L-核酸的酶促合成的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于添加一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸到第一L-核酸的3'端的方法，其中所述方法包括在包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)存在下使所述一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸與所述第一L-核酸反應(yīng)的步驟，其中所述酶活性能夠添加一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸到所述第一L-核酸的3'端。
【專利說明】L-核酸的酶巧合成
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到第一k核酸的3 '端的方法； 一種用于擴(kuò)增祀k核酸的方法；一種包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)；包含氨基酸序列的聚 合酶，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸；一種野生型聚合酶的聚合酶變體，其中 所述野生型聚合酶由根據(jù)SEQ ID NO: 15的氨基酸序列組成；一種野生型聚合酶的聚合酶變 體，其中所述野生型聚合酶由根據(jù)SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成；包含酶活性展現(xiàn)部分 的蛋白質(zhì)在用于添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸的方法中的用途；包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白 質(zhì)在用于擴(kuò)增祀心核酸的方法中的用途；一種用于鑒別結(jié)合祀分子的k核酸分子的方法； 一種用于分別產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)和聚合酶的方法；W及一種用于將第一D-膚或第一D-蛋白 質(zhì)與第二D-膚或第二D-蛋白質(zhì)彼此連接的方法。
[0002] 基因技術(shù)的可利用性在廣義上對(duì)醫(yī)學(xué)和診斷領(lǐng)域W及基礎(chǔ)研究在過去數(shù)十年間 所取得的進(jìn)展貢獻(xiàn)良多。基因技術(shù)所提供的合成力超過了化學(xué)合成的合成力。確切地說， 基因技術(shù)和基因工程允許使用原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的酶機(jī)制來產(chǎn)生事實(shí)上無限量的k膚 和k蛋白質(zhì)。確切地說，酶和聚合酶，或是野生型形式或是該些野生型形式的變體，允許通 過連接D-核酸的構(gòu)筑塊（即，D-核巧酸）到化學(xué)合成可實(shí)現(xiàn)的長度（至少未獲得合理的 產(chǎn)率）來合成所述D-核酸。
[0003]由于手性特異性，基因技術(shù)中所使用的酶僅能對(duì)應(yīng)地使用手性與其自身的手性相 符的構(gòu)筑塊和底物。對(duì)應(yīng)地具有相反手性的構(gòu)筑塊和底物可能不受酶活性影響。由于手性 互易原則，對(duì)應(yīng)地具有相反手性的構(gòu)筑塊和底物的處理要求酶也具有相反的手性。
[0004] 舉例來說，該種手性互易原則廣泛用于產(chǎn)生祀結(jié)合k核酸，該些祀結(jié)合k核酸也 是已知的并且稱為鏡像異構(gòu)體。迄今為止，鏡像異構(gòu)體都是利用W下方法鑒別；在第一步驟 中，使用D-核酸庫針對(duì)諸如D-膚或D-蛋白質(zhì)的祀分子或祀結(jié)構(gòu)的對(duì)映異構(gòu)形式進(jìn)行體外 選擇。在第二步驟中，將如此鑒別的能結(jié)合祀分子或祀結(jié)構(gòu)的對(duì)映異構(gòu)形式的D-核酸制備 為對(duì)應(yīng)的心核酸。由于手性互易原則，該些k核酸（即鏡像異構(gòu)體）能夠結(jié)合真實(shí)或?qū)?際的祀分子，諸如k膚或k蛋白質(zhì)，而不結(jié)合用于選擇過程的其對(duì)映異構(gòu)形式，諸如D-膚 或D-蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述真實(shí)的或?qū)嶋H的祀分子或祀結(jié)構(gòu)是諸如人體或動(dòng)物體的生物學(xué) 系統(tǒng)中存在的祀分子或祀結(jié)構(gòu)。用于制備所述鏡像異構(gòu)體的方法描述于例如'TheAptamer Hanclbook'化Iussmann編，2006)中。
[0005] 使鑒別鏡像異構(gòu)體的方法更容易的一種方式可能是重新設(shè)計(jì)所述方法，W便使用 祀分子或祀結(jié)構(gòu)直接從k核酸庫選擇k核酸，因?yàn)閷?duì)映異構(gòu)體形式由真實(shí)的或?qū)嶋H的祀 分子或祀結(jié)構(gòu)展現(xiàn)。由于所述方法的一部分是對(duì)最初對(duì)應(yīng)地結(jié)合祀分子和祀結(jié)構(gòu)的那些 k核酸進(jìn)行擴(kuò)增，故將會(huì)需要能添加至少一個(gè)核巧酸到k引物的聚合酶。迄今為止，已知 還沒有聚合酶由能夠該樣做的k氨基酸組成。因此，需要由D-氨基酸組成的聚合酶和類似 的酶。由于基因技術(shù)不能提供該樣的由D-氨基酸組成的功能活性聚合酶，故需要進(jìn)行化學(xué) 合成。然而，D-蛋白質(zhì)或D-多膚的合成僅限于相對(duì)較小的分子。迄今合成的最大的D-蛋 白質(zhì)是由102個(gè)D-氨基酸組成的血管生成蛋白血管內(nèi)皮生長因子（縮寫VEGF-A)的D-蛋 白質(zhì)形式（Mandal等，2012)，然而，聚合酶通常由超過300個(gè)氨基酸組成。
[0006] 因此，本發(fā)明潛在的問題是提供了一種允許添加至少一個(gè)核巧酸到諸如引物的 k核酸的方法。本發(fā)明的另一個(gè)潛在問題是提供了一種使用k核巧酸擴(kuò)增祀k核酸的方 法。本發(fā)明的另一個(gè)潛在問題是提供了允許實(shí)施該些方法的手段。
[0007] 所附的獨(dú)立權(quán)利要求的主題解決了本發(fā)明的該些及其它潛在問題。可W根據(jù)所附 的從屬權(quán)利要求來進(jìn)行優(yōu)選實(shí)施方案。
[0008] 在第一方面，也是所述第一方面的第一實(shí)施方案中，通過一種用于添加一個(gè)或多 個(gè)心核巧酸到第一k核酸的3'端的方法也解決了本申請(qǐng)潛在的問題，其中所述方法包括 在包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)存在下使所述一個(gè)或多個(gè)k核巧酸與所述第一k核酸反 應(yīng)的步驟，其中所述酶活性能夠添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到所述第一k核酸的3'端。
[0009] 在所述第一方面的第二實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述酶活性展現(xiàn)部分由氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基 酸。
[0010] 在所述第一方面的第H實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一和第二實(shí)施方案的一 個(gè)實(shí)施方案中，所述酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶活性展現(xiàn)部分。
[0011] 在所述第一方面的第四實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二和第H實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶活性是聚合酶活性。
[0012] 在所述第一方面的第五實(shí)施方案，也是所述第一方面的第四實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述聚合酶活性是熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
[0013] 在所述第一方面的第六實(shí)施方案，也是所述第一方面的第H、第四和第五實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含至少300個(gè)氨基酸。
[0014] 在所述第一方面的第走實(shí)施方案，也是所述第一方面的第六實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含介于300和900個(gè)之間的氨基酸，優(yōu)選 介于300和600個(gè)之間的氨基酸，更優(yōu)選介于300和360個(gè)之間的氨基酸，最優(yōu)選340至 360個(gè)氨基酸。
[0015] 在所述第一方面的第八實(shí)施方案，也是所述第一方面的第四、第五、第六和第走實(shí) 施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。
