(chǎn)物優(yōu)選地包含至少15wt%，更優(yōu)選地至少25wt%，最優(yōu)選地至少 35wt%，至多達(dá)例如85wt%，更優(yōu)選地至多達(dá)65wt%，最優(yōu)選地至多達(dá)55wt%的二肽至五 肽，8至30wt%的六肽至九肽，至少8wt%，特別地，15至60wt%的高級(jí)肽（higher peptide) 和0. 1至30wt %，優(yōu)選地0.5至10wt %的游離氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以超濾水 解產(chǎn)物，優(yōu)選地，使用5或10kDa分子量的截留（cut-off)。水解產(chǎn)物可以包含另外的組分， 如碳水化合物、可溶纖維、多價(jià)金屬鹽等。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)的含量（所有蛋白質(zhì)類材料，包括 游離氨基酸）是30至90wt %，更優(yōu)選地45至85wt %。這些量是基于干重的。
[0038] 水解產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基的其它常規(guī)組分組合，如植物或動(dòng)物細(xì)胞因子和/或生長(zhǎng) 因子（條件是這些不是動(dòng)物來源的）、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、緩沖鹽、微量元素、核苷、核 苷酸、植物激素、包括葡萄糖的糖、抗生素等等。植物激素包含生長(zhǎng)激素、赤霉素、脫落酸以 及它們的組合。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含選自氨基酸衍生物；酚酸衍生物；直鏈 c 2-c6或環(huán)狀C6糖醇；批陡酸（pyridinic acid)衍生物；以及選自尿啼陡、腺噪呤、3'-單磷 酸腺苷（3'_AMP)和5'-單磷酸腺苷的核堿基和/或核苷酸的一種或多種化合物；以及來自 這些化合物組的化合物的組合。這些化合物的濃度為至少0. 00lmg/1，優(yōu)選地至少0. 0lmg/ 1，更優(yōu)選地至少〇. lmg/1，甚至更優(yōu)選地至少lmg/1，最優(yōu)選地至少5mg/l的最終的液體培 養(yǎng)基，其中濃度是每種單獨(dú)的組分。優(yōu)選地，在培養(yǎng)基中的最終濃度為至多50g/l，優(yōu)選地至 多l(xiāng)g/1，更優(yōu)選地至多l(xiāng)〇〇mg/l每種所述單獨(dú)的組分。
[0040] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自Y -谷氨?；被?、焦谷氨 ?；被?、包含谷氨酸（glutamate-containing)或包含脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高 氨基酸（homo-amino acid)、N-乙?；?氨基酸以及甘氨?；?甘氨酸的一種或多種氨基 酸衍生物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自N-乙酰基-甲硫氨酸、 N-乙?；?苯丙氨酸、N-乙?；?鳥氨酸、谷氨?；野彼?、谷氨酰基苯丙氨酸、 焦谷氨酰基谷氨酰胺、焦谷氨?；拾彼帷⒗i氨?；劝彼幔ɡi氨酰基谷氨酸酯，valinyl glutamate)、甘氨?；彼帷h(huán)甘氨?；?谷氨酰胺、5-氧代脯氨酸，以及S-氧代-甲硫 氨酸、和3 -丙氨酸、2-氨基丁酸、甘氨酰基-甘氨酸和高絲氨酸的一種或多種氨基酸衍生 物。
[0041] 在另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含一種或多酚酸衍生物、這些 酚酸衍生物的酯或這些酚酸衍生物的鹽。應(yīng)理解術(shù)語"酚酸衍生物"包括含有酚環(huán)和有機(jī)羧 酸官能的具有Ci-Ce骨架（主鏈，skeleton)的所有有機(jī)化合物，并且這些有機(jī)化合物可以被 例如鹵素、酯、醚、羥基、氨基和/或芳香族基團(tuán)在Ci-C；骨架和/或酚環(huán)進(jìn)一步取代。在特 別優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自阿魏酸（(E)-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯 基）丙-2-烯酸）、丁香酸（4-羥基-3, 5-二甲氧基苯甲酸）、香草酸（4-羥基-3-甲氧基苯 甲酸）、芥子酸（3_(4_羥基-3, 5-二甲氧基苯基）丙-2-烯酸）的一種或多種酚酸衍生物， 這些酸的Ci_c4酯，或這些酸的鹽。最優(yōu)選的酚酸衍生物是阿魏酸、丁香酸，這些酸的 Ci_c4 酯或這些酸的鹽。
[0042]在另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含一種或多種酚酸衍生物。應(yīng) 理解術(shù)語"酚酸衍生物"包括含有吡啶環(huán)（C5H4N)和有機(jī)羧酸官能的具有Ci-C；骨架所有有機(jī) 化合物，并且這些有機(jī)化合物可以被例如鹵素、酯、醚、羥基、氨基和/或芳香族基團(tuán)在Ci-Q 骨架和/或吡啶環(huán)進(jìn)一步取代。吡啶氮也可以是季銨化的，即用直鏈、支鏈、飽和的或不飽 和的脂肪族或芳香烴烷基化。