[0016] 在所述第一方面的第九實(shí)施方案，也是所述第一方面的第八實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述DNA聚合酶活性是DNA依賴性DNA聚合酶活性。
[0017] 在所述第一方面的第十實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、第 五、第六、第走、第八和第九實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶活性展現(xiàn)部分是酶。
[0018] 在所述第一方面的第十一實(shí)施方案，也是所述第一方面的第H、第四、第五、第六、 第走、第八和第九實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶。
[0019] 在所述第一方面的第十二實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第八、第九、第十和第十一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分選自非洲 豬癌病毒聚合酶X、嗜熱細(xì)菌聚合酶X核也域、大鼠聚合酶目、真核生物聚合酶目、克列諾片 段Odenow化agment)、克列諾外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、測(cè)序酶、T7DNA 聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A及其中每一個(gè)和任一個(gè)的變體，
[0020] 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為非洲豬癌病毒聚合酶X或其變體，其由選自 W下的氨基酸序列的所選氨基酸序列組成；根據(jù)SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根據(jù)SEQID N0:2的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDN0:3的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDN0:4的氨基酸序列。
[0021] 在所述第一方面的第十H實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十和第十一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性 展現(xiàn)部分選自聚合酶DP04、嗜熱高溫球菌DNA聚合酶、火球菌屬某種DNA聚合酶、激烈火球 菌DNA聚合酶、P化化rbo聚合酶、硫賴礦硫化葉菌DNA聚合酶、嗜熱古細(xì)菌（Thermococ州S gorgonarius)DNA聚合酶、KOD聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合 酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合酶、P油聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、 EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、"Tbr 聚合酶、Tf1聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、訂i聚合 酶、Ampli^Taq、Stoffel片段、9。NmDNA聚合酶、Therminator、TherminatorII、Pension Hi曲Fidelity聚合酶、PaqSOOO、Pfx-50、Proofstart、Fideli^Taq、Elongase及其變體，
[0022] 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為化o4聚合酶或其變體，其由選自W下的氨 基酸序列的所選氨基酸序列組成；根據(jù)SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 16的 氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根據(jù)SEQ IDNO: 19的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 20的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 21的氨基酸序 列和根據(jù)SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0023]在所述第一方面的第十四實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十H實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中， 所述反應(yīng)步驟是在允許添加所述至少一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到所述第一k核酸，優(yōu)選允許 添加5至20, 000個(gè)k核巧酸、優(yōu)選10至2, 000個(gè)k核巧酸、更優(yōu)選50至500個(gè)k核巧 酸、最優(yōu)選50至100個(gè)k核巧酸的條件下進(jìn)行。
[0024]在所述第一方面的第十五實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H和第十四實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述添加至少一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到所述第一k核酸是所述至少一個(gè)或多個(gè) k核巧酸共價(jià)結(jié)合到所述第一k核酸，優(yōu)選通過在所述第一k核酸的3'OH與所述至少一 個(gè)或多個(gè)心核巧酸之一的5'磯酸之間形成3'-5'磯酸二醋鍵。
[0025]在所述第一方面的第十六實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四和第十五實(shí)施方案的一 個(gè)實(shí)施方案中，所述第一k核酸是由DNA、RNA、經(jīng)修飾的DNA、經(jīng)修飾的RNA或其組合組成 的引物。
[0026]在所述第一方面的第十走實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五和第十六實(shí)施 方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一k核酸由k核巧酸和任選的修飾組成。
[0027]在所述第一方面的第十八實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第^^一、第十二、第十H、第十四、第十五和第十六W及 第十走實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一k核酸由k核巧酸組成。
[0028]在所述第一方面的第十九實(shí)施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五和第十六、第 十走和第十八實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)還包括第二心核酸，其中優(yōu)選通過沃 森-克里克堿基配對(duì)使一分子的所述第一k核酸與一分子的所述第二k核酸雜交。
[0029] 在所述第一方面的第二十實(shí)施方案，也是所述第一方面的第十九實(shí)施方案的一個(gè) 實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分合成與所述第二k核酸互補(bǔ)的第Hk核酸，其中所 述第Hk核酸包含所述第一k核酸和添加到所述第一k核酸的3'端的k核巧酸。
[0030] 在第二方面，也是所述第二方面的第一實(shí)施方案中，通過一種用于在心核巧酸和 包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)存在下擴(kuò)增祀心核酸的方法也解決了本申請(qǐng)潛在的問題， 其中所述酶活性能夠擴(kuò)增所述祀k核酸。
[0031] 在所述第二方面的第二實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述酶活性展現(xiàn)部分由氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基 酸。
[0032] 在所述第二方面的第H實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一和第二實(shí)施方案的一 個(gè)實(shí)施方案中，所述酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶活性展現(xiàn)部分。
[0033] 在所述第二方面的第四實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二和第H實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶活性是聚合酶活性。
[0034] 在所述第二方面的第五實(shí)施方案，也是所述第二方面的第四實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述聚合酶活性是熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
[0035] 在所述第二方面的第六實(shí)施方案，也是所述第二方面的第H、第四和第五實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含至少300個(gè)氨基酸。
[0036] 在所述第二方面的第走實(shí)施方案，也是所述第二方面的第六實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含介于300和900個(gè)之間的氨基酸，優(yōu)選 介于300和600個(gè)之間的氨基酸，更優(yōu)選介于300和360個(gè)之間的氨基酸，最優(yōu)選介于340 和360個(gè)之間的氨基酸。
[0037] 在所述第二方面的第八實(shí)施方案，也是所述第二方面的第四、第五和第六實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。
[0038] 在所述第二方面的第九實(shí)施方案，也是所述第二方面的第八實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述DNA聚合酶活性是DNA依賴性DNA聚合酶活性。
[0039] 在所述第二方面的第十實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、第 五、第六、第走、第八和第九實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶活性展現(xiàn)部分是酶。
[0040] 在所述第二方面的第十一實(shí)施方案，也是所述第二方面的第H、第四、第五、第六、 第走、第八和第九實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶。
[0041] 在所述第二方面的第十二實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第八、第九、第十和第十一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分選自非洲 豬癌病毒聚合酶X、嗜熱細(xì)菌聚合酶X核也域、大鼠聚合酶目、真核生物聚合酶目、克列諾片 段、克列諾外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、測(cè)序酶、T7DNA聚合酶、SP6聚 合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A及其中每一個(gè)和任一個(gè)的變體，
[0042] 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為非洲豬癌病毒聚合酶X或其變體，其由選自 W下的氨基酸序列的所選氨基酸序列組成；根據(jù)SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根據(jù)SEQID NO:2的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:3的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDNO:4的氨基酸序列。
[0043] 在所述第二方面的第十H實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十和第十一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性 展現(xiàn)部分選自聚合酶DP04、嗜熱高溫球菌DNA聚合酶、火球菌屬某種DNA聚合酶、激烈火球 菌DNA聚合酶、P化化rbo聚合酶、硫賴礦硫化葉菌DNA聚合酶、嗜熱古細(xì)菌DNA聚合酶、KOD 聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、 Poc聚合酶、P油聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合 酶、Expand聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚 合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片 段、9。NmDNA聚合酶、TherminatoiNTherminatorII、PensionHi曲Fidelity聚合酶、 F*aq5000、Pfx-50、Proofstart、Fidemaq、Elongase及其變體，
[0044] 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為化〇4聚合酶或其變體，其由選自W下的氨 基酸序列的所選氨基酸序列組成；根據(jù)SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 16的 氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根據(jù)SEQ IDNO: 19的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 20的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 21的氨基酸序 列和根據(jù)SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0045] 在所述第二方面的第十四實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十H實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中， 所述反應(yīng)步驟是在允許擴(kuò)增所述祀k核酸的條件下進(jìn)行。
[0046] 在所述第二方面的第十五實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H和第十四實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述方法使用至少一個(gè)引物，優(yōu)選使用兩個(gè)引物，其中所述至少一個(gè)引物由心核 巧酸和任選的修飾組成。
[0047] 在所述第二方面的第十六實(shí)施方案，也是所述第二方面的第十五實(shí)施方案的一個(gè) 實(shí)施方案中，所述引物由k核巧酸組成。
[0048] 在所述第二方面的第十走實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第^;：、第八、第九、第十、第^-、第十二、第十H、第十四、第十五和第十六實(shí)施 方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述祀k核酸由k核巧酸組成。
[0049] 在所述第二方面的第十八實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五、第十六和第 十走實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0050] 在所述第二方面的第十九實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五、第十六、第 十走和第十八實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述祀k核酸由kDNA組成。
[0051] 在所述第二方面的第十實(shí)施方案，也是所述第二方面的第一、第二、第H、第四、第 五、第六、第走、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十H、第十四、第十五、第十六、第十走、 第十八和第十九實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述祀k核酸由20至20, 000個(gè)k核巧酸， 優(yōu)選30至2, 000個(gè)k核巧酸，更優(yōu)選40至500個(gè)k核巧酸，最優(yōu)選50至100個(gè)k核巧 酸組成。
[0052] 在第H方面，也是所述第H方面的第一實(shí)施方案中，通過一種包含酶活性展現(xiàn)部 分的蛋白質(zhì)也解決了本申請(qǐng)潛在的問題，其中所述酶活性展現(xiàn)部分由氨基酸序列組成，其 中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸，其中所述酶活性能夠添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸 到所述第一k核酸的3'端。
[0053]在所述第H方面的第二實(shí)施方案，也是所述第H方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶活性展現(xiàn)部分。
[0054]在所述第H方面的第H實(shí)施方案，也是所述第H方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述酶活性是聚合酶活性。
[0055]在所述第H方面的第四實(shí)施方案，也是所述第H方面的第H實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述聚合酶活性是熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