[0043] 優(yōu)選的鹽是本發(fā)明的吡啶酸衍生物的鈉、鉀、鈣、鎂或銨鹽。
[0044]優(yōu)選的酯是本發(fā)明的吡啶酸衍生物的直鏈或支鏈酯。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的供使用的特別優(yōu)選的吡啶酸衍生物是葫蘆巴堿（1-甲基吡啶-3-羧 酸鹽）。
[0046] 在另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含一種或多種直鏈C 2_C6糖醇 或環(huán)狀C6糖醇。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語"C2_C 6糖醇"是指具有通式H(HCH0)n+1H的直鏈化 合物，其中n是1、3、4或5,以及環(huán)狀(： 6化合物環(huán)己烷-1，2,3,4,5,6-六醇。這些化合物 的典型的實(shí)例分別是木糖醇、蘇糖醇、甘露醇和肌醇、異肌醇、L-手性-肌醇和D-手性-肌 醇。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含一種或多種糖醇，這些糖醇選自手性 肌醇、赤蘚醇、蘇糖醇以及山梨醇，最優(yōu)選地手性肌醇。
[0047] 在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自尿嘧啶、腺嘌呤、3' -單 磷酸腺苷（3' -AMP)以及5' -單磷酸腺苷（AMP)的一種或多種核堿基和/或核苷酸。
[0048] 在本發(fā)明典型的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二） 酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2_羥基丁酸、a _羥基異戊酸、a _羥基異己酸以及三羥基丁 酸的一種或多種C2_C6 a _羥基酸，這些酸的鹽、這些酸的酯；以及選自Y _谷氨?；被?、 焦谷氨酰基氨基酸、包括谷氨酸鹽/酯或包括脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、N-乙 ?；?氨基酸以及甘氨酰基-甘氨酸的一種或多種氨基酸衍生物，其中這些化合物的濃度 為至少0. 001mg/l，優(yōu)選地至少0. 01mg/l，更優(yōu)選地至少0. lmg/1，甚至更優(yōu)選地至少lmg/ 1，最優(yōu)選地至少5mg/l的最終液體細(xì)胞培養(yǎng)基，其中濃度是每種單獨(dú)的組分。優(yōu)選地，在培 養(yǎng)基中的最終濃度為至多50g/l，優(yōu)選地至多l(xiāng)g/1，更優(yōu)選地至多100mg/l每種所述單獨(dú)的 組分。
[0049] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖 二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2_羥基丁酸、a _羥基異戊酸、a _羥基異己酸以及三羥 基丁酸的一種或多種C2_C6 a _羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的酯；以及選自Y _谷氨?；?基酸、焦谷氨酰基氨基酸、包括谷氨酸鹽/酯或包括脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、 N-乙?；?氨基酸以及甘氨酰基-甘氨酸的一種或多種氨基酸衍生物；一種或多種酚酸衍 生物、這些酚酸衍生物的酯或這些酚酸衍生物的鹽；一種或多種直鏈c2-c6糖醇或環(huán)狀c 6糖 醇；選自尿嘧啶、腺嘌呤、3'-單磷酸腺苷（3'-AMP)以及5'-單磷酸腺苷（AMP)的一種或多 種核堿基和/或核苷酸；葫蘆巴堿（1-甲基吡啶-3-羧酸鹽），其中這些化合物的濃度為至 少0. 001mg/l，優(yōu)選地至少0. Olmg/1，更優(yōu)選地至少0. lmg/1，甚至更優(yōu)選地至少lmg/1，最 優(yōu)選地至少5mg/l的最終液體細(xì)胞培養(yǎng)基，其中濃度是每種單獨(dú)的組分。優(yōu)選地，在培養(yǎng)基 中的終濃度為至多50g/l，優(yōu)選地至多l(xiāng)g/1，更優(yōu)選地至多100mg/l每種所述單獨(dú)的組分。