[0056]在所述第H方面的第五實(shí)施方案，也是所述第H方面的第二、第H和第四實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含至少300個(gè)氨基酸。
[0057]在所述第H方面的第六實(shí)施方案，也是所述第H方面的第五實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含介于300和900個(gè)之間的氨基酸，優(yōu)選 介于300和600個(gè)之間的氨基酸，更優(yōu)選介于300和360個(gè)之間的氨基酸，最優(yōu)選介于340 和360個(gè)之間的氨基酸。
[0058]在所述第H方面的第走實(shí)施方案，也是所述第H方面的第H、第四、第五和第六實(shí) 施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。
[0059]在所述第H方面的第八實(shí)施方案，也是所述第H方面的第走實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述DNA聚合酶活性是DNA依賴性DNA聚合酶活性。
[0060]在所述第H方面的第九實(shí)施方案，也是所述第H方面的第一、第二、第H、第四、第 五、 第六、第走和第八實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶活性展現(xiàn)部分是酶。
[0061]在所述第H方面的第十實(shí)施方案，也是所述第H方面的第二、第H、第四、第五、第 六、 第走和第八實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶。
[0062]在所述第H方面的第十一實(shí)施方案，也是所述第H方面的第一、第二、第H、第走、 第八、第九和第十實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分選自非洲豬癌病 毒聚合酶X、嗜熱細(xì)菌聚合酶X核也域、大鼠聚合酶目、真核生物聚合酶目、克列諾片段、克 列諾外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、測(cè)序酶、T7DNA聚合酶、SP6聚合酶、 DNA聚合酶I、聚合酶A及其中每一個(gè)和任一個(gè)的變體，
[0063]其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為非洲豬癌病毒聚合酶X或其變體，其由選自W下的氨基酸序列的所選氨基酸序列組成；根據(jù)SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根據(jù)SEQID NO:2的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:3的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDNO:4的氨基酸序列。
[0064]在所述第H方面的第十二實(shí)施方案，也是所述第H方面的第一、第二、第H、第四、 第五、第六、第走、第八、第九和第十實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分 選自聚合酶DP04、嗜熱高溫球菌DNA聚合酶、火球菌屬某種DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚 合酶、P化化rbo聚合酶、硫賴礦硫化葉菌DNA聚合酶、嗜熱古細(xì)菌DNA聚合酶、KOD聚合酶、 Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合 酶、P油聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand 聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tf1聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚 合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、訂i聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片段、9。NmDNA 聚合酶、TherminatoiNTherminatorII、PhusionHi曲Fidelity聚合酶、Paq5000、Pfx_50、 Proofstart、Fidemaq、Elongase及其變體，
[0065] 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為化o4聚合酶或其變體，其由選自W下的氨 基酸序列的所選氨基酸序列組成；根據(jù)SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 16的 氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根據(jù)SEQ IDNO: 19的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 20的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 21的氨基酸序 列和根據(jù)SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0066] 在第四方面，也是所述第四方面的第一實(shí)施方案中，通過一種包含根據(jù)SEQID NO: 15的氨基酸序列的聚合酶也解決了本申請(qǐng)潛在的問題，其中所述氨基酸序列的氨基酸 是D-氨基酸。
[0067] 在第五方面，也是所述第五方面的第一實(shí)施方案中，通過一種包含根據(jù)SEQID NO: 1的氨基酸序列的聚合酶也解決了本申請(qǐng)潛在的問題，其中所述氨基酸序列的氨基酸是 D-氨基酸。
[0068] 在第六方面，也是所述第六方面的第一實(shí)施方案中，通過一種野生型聚合酶的聚 合酶變體也解決了本申請(qǐng)潛在的問題，其中所述野生型聚合酶由根據(jù)SEQIDN0:15的氨基 酸序列組成，且其中所述聚合酶變體具有聚合酶活性，優(yōu)選具有熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
[0069] 在所述第六方面的第二實(shí)施方案，也是所述第六方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述聚合酶變體包含氨基酸序列，其中所述聚合酶變體的氨基酸序列與所述野生 型聚合酶的氨基酸序列在至少一個(gè)氨基酸位置上不同。
[0070] 在所述第六方面的第H實(shí)施方案，也是所述第六方面的第一和第二實(shí)施方案的一 個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體的氨基酸序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在一個(gè)或 兩個(gè)氨基酸位置上不同。
[0071] 在所述第六方面的第四實(shí)施方案，也是所述第六方面的第一、第二和第H實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體的氨基酸序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在 根據(jù)SEQIDNO: 15的氨基酸序列的氨基酸位置155和/或203上或在與其對(duì)應(yīng)的氨基酸 位置上不同，其中優(yōu)選W半脫氨酸取代位置155和/或203上的氨基酸。
[0072] 在所述第六方面的第五實(shí)施方案，也是所述第六方面的第一、第二、第H和第四 實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體由選自W下的氨基酸序列組成：根據(jù)SEQID NO: 16的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 17的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDNO: 18的氨基酸序 列。
[0073] 在所述第六方面的第六實(shí)施方案，也是所述第六方面的第一、第二和第H實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體由選自W下的氨基酸序列組成：根據(jù)SEQIDN0:19 的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 20的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 21的氨基酸序列和根據(jù) SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0074] 在所述第六方面的第走實(shí)施方案，也是所述第六方面的第一、第二、第H、第四、第 五和第六實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體的氨基酸序列的氨基酸是D-氨基 酸。
[0075] 在所述第六方面的第八實(shí)施方案，也是所述第六方面的第一、第二、第H、第四、第 五和第六實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體的氨基酸序列的氨基酸是心氨基 酸。
[0076] 在第走方面，也是所述第走方面的第一實(shí)施方案中，通過一種野生型聚合酶的聚 合酶變體也解決了本申請(qǐng)潛在的問題，其中所述野生型聚合酶由根據(jù)SEQIDN0:1的氨基 酸序列組成，且其中所述聚合酶變體具有聚合酶活性。
[0077] 在所述第走方面的第二實(shí)施方案，也是所述第走方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述聚合酶變體包含氨基酸序列，其中所述聚合酶變體的氨基酸序列與所述野生 型聚合酶的氨基酸序列在至少一個(gè)氨基酸位置上不同。
[0078] 在所述第走方面的第H實(shí)施方案，也是所述第走方面的第一和第二實(shí)施方案的一 個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體的氨基酸序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在一個(gè)氨 基酸位置上不同。
[0079] 在所述第走方面的第四實(shí)施方案，也是所述第走方面的第一、第二和第H實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體的氨基酸序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在 至少一個(gè)氨基酸位置上不同，其中所述至少一個(gè)氨基酸位置選自氨基酸位置80、氨基酸位 置86和氨基酸位置124,各氨基酸序列根據(jù)SEQIDNO: 1或在與其對(duì)應(yīng)的氨基酸位置上。
[0080] 在所述第走方面的第五實(shí)施方案，也是所述第走方面的第一、第二、第H和第四 實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體由選自W下的氨基酸序列組成：根據(jù)SEQID N0:2的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDN0:3的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDN0:4的氨基酸序列。
[0081] 在所述第走方面的第六實(shí)施方案，也是所述第走方面的第一、第二、第H、第四和 第五實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體的氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
[0082] 在所述第走方面的第走實(shí)施方案，也是所述第走方面的第一、第二、第H、第四、第 五和第六實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合酶變體的氨基酸序列的氨基酸是心氨基 酸。
[0083] 在第八方面，也是所述第八方面的第一實(shí)施方案中，通過在用于添加一個(gè)或多個(gè) k核巧酸到心核酸的3'端的方法中使用包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)也解決了本申請(qǐng)潛 在的問題。
[0084] 在第九方面，也是所述第九方面的第一實(shí)施方案中，通過在用于在k核巧酸存在 下擴(kuò)增祀心核酸的方法中使用包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)也解決了本申請(qǐng)潛在的問 題。
[0085] 在所述第九方面的第二實(shí)施方案，也是所述第九方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述用于擴(kuò)增祀k核酸的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
[0086] 在所述第八方面的第二實(shí)施方案，也是所述第八方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中和在所述第九方面的第H實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是根據(jù)所述第H、第四、第五、第 六和第走方面的任何實(shí)施方案的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)由氨基酸序列組成，其中所述氨 基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
[0087] 在第十方面，也是所述第十方面的第一實(shí)施方案中，通過一種用于鑒別結(jié)合祀分 子的k核酸分子的方法也解決了本申請(qǐng)潛在的問題，所述方法包括W下步驟：
[0088] (a)產(chǎn)生k核酸分子的異源群體；
[0089] 化）使步驟（a)的k核酸分子的異源群體與所述祀分子接觸；
[0090] (C)分離未被所述祀分子結(jié)合的k核酸分子；和
[0091] (d)擴(kuò)增被所述祀分子結(jié)合的k核酸分子，其中所述擴(kuò)增步驟使用根據(jù)所述第 H、第四、第五、第六和第走方面的任何實(shí)施方案的蛋白質(zhì)，
[0092] 其中所述蛋白質(zhì)由氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
[0093] 在所述第十方面的第二實(shí)施方案，也是所述第十方面的第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施 方案中，所述方法還包括W下步驟：
[0094] (e)對(duì)被所述祀分子結(jié)合的k核酸分子進(jìn)行測(cè)序；和
[0095] (f)合成核巧酸序列與步驟（e)中所測(cè)序的k核酸分子的核巧酸序列一致的核酸 分子。
[0096] 在所述第十方面的第H實(shí)施方案，也是所述第十方面的第一和第二實(shí)施方案的一 個(gè)實(shí)施方案中，步驟（a)的心核酸分子的異源群體的核酸分子在其5'端及其3'端上包 含引物結(jié)合位點(diǎn)和分別與引物結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，該允許通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴(kuò)增步 驟（d)中所獲得的心核酸分子，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所使用的聚合酶是根據(jù)所述第 H、第四、第五、第六和第走方面的任何實(shí)施方案的蛋白質(zhì)，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所使用 的引物由k核巧酸組成，且所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所使用的核巧酸是k核巧酸。
[0097] 在所述第十方面的第四實(shí)施方案，也是所述第十方面的第一、第二和第H實(shí)施方 案的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟（d)之后引入W下步驟：
[0098] (da)使擴(kuò)增的核酸分子與所述祀分子接觸，其中
[009引步驟化）和任選的步驟（C)和/或（d)是在步驟（e)之前進(jìn)行，其中步驟（da)、化）、（C)和任選的（d)是按照該個(gè)順序進(jìn)行一次或若干次。
[0100] 在所述第十方面的第五實(shí)施方案，也是所述第十方面的第一、第二、第H和第四實(shí) 施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合祀分子的k核酸是DNA。
[0101] 在所述第十方面的第六實(shí)施方案，也是所述第十方面的第一、第二、第H、第四和 第五實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合祀分子的k核酸分子由k核巧酸組成。
[0102] 在第十一方面，也是所述第十一方面的第一實(shí)施方案中，通過一種用于產(chǎn)生根據(jù) 所述第H、第四、第五、第六和第走方面的任何實(shí)施方案的蛋白質(zhì)的方法也解決了本申請(qǐng)潛 在的問題，其中
[0103] a)化學(xué)合成根據(jù)所述第H、第四、第五、第六和第走方面的任何實(shí)施方案的蛋白質(zhì) 的兩個(gè)或更多個(gè)片段，其中所述片段W其整體形式形成所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列，優(yōu)選通 過固相膚合成來合成所述片段，且
[0104] b)通過鏈段縮合、天然化學(xué)連接、酶連接或其組合將步驟a)的片段彼此連接，
[0105] 其中所述蛋白質(zhì)由氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
[0106] 在所述第^^一方面的第二實(shí)施方案，也是所述第^^一方面的第一實(shí)施方案的一個(gè) 實(shí)施方案中，酶連接中所使用的所述酶是梭菌蛋白酶。
[0107] 在第十二方面，也是所述第十二方面的第一實(shí)施方案中，通過一種用于通過酶連 接將第一D-膚或第一D-蛋白質(zhì)與第二D-膚或第二D-蛋白質(zhì)彼此連接的方法也解決了本 申請(qǐng)潛在的問題，其中