[0050] 商購的基礎(chǔ)培養(yǎng)基也可以與本發(fā)明的a-羥基酸和可選的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物組合 使用?？梢允褂玫膭?dòng)物細(xì)胞系如來自于Lonza的CH0-1、⑶-CH0、PowerCHO,來自于Irvine Scientific的ISCH0-CD，或者來自于SAFC的Excell 325PF CH0。對(duì)于植物細(xì)胞，可以使用 從SAFC可獲得的Murashige和Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基。水解產(chǎn)物也可以是來自于不同的蛋白 質(zhì)來源的水解產(chǎn)物，如來自小麥和大豆、大豆和豌豆、稻谷和棉籽的水解產(chǎn)物。優(yōu)選地，細(xì)胞 培養(yǎng)基不包含諸如胎牛血清的血清或血清來源的組分，以使得是完全可復(fù)制的和/或避免 污染。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基不含動(dòng)物組分，如動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)和/或動(dòng)物（例如牛來源） 的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在本文中所定義的用于培養(yǎng)真 核細(xì)胞的無血清的培養(yǎng)基，和制備這樣的無血清培養(yǎng)基的方法。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法能夠支持真核、具體地動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，其 中能力指的是在體外通過細(xì)胞能夠至少生存、增殖和/或分化，并且優(yōu)選地進(jìn)行產(chǎn)物的表 達(dá)。在分批、補(bǔ)料、連續(xù)或灌注的反應(yīng)器中培養(yǎng)均是設(shè)想到的。
[0052] 在細(xì)胞倍增和生長(zhǎng)的實(shí)際生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段中，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以是分離的， 在生產(chǎn)階段中，細(xì)胞或多或少處于一種穩(wěn)定的狀態(tài)，只是開始產(chǎn)生感興趣的代謝物，例如抗 體。本發(fā)明的a-羥基酸能夠支持動(dòng)物或其它真核細(xì)胞的生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段。
[0053] 可以以液體或以粉末的、干燥的形式提供細(xì)胞培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中（基本上 水可溶性的）粉末的或干燥的細(xì)胞培養(yǎng)組分的量可以通過技術(shù)人員確定，但是包含優(yōu)選 地 0? 01-10. Owt/vol %，更優(yōu)選地 0? 01-4. Owt/vol %，甚至更優(yōu)選地 0? 05-2. Owt/vol %，或 0? 05-1. Owt/vol %，甚至更優(yōu)選地 0? 1-1. Owt/vol %，并且最優(yōu)選地 0? 2-0. 6wt/vol %。
[0054] 在可以用水重建的干燥細(xì)胞培養(yǎng)基中水解產(chǎn)物的量取決于培養(yǎng)基組分，但是典型 地在2-80% w/w，優(yōu)選地5-50% w/w的范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基也包含糖、具體地葡 萄糖，優(yōu)選地10至〇. 1、更優(yōu)選地2. 5至0. 4的葡萄糖和水解產(chǎn)物的干重比率，以及上述的 另外的成分。
[0055] 而且，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基的用途。真核生物包括真菌 (包括酵母）、原生生物、色藻界、植物界以及后生動(dòng)物（動(dòng)物）。本發(fā)明特別涉及用于培養(yǎng) 植物細(xì)胞（例如稻谷、煙草和玉米），并且尤其是動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選地，體外培養(yǎng)的用途。所要 培養(yǎng)的細(xì)胞可以是自然來源的或者可以是遺傳改變的。動(dòng)物細(xì)胞特別包含脊椎動(dòng)物和無脊 椎動(dòng)物細(xì)胞，包含諸如人類細(xì)胞（例如，PER C6 ce丨丨S& )的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞， 具體地，中國(guó)倉鼠卵巢（CH0)細(xì)胞、鳥、魚、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞。
[0056] 通過本發(fā)明的方法培養(yǎng)的細(xì)胞特別適用于在生物制藥業(yè)中可以進(jìn)一步純化的蛋 白質(zhì)產(chǎn)品的表達(dá)。在非限制的實(shí)施例中，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，可以有利地生產(chǎn)包含促紅細(xì) 胞生成素（用于治療血液障礙），依那西普（用于治療風(fēng)濕病和痛風(fēng)的TNF-a抑制劑），a 鏈球菌（用于治療囊腫性纖維化的脫氧核糖核酸酶）、0 -干擾素（對(duì)于治療多發(fā)性硬化） 以及大范圍的治療性單克隆抗體的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。可以通過本領(lǐng)域已知的方法回收蛋白質(zhì)產(chǎn) 品，如通過分餾、親和色譜法（吸附-脫附）等，或者它們的組合從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞和從 無細(xì)胞液體（上清液）中分離蛋白質(zhì)產(chǎn)品。