[0108] 所述第一D-膚或所述第一D-蛋白質(zhì)在其N末端由保護(hù)基保護(hù)，且在其C末端由 4-脈基苯基醋基團(tuán)保護(hù)，且
[0109] 所述第二D-膚或所述第二D-蛋白質(zhì)包含游離N末端和處于其C末端的硫代焼基 醋基團(tuán)基團(tuán)或硫代芳基醋基團(tuán)。
[0110] 在所述第十二方面的第二實(shí)施方案，也是所述第十二方面的第一實(shí)施方案的一個(gè) 實(shí)施方案中，所述酶連接中所使用的酶是梭菌蛋白酶。
[0111] 本發(fā)明的發(fā)明人梅訝地發(fā)現(xiàn)，有可能化學(xué)合成由D-氨基酸組成的具有功能活性 的蛋白質(zhì)，由此所述蛋白質(zhì)具有如聚合酶通常呈現(xiàn)的大小。更具體地說，本發(fā)明的發(fā)明人已 經(jīng)發(fā)覺了一種允許合成所述D-蛋白質(zhì)和D-聚合酶（即，由D-氨基酸組成的聚合酶，其具 有作為聚合酶的活性）的方法。基于該個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)核酸和心核酸分子的酶促 合成所需的蛋白質(zhì)和酶活性現(xiàn)在是可用的。k核酸和k核酸分子的所述酶促合成包括但 不限于用于添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到第一k核酸的3'端的方法和用于在k核巧酸存 在下擴(kuò)增祀k核酸作為心核酸（即，擴(kuò)增產(chǎn)物是k核酸）的方法。
[0112] 由于該些方法和酶活性是用來鑒別鏡像異構(gòu)體的替代方法的一部分，故現(xiàn)在可W 將所述鑒別鏡像異構(gòu)體的替代方法付諸實(shí)踐。
[0113]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)出一種用于添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到第一k核酸的 3'端的方法，其中所述方法包括在包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)存在下使所述一個(gè)或多個(gè) k核巧酸與所述第一k核酸反應(yīng)的步驟，其中所述酶活性能夠添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸 到所述第一k核酸的3'端。
[0114]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酶活性能夠添加5至20, 000個(gè)k核巧酸到所述第一k核酸的3'端，優(yōu)選10至2, 000個(gè)k核巧酸，更優(yōu)選50至500個(gè)k核巧酸，最優(yōu)選50 至100個(gè)心核巧酸。
[0115] 如本文中優(yōu)選使用的術(shù)語添加是分子之間的共價(jià)鍵合，根據(jù)本發(fā)明為心核酸的 共價(jià)鍵合和所述至少一個(gè)或多個(gè)k核巧酸與所述k核酸的共價(jià)鍵合，優(yōu)選通過在所述第 一k核酸的3'OH與所述至少一個(gè)或多個(gè)k核巧酸之一的5'磯酸之間形成3' -5'磯酸二 醋鍵。根據(jù)本發(fā)明，添加到k核酸的k核巧酸形成了被所述k核巧酸延長的k核酸的 3'端。
[0116] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述用于添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到第一k核酸的3' 端的方法包括第二k核酸，其中優(yōu)選通過沃森-克里克堿基配對(duì)使一分子的第一k核酸 與一分子的第二k核酸雜交。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法允許合成與所述第二 k核酸互補(bǔ)的第Hk核酸，其中所述第Hk核酸包含所述第一k核酸和添加到所述第一 k核酸的3'端的k核巧酸，即，針對(duì)第一k核酸，添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到第一心核 酸的3'端，從而產(chǎn)生所述第核酸。
[0117]根據(jù)本發(fā)明的包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)包括僅具有酶活性展現(xiàn)部分的蛋白 質(zhì)和具有酶活性展現(xiàn)部分跟其它殘基或部分的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)的其它殘基或部分 不具有酶活性。根據(jù)本發(fā)明，所述酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含介于300和900個(gè)之間 的氨基酸，優(yōu)選介于300和600個(gè)之間的氨基酸，更優(yōu)選介于300和360個(gè)之間的氨基酸， 最優(yōu)選340至360個(gè)氨基酸。
[0118]根據(jù)本發(fā)明的包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)優(yōu)選為聚合酶活性展現(xiàn)部分。根據(jù)本 發(fā)明的包含聚合酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)包括僅具有聚合酶活性展現(xiàn)部分的聚合酶和具 有聚合酶活性展現(xiàn)部分跟其它殘基或部分的聚合酶，其中所述聚合酶的其它殘基或部分不 具有聚合酶活性。根據(jù)本發(fā)明，所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含介于300和900 個(gè)之間的氨基酸，優(yōu)選介于300和600個(gè)之間的氨基酸，更優(yōu)選介于300和360個(gè)之間的氨 基酸，最優(yōu)選340至360個(gè)氨基酸。
[0119] 根據(jù)本發(fā)明的聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為熱穩(wěn)定的聚合酶活性展現(xiàn)部分，更優(yōu)選 為熱穩(wěn)定的DNA聚合酶活性展現(xiàn)部分，且最優(yōu)選為熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶活性展 現(xiàn)部分。
[0120] 根據(jù)本發(fā)明的聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為DNA聚合酶活性展現(xiàn)部分，更優(yōu)選為 DNA依賴性DNA聚合酶活性展現(xiàn)部分或熱穩(wěn)定的DNA聚合酶活性展現(xiàn)部分，最優(yōu)選為熱穩(wěn)定 的DNA依賴性DNA聚合酶活性展現(xiàn)部分。
[0121] 如本文中所使用的術(shù)語酶活性是催化特定反應(yīng)，優(yōu)選為添加一個(gè)或多個(gè)核巧酸到 核酸的3'端、擴(kuò)增核酸和/或聚合酶活性，更優(yōu)選為添加一個(gè)或多個(gè)k核巧酸到k核酸 的3'端和擴(kuò)增k核酸。
[0122] 根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語聚合酶活性是酶使k核巧酸聚合和/或k核巧酸與k核酸 聚合的能力，其中k核巧酸優(yōu)選為k核巧H磯酸。
[0123] 根據(jù)本發(fā)明的聚合酶活性優(yōu)選為熱穩(wěn)定的聚合酶活性，更優(yōu)選為熱穩(wěn)定的DNA聚 合酶活性，且最優(yōu)選為熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶活性。
[0124] 根據(jù)本發(fā)明的聚合酶活性優(yōu)選為DNA聚合酶活性，更優(yōu)選為DNA依賴性DNA聚合 酶活性或熱穩(wěn)定的DNA聚合酶活性，最優(yōu)選為熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶活性。
[01巧]已知的聚合酶來自于天然來源或者是來自于天然來源的聚合酶的經(jīng)過優(yōu)化或突 變的變體。聚合酶由手性構(gòu)筑塊，即k氨基酸組成。因此，聚合酶的結(jié)構(gòu)也固有地是手性 的，從而引起立體特異性底物識(shí)別。因此，該些酶僅接受呈勝任的，即對(duì)應(yīng)的手性構(gòu)型的底 物分子。因此，已知的聚合酶使D-核巧酸或H磯酸D-核巧酸聚合，其中它們用作由D-核 巧酸組成的模板鏈D-核酸W合成由D-核巧酸組成的互補(bǔ)D-核酸鏈。除模板鏈W外，聚 合酶任選地使用與所述模板鏈雜交且由D-核巧酸組成的引物。因?yàn)樘烊淮嬖诘暮怂崾怯?D-核巧酸構(gòu)成，且可W由確切地說由k氨基酸組成的蛋白質(zhì)和酶加W處理（例如擴(kuò)增）， 故由k氨基酸組成的所述蛋白質(zhì)和酶對(duì)應(yīng)地不識(shí)別k核酸。因此，結(jié)合祀分子或祀結(jié)構(gòu) (也稱為鏡像異構(gòu)體）的k核酸不能通過體外選擇方法使用所述祀分子或祀結(jié)構(gòu)的天然存 在的形式直接獲得。
[0126] 本發(fā)明的發(fā)明人梅訝地發(fā)現(xiàn)，有可能產(chǎn)生一種可W添加k核酸核巧酸到能與 k核酸模板鏈雜交的由k核巧酸組成的引物的聚合酶。此外，本發(fā)明的發(fā)明人梅訝地發(fā) 現(xiàn)，有可能產(chǎn)生一種可用于擴(kuò)增心核酸，優(yōu)選用于被稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（縮寫PCR)的方 法中的聚合酶。