[0057] 而且，本發(fā)明涉及一種試劑盒，包括含有選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、 葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、a-羥基異戊酸、a-羥基異己酸以及三羥基丁酸 的一種或多種C 2_C6 a -羥基酸，這些酸的鹽、這些酸的酯以及它們的組合的部分，以及選自 植物水解產(chǎn)物、植物或動(dòng)物細(xì)胞因子和/或生長(zhǎng)因子、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、緩沖鹽、微 量元素、核苷、植物激素、核苷酸、糖以及抗生素的一種或多種培養(yǎng)基的組分。在試劑盒中的 組分可以作為一種或多種組合存在。例如，本發(fā)明的羥基酸可以單獨(dú)地以干燥的或溶 解的形式存在，并且部分或全部的培養(yǎng)基的另外的組分，如植物水解產(chǎn)物、植物或動(dòng)物細(xì)胞 因子和/或生長(zhǎng)因子、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、緩沖鹽、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、 糖以及抗生素，可以作為單獨(dú)的組合存在?；蛘?，a-羥基酸可以與例如氨基酸和/或肽和 /或糖預(yù)先混合，并且任何剩余的組分可以單獨(dú)地或以一種或多種組合存在。優(yōu)選地，至少 一種組合物是液體，液體可以有利地是滅菌的。在使用培養(yǎng)基之前混合試劑盒的組分。
[0058] 因而發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的特定C2-C6a-羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯，以及它 們的用途具有幾個(gè)重要的優(yōu)勢(shì)。它們具有生長(zhǎng)促進(jìn)的效果，其超過由常見蛋白質(zhì)組分提供 的生長(zhǎng)。它們導(dǎo)致提高的生產(chǎn)，生產(chǎn)和/或生長(zhǎng)較低的差異，并且是成本有效的。
[0059] 在體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞不是成團(tuán)或成簇生長(zhǎng)的，而是作為單個(gè)細(xì)胞存在。其次，如 通過完好的圓形和明亮的透明細(xì)胞內(nèi)含物所判斷的，細(xì)胞的活力極好。第三，在沒有損害期 望的細(xì)胞產(chǎn)物的表達(dá)水平的情況下，相比于如那些基于無血清蛋白質(zhì)、具體地大豆蛋白質(zhì) 的現(xiàn)有技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基，可以獲得高得多的細(xì)胞密度。第四，根據(jù)本發(fā)明的C 2_C6 a -羥基 酸、它們的酯和它們的鹽可以與任何用于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組合，使得能夠 生產(chǎn)具有上面提及的優(yōu)勢(shì)的多種細(xì)胞培養(yǎng)基。此外，培養(yǎng)可以延伸延長(zhǎng)的時(shí)間段，致使更高 的產(chǎn)品收率。
[0060] 實(shí)施例
[0061] 實(shí)施例1 :包含要求保護(hù)的a -羥基酸、這些酸的酯和這些酸的鹽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn) 物的分析，以及生長(zhǎng)刺激的證據(jù)
[0062] 通過使用Waters Acquity UPLC和由電噴射離子化（ESI)來源和線性離子阱 (LIT)質(zhì)譜儀組成的Thermo-Finnigan LTQ質(zhì)譜儀，通過液相色譜/質(zhì)譜法（LC/MS，LC/MS2) 分析從 FrieslandCampina Domo, USA 獲得的如 SE50MAF-UF、WGE80M-UF、CNE80M-UF、PCE80B 的商用植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。把樣品提取物分成兩個(gè)等分部分，干燥，然后在酸性或堿性 LC-相容性溶劑中重建。使用分離專用柱在兩次單獨(dú)注射中，使用酸性陽離子優(yōu)化的條件分 析一個(gè)等分部分，并且使用堿性負(fù)離子優(yōu)化的條件分析另一等分部分。使用均含有〇. 1 % 甲酸的水和甲醇梯度洗脫在酸性條件中重建的提取物，而也使用水/甲醇的堿性提取物包 含6. 