[0127] 聚合酶是一種能使核巧H磯酸聚合的酶。聚合酶使用模板核酸鏈來合成與所述模 板核酸鏈互補(bǔ)的核酸鏈。除模板核酸鏈W外，聚合酶任選地使用基于堿基互補(bǔ)性與模板核 酸鏈雜交的引物。模板核酸鏈、引物和由聚合酶合成的核酸鏈可W獨(dú)立地為DNA或RNA。如 本文中優(yōu)選使用的聚合酶包括DNA聚合酶和RNA聚合酶，優(yōu)選為DNA依賴性DNA聚合酶、RNA 依賴性DNA聚合酶（諸如逆轉(zhuǎn)錄酶）、RNA依賴性RNA聚合酶和RNA依賴性DNA聚合酶。更 優(yōu)選地，聚合酶是熱穩(wěn)定的聚合酶。聚合酶不需要含有對(duì)應(yīng)的天然或野生型酶中所發(fā)現(xiàn)的 所有氨基酸，而是僅需要含有足W允許所述聚合酶實(shí)現(xiàn)所要的催化活性的氨基酸。在一個(gè) 實(shí)施方案中，聚合酶活性是催化活性，所述催化活性選自包括例如5'-3'聚合活性、5'-3' 核酸外切酶活性和3'-5'核酸外切酶活性的催化活性。
[0128] 根據(jù)本發(fā)明的聚合酶由D-氨基酸組成且能使k核巧酸或k核巧H磯酸聚合，其 中根據(jù)本發(fā)明的聚合酶用作由k核巧酸組成的模板鏈k核酸W合成由k核巧酸組成的 互補(bǔ)k核酸鏈。除模板鏈W外，根據(jù)本發(fā)明的聚合酶任選地使用能與所述模板鏈雜交且由 レ核巧酸組成的引物。模板鏈、引物和所合成的核酸鏈可W獨(dú)立地為レDNA或レRNA。根 據(jù)本發(fā)明的聚合酶包括由D-氨基酸組成的DNA聚合酶和由D-氨基酸組成的RM聚合酶， 優(yōu)選包括由D-氨基酸組成的DNA依賴性DNA聚合酶、由D-氨基酸組成的RNA依賴性DNA 聚合酶（諸如由D-氨基酸組成的逆轉(zhuǎn)錄酶）、由D-氨基酸組成的RNA依賴性RNA聚合酶 和由D-氨基酸組成的RNA依賴性DNA聚合酶。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的聚合酶是由D-氨 基酸組成的熱穩(wěn)定的聚合酶。根據(jù)本發(fā)明的聚合酶不需要含有天然酶中所發(fā)現(xiàn)的所有氨基 酸，而是僅需要含有足W允許根據(jù)本發(fā)明的聚合酶實(shí)現(xiàn)所要的催化活性的氨基酸。催化活 性包括例如5'-3'聚合活性、5'-3'核酸外切酶活性和3'-5'核酸外切酶活性。
[0129] 僅由k氨基酸組成的聚合酶在本文中優(yōu)選地稱為"全L聚合酶"。
[0130] 僅由D-氨基酸組成的聚合酶在本文中優(yōu)選地稱為"全D聚合酶"。
[0131] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合酶選自非洲豬癌病毒聚合酶X、嗜熱細(xì) 菌聚合酶X核也域、大鼠聚合酶目、真核生物聚合酶目、克列諾片段、克列諾外切聚合酶、 T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、測(cè)序酶、T7DNA聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合 酶入、聚合酶DP04、嗜熱高溫球菌DNA聚合酶、火球菌屬某種DNA聚合酶、激烈火球菌DM 聚合酶、P化化rbo?聚合酶、硫賴礦硫化葉菌DNA聚合酶、嗜熱古細(xì)菌DNA聚合酶、KOD聚合 酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚 合酶、P油聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-hq?聚合酶、LA-TaqTM聚合酶、 Expand?聚合酶、Platinum?Taq聚合酶、Hi-Fi?聚合酶、Tbr聚合酶、Tf1聚合酶、Tru聚 合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Ampli化q?、Stoffel片 段、9。Nm?DNA聚合酶、TherminatorTMjherminatorII?JhusionHi曲Fidelity? 聚合 酶、PaqSOOO?、Pfx-50?、Proofstart?、Fidemaq?、Eiongase? 及其中每一個(gè)和任一個(gè)的 變體。
[0132] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合酶是由根據(jù)SEQIDNO: 1的氨基 酸序列組成的非洲豬癌病毒聚合酶X。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合酶 是非洲豬癌病毒聚合酶X的變體，最優(yōu)選為具有選自W下的氨基酸序列的所選氨基酸序列 的非洲豬癌病毒聚合酶X的變體：根據(jù)SEQIDNO: 2的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 3的氨 基酸序列和根據(jù)SEQIDNO:4的氨基酸序列。
[0133] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合酶是由根據(jù)SEQIDN0:15的氨 基酸序列組成的聚合酶化〇4。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的聚合酶是聚合 酶化〇4的變體，最優(yōu)選為由選自W下的氨基酸序列的所選氨基酸序列組成的聚合酶化〇4 的變體：根據(jù)SEQIDNO: 16的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根據(jù)SEQID NO: 18的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 19的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 20的氨基酸序列、 根據(jù)SEQIDNO:21的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDNO:22的氨基酸序列。
[0134] 聚合酶的變體是在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上與所述聚合酶的氨基酸序列不同的 聚合酶。氨基酸序列中的氨基酸位置優(yōu)選由其相對(duì)于聚合酶的N末端和C末端的位置和/ 或其相對(duì)于圍繞所述氨基酸的氨基酸的位置確定，使得
[0135] a)如果聚合酶在N末端被截短，則氨基酸的位置由其相對(duì)于聚合酶的C末端和相 對(duì)于圍繞所述氨基酸的氨基酸的位置確定，
[0136]b)如果聚合酶在C末端被截短，則氨基酸的位置由其相對(duì)于聚合酶的N末端和相 對(duì)于圍繞所述氨基酸的氨基酸的位置確定，且
[0137]b)如果聚合酶在N末端和C末端被截短，則氨基酸的位置由其相對(duì)于圍繞所述氨 基酸的氨基酸的位置確定。
[013引根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定的聚合酶相對(duì)不受高溫影響。在一個(gè)具體的非限制性實(shí)施例 中，具有熱穩(wěn)定性的聚合酶不受至少5(TC的溫度，例如5(TC、6(TC、75 °C、8(TC、82 °C、85C、 88 °C、9(TC、92 °C、95 °C或甚至更高的溫度影響。
[0139] 在心核巧H磯酸的聚合過程內(nèi)，聚合酶添加一個(gè)核巧H磯酸到另一個(gè)核巧H磯 酸，優(yōu)選地產(chǎn)生寡核巧酸，也稱為核酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶僅添加一個(gè) 核巧H磯酸到一個(gè)核巧H磯酸或到核酸的末端核巧酸，例如，如果核巧酸是諸如雙脫氧核 巧酸的鏈終止核巧酸的話。所述鏈終止核巧酸用于對(duì)核酸進(jìn)行測(cè)序，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的。
[0140]k核巧H磯酸的聚合過程可用于擴(kuò)增k核酸，優(yōu)選為祀k核酸。
[0141] 擴(kuò)增是增加核酸（優(yōu)選為祀k核酸）的拷貝數(shù)的任何過程。
[0142] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述祀k核酸由20至20, 000個(gè)k核巧酸，優(yōu)選30至 2, 000個(gè)k核巧酸，更優(yōu)選40至500個(gè)k核巧酸，最優(yōu)選50至100個(gè)k核巧酸組成。
[0143]擴(kuò)增的一個(gè)例子是其中使核酸與一對(duì)引物在允許所述引物與核酸模板雜交的條 件下接觸。聚合酶通過在合適的條件下添加一個(gè)或多個(gè)核巧H磯酸到引物來延伸引物，弓I 物與核酸模板分離，然后進(jìn)行再退火、延伸和分離W擴(kuò)增核酸分子的拷貝數(shù)。可W使用標(biāo)準(zhǔn) 技術(shù)通過電泳、限制性內(nèi)切酶裂解模式、寡核巧酸雜交或連接、和/或核酸測(cè)序來表征體外 擴(kuò)增的產(chǎn)物。
[0144] 替代的體外擴(kuò)增技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括無轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增、鏈置換擴(kuò) 增和NASBA?無RNA轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。