5mM碳酸氫銨。MS分析在MS和使用動(dòng)態(tài)排除的數(shù)據(jù)依賴MS2掃描之間交替。通過比 較純化標(biāo)準(zhǔn)品的代謝物組學(xué)庫登記項(xiàng)（庫體，library entry)或重現(xiàn)的未知實(shí)體確定生物 化學(xué)品。對(duì)于特定化合物或同重元素的實(shí)體，色譜的特性和質(zhì)譜的組合給出了匹配的指示。 因此，產(chǎn)生了存在于植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的生物化學(xué)組分和它們的相對(duì)濃度的概述。而 且，在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中測(cè)試的所有水解產(chǎn)物用于細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體生產(chǎn)。在細(xì)胞生長(zhǎng)和化合 物分析數(shù)據(jù)中進(jìn)行線性回歸分析，以確定顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體生產(chǎn)的生物化學(xué)組分。 使用Microsoft Excel 2003的SLOPE功能，計(jì)算抗體生產(chǎn)和組分相對(duì)濃度之間的關(guān)系，其 結(jié)果示出于下表1中。正斜率越高，在細(xì)胞培養(yǎng)中生物化學(xué)組分的重要性越高。也使用MS Excel的關(guān)聯(lián)回歸函數(shù)計(jì)算p-值，其代表值的顯著性，越低的p-值（全部在0到1之間）， 測(cè)定值越顯著。
[0063] 表1:抗體產(chǎn)量和a-羥基酸衍生物的相對(duì)濃度的關(guān)系
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的培養(yǎng)基的方法，包括向另外的常規(guī)培養(yǎng)基成分添加選 自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、 α-羥基異 戊酸、α -羥基異己酸和三羥基丁酸的一種或多種C2_C6a -羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的 酯以及它們的組合作為生長(zhǎng)促進(jìn)和/或生產(chǎn)改進(jìn)成分的步驟， 使得每種單獨(dú)的α -羥基酸、其酯或其鹽在所述培養(yǎng)基中的最終濃度為至少〇. OOlmg/ 1，其中所述一種或多種C2_C6 α -羥基酸、這些酸的鹽或這些酸的酯作為純物質(zhì)或作為濃縮 物添加。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述培養(yǎng)基中的所述最終濃度為至少0. Olmg/ 1，更優(yōu)選地至少〇. lmg/1，最優(yōu)選地至少lmg/1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述C2_C6 α-羥基酸選自L-3-苯基乳酸和 粘酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，另外向所述培養(yǎng)基添加植物蛋白質(zhì) 水解產(chǎn)物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是小麥、大豆、棉花或 豌豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，或者這些水解產(chǎn)物的兩種或更多種的混合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，向所述培養(yǎng)基添加選自以下各項(xiàng)的 另外的一種或多種化合物：選自γ-谷氨?；被?、焦谷氨?；被?、包含谷氨酸或包 含脯氨酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、Ν-乙?；?氨基酸以及甘氨?；?甘氨酸的氨 基酸衍生物；酚酸衍生物；直鏈C 2-C6或環(huán)狀C6糖醇；吡啶酸衍生物；以及選自尿嘧啶、腺嘌 呤、3' -單磷酸腺苷（3' -AMP)和5' -單磷酸腺苷（AMP)的核堿基和/或核苷酸，或來自 這些化合物組的化合物的組合，使得每種單獨(dú)的化合物在所述培養(yǎng)基中的最終濃度為至少 0. 00 lmg/1，優(yōu)選地至少0. 0 lmg/1，更優(yōu)選地至少0. lmg/1，最優(yōu)選地至少lmg/1。
7. -種通過根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法可獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基。
8. -種用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的培養(yǎng)基，包含至少0. 〇〇lmg/l，或至少0. 02mg/kg的干物質(zhì) 的選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、α-羥 基異戊酸、α -羥基異己酸和三羥基丁酸的一種或多種C2_C6 α -羥基酸，這些酸的鹽，這些 酸的酯以及它們的組合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的培養(yǎng)基，包含至少0. 01mg/l，更優(yōu)選地至少0. lmg/1，甚 至更優(yōu)選地至少lmg/1，最優(yōu)選地至少5mg/l，或者至少0. 2mg/kg，更優(yōu)選地至少2mg/kg，甚 至更優(yōu)選地至少20mg/kg，最優(yōu)選地至少250mg/kg的干物質(zhì)的選自L-3-苯基乳酸、粘（半 乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、α -羥基異戊酸、α -羥基異己酸和三 羥基丁酸的一種或多種C2_C6 α -羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的酯以及它們的組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，包含至多50g/l，優(yōu)選地至多l(xiāng)g/Ι，更 優(yōu)選地至多l(xiāng)〇〇mg/l每種所述單獨(dú)的組分，或者至多1000g，優(yōu)選地至多20g，更優(yōu)選地至多 2g/kg的干物質(zhì)的一種或多種所述C 2_C6a -羥基酸、它們的酯、它們的鹽或它們的組合，其 中所述濃度是每種單獨(dú)的組分。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，以5mg/l至30g/l或100mg至 600g/kg干物質(zhì)，優(yōu)選地5mg/l至3g/l或100mg至150g，更優(yōu)選地250mg至60g/kg干物質(zhì) 的濃度的每種單獨(dú)的組分，包含一種或多種所述C 2-C6 α -羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯 以及它們的組合。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自維生素、 礦物質(zhì)、氨基酸、緩沖鹽、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、糖、抗生素和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物 的培養(yǎng)基的一種或多種常規(guī)組分。
13. 根據(jù)權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自小麥、大 豆、棉花或豌豆蛋白質(zhì)的一種或多種水解產(chǎn)物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含選自以下各項(xiàng) 的一種或多種化合物：由谷氨酰基氨基酸、焦谷氨?；被?、包含谷氨酸或包含脯氨 酸的二肽、氧代氨基酸、高氨基酸、N-乙?；?氨基酸和甘氨?；?甘氨酸組成的氨基酸 衍生物的組；酚酸衍生物；直鏈C 2-C6或環(huán)狀C6糖醇；吡啶酸衍生物；以及選自尿嘧啶、腺嘌 呤、3' -單磷酸腺苷（3' -AMP)和5' -單磷酸腺苷（AMP)的核堿基和/或核苷酸，或來自這 些化合物組的化合物的組合。
15. 根據(jù)權(quán)利要求7-14中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中，所述氨基酸衍生物選自γ-谷氨 ?；?酪氨酸、Y -谷氨?；奖彼帷h(huán)甘氨?；?谷氨酸、纈氨酰基谷氨酸、5-氧代脯氨 酸和β -丙氨酸。
16. 根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中，所述酚酸選自阿魏酸 ((Ε)-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基）丙-2-烯酸）、丁香酸（4-羥基-3, 5-二甲氧基苯 甲酸）、香草酸（4-羥基-3-甲氧基苯甲酸）、芥子酸（3-(4-羥基-3, 5-二甲氧基苯基） 丙-2-烯酸），這些酸的酯，或這些酸的鹽，優(yōu)選地，阿魏酸、丁香酸，這些酸的酯或這些酸的 鹽,這些酸的鹽和這些酸的酯。
17. 根據(jù)權(quán)利要求7-16中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含選自手性肌醇、赤蘚 醇、蘇糖醇、山梨醇和葫蘆巴堿的一種或多種化合物。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK104271734SQ201380024347
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月8日
【發(fā)明者】阿希謝卡·古普塔, 米雷列·瑪麗亞·加德利亞, 多米尼克·伊夫·威利·馬埃斯 申請(qǐng)人:菲仕蘭產(chǎn)品有限公司