[0145] 一些擴(kuò)增方法依賴于熱循環(huán)，其由用于使核酸（優(yōu)選為雙鏈核酸）解鏈和酶促復(fù) 制核酸的反應(yīng)的重復(fù)加熱和冷卻循環(huán)組成。該些熱循環(huán)步驟首先對(duì)于在高溫下在稱為核酸 解鏈的過程中物理分離雙鏈核酸中的兩條鏈?zhǔn)潜匦璧?。在較低溫度下，各鏈則在核酸合成 中被聚合酶用作模板W便選擇性地?cái)U(kuò)增祀核酸。含有與祀?yún)^(qū)互補(bǔ)的序列的引物連同聚合酶 (所述方法是據(jù)此命名）是使得能夠進(jìn)行選擇性和重復(fù)擴(kuò)增的關(guān)鍵組分。由于擴(kuò)增方法基 于熱循環(huán)進(jìn)展，故將所產(chǎn)生的核酸本身用作復(fù)制模板，從而開始鏈反應(yīng)，其中指數(shù)擴(kuò)增核酸 模板。
[0146] 利用熱擴(kuò)增的最突出的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（縮寫PCR)。
[0147] 引物是由DNA或RNA或其組合，優(yōu)選長度為10個(gè)核巧酸或更多的DNA寡核巧酸組 成的短核酸分子。更優(yōu)選地，較長的引物的長度可W是約15、20或25個(gè)核巧酸或更多。引 物可W通過核酸雜交與互補(bǔ)的祀核酸鏈退火，W便在引物與祀核酸鏈之間形成雜交物，然 后由聚合酶沿祀核酸鏈延伸引物。弓I物對(duì)可W用于擴(kuò)增核酸，例如通過PCR或本領(lǐng)域中已 知的其它核酸擴(kuò)增方法。
[0148] 使用由D-氨基酸組成的本發(fā)明的聚合酶使得引物和互補(bǔ)祀核酸鏈由k核巧酸組 成很有必要。優(yōu)選至少一個(gè)引物由k核巧酸和任選的修飾組成。
[0149] 用于制備和使用核酸引物和探針的方法描述于例如Sambrook等（Sambrock 等，1989)中。PCR引物對(duì)可W來源于已知序列，例如通過使用意在用于該目的的計(jì)算機(jī)程 序，諸如Primer。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，特定探針或引物的特異性隨其長度而增加。
[0150] 根據(jù)本發(fā)明的聚合酶由D-氨基酸組成。因此由D-氨基酸組成的根據(jù)本發(fā)明的聚 合酶無法從天然來源分離且無法使用細(xì)菌、酵母、真菌、病毒或動(dòng)物細(xì)胞通過重組表達(dá)產(chǎn)生 并且不得不通過化學(xué)方法產(chǎn)生，所述化學(xué)方法優(yōu)選諸如固相膚合成（縮寫SPP巧與連接法 的組合。
[0151]固相膚合成是用于合成膚或蛋白質(zhì)片段的現(xiàn)有技術(shù)；用可W在上面構(gòu)筑膚鏈的功 能單元（'連接子'）處理不溶但多孔的小固體珠粒。膚將保持共價(jià)連接于珠粒，直到通過 諸如無水氣化氨或H氣己酸的試劑從它上面裂解。所述膚因而'固定'在所述固相上且在 過濾過程期間可W被保留，而液相試劑和合成副產(chǎn)物則被沖洗掉。SPPS的一般原理是重復(fù) 偶合-洗涂-脫保護(hù)-洗涂循環(huán)的原理。固相連接膚的游離N末端胺偶合（見下文）于單 個(gè)經(jīng)N-保護(hù)的氨基酸單元。然后對(duì)該個(gè)單元進(jìn)行脫保護(hù)，露出可能與另一氨基酸連接的新 的N末端胺。該種技術(shù)的優(yōu)越性部分在于能夠在各反應(yīng)之后進(jìn)行洗涂循環(huán)，從而去除過量 試劑，而所有正在生長的目的膚保持共價(jià)連接于不溶性樹脂。有兩種主要使用的SPPS形 式，即Fmoc和Boc。氨基酸單體的N末端由該兩個(gè)基團(tuán)中的任一個(gè)加W保護(hù)且被添加到脫 保護(hù)的氨基酸鏈上。SPPS受產(chǎn)率限制，且通常在70個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的膚和蛋白質(zhì)推進(jìn)了合 成可及性的極限。合成難度也具有序列依賴性。較大的合成寡膚和蛋白質(zhì)可W通過使用諸 如片段縮合、天然化學(xué)連接或酶促連接的連接法將兩個(gè)膚偶合在一起來獲取。然而，迄今合 成的最大的D-蛋白質(zhì)是由102個(gè)D-氨基酸組成的血管生成蛋白血管內(nèi)皮生長因子（縮寫 VEGF-A)的D-蛋白質(zhì)形式（Mandal等，2012)，
[0152]片段縮合使用膚，其中所述膚的氨基酸的側(cè)鏈完全由化學(xué)基團(tuán)保護(hù)且所述膚在溶 液中偶合。
[0153] 天然化學(xué)連接是在水溶液中進(jìn)行。挑戰(zhàn)是必需的無保護(hù)膚-硫醋構(gòu)筑塊的制備。 在天然化學(xué)連接中，無保護(hù)膚2的N末端半脫氨酸殘基的姪硫基在水性緩沖液中在pH7. 0、 2(TC<T<37°C下攻擊第二無保護(hù)膚1的C末端硫醋。該個(gè)可逆的轉(zhuǎn)硫醋化步驟具有化學(xué)選 擇性和區(qū)域選擇性，且導(dǎo)致形成硫醋中間物3。該種中間物通過分子內(nèi)S，N-醜基位移進(jìn)行 重排，從而在連接位點(diǎn)上形成天然醜胺（'膚'）鍵4。
[0154] 如實(shí)施例中所示，發(fā)明人可能令人梅訝地示出了天然化學(xué)連接所必需的C末端硫 醋在酶促連接的條件下是穩(wěn)定的，使得天然化學(xué)連接和酶促連接可W組合使用。
[0155]D-膚的酶促連接通過使用蛋白酶實(shí)現(xiàn)，包括W下步驟；（a)制備氨基組分，其中所 述氨基組分是唯一的D-膚；化）制備駿基組分，其中所述駿基組分包含離去基團(tuán)并且是唯 一的D-膚；和（C)在蛋白酶存在下使所述氨基組分與所述駿基組分反應(yīng)，W便在所述氨基 組分與所述駿基組分之間形成膚鍵，在離去基團(tuán)裂解的情況下得到唯一的D-多膚（參見 W02003047743)。優(yōu)選所述蛋白酶為梭菌蛋白酶。
[0156] 本發(fā)明的聚合酶還應(yīng)包括實(shí)質(zhì)上與本發(fā)明的聚合酶且確切地說，與本文中所公 開的特定序列同源的聚合酶。術(shù)語基本上同源的應(yīng)理解為諸如同源性為至少75%，優(yōu)選 85 %，更優(yōu)選90 %且最優(yōu)選高于95 %、96 %、97 %、98 %或99 %。
[0157] 本發(fā)明的聚合酶活性展現(xiàn)部分還應(yīng)包括實(shí)質(zhì)上與本發(fā)明的聚合酶活性展現(xiàn)部分 且確切地說，與本文中所公開的特定序列同源的聚合酶活性展現(xiàn)部分。術(shù)語基本上同源的 應(yīng)理解為諸如同源性為至少75 %，優(yōu)選85 %，更優(yōu)選90 %且最優(yōu)選高于95 %、96 %、97 %、 98%或 99%。
[0158] 本發(fā)明的聚合酶或本發(fā)明的聚合酶活性展現(xiàn)部分中所存在的同源氨基酸的實(shí)際 百分比將取決于所述聚合酶或聚合酶活性展現(xiàn)部分中所存在的氨基酸的總數(shù)。修飾百分比 可W基于所述聚合酶或聚合酶活性展現(xiàn)部分中所存在的氨基酸的總數(shù)。
[0159] 兩個(gè)聚合酶或兩個(gè)聚合酶活性展現(xiàn)部分之間的同源性可W如本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知來確定。更具體地說，可W使用序列比較算法基于所指定的程序參數(shù)來計(jì)算測(cè)試序列 相對(duì)于參考序列的序列同源性百分比。所述測(cè)試序列優(yōu)選為聚合酶或聚合酶活性展現(xiàn)部 分，據(jù)稱其與不同的聚合酶或聚合酶活性展現(xiàn)部分同源或?qū)y(cè)試其是否與不同的聚合酶 或聚合酶活性展現(xiàn)部分同源和如果同源的話達(dá)到何種程度，由此所述不同的聚合酶或聚 合酶活性展現(xiàn)部分也稱為同源性參考序列?？蒞對(duì)用于比較的聚合酶的氨基酸序列進(jìn)行 最佳比對(duì)，例如通過Smith和Waterman的局部同源性算法（Smith&Waterman, 1981)、通 過Needleman和Wunsch的同源性比對(duì)算法（Needleman&Wunsch, 1970)、通過Pearson和 Lipman的相似性查找法（Pearson&Lipman, 1988)、通過計(jì)算機(jī)實(shí)施該些算法（威斯康星 遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup, 575Science 化.，Madison,Wis.)或通過目視檢查。
[0160] 適合于測(cè)定序列同一性百分比的算法的一個(gè)例子是基本局部比對(duì)搜索工具（在 下文中,"BLAST")中所使用的算法，參見例如Altschul等（Altschul等，1990和Altschul 等，1997)。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件可W通過美國國家生物技術(shù)信息中也（在下文中， "NCBI")公開獲得。使用可獲自NCBI的軟件，例如BLASTN(用于核巧酸序列）和BLASTP(用 于氨基酸序列）測(cè)定序列同一性時(shí)所使用的缺省參數(shù)描述于McGinnis等（McGinnis 等，2004)中。
[0161] 本發(fā)明的聚合酶還應(yīng)包括相對(duì)于本發(fā)明的聚合酶且確切地說，相對(duì)于本文中所公 開的和由它們的氨基酸序列定義的本發(fā)明的特定聚合酶具有某種程度的同一性的聚合酶。 更優(yōu)選地，本發(fā)明還包括相對(duì)于本發(fā)明的聚合酶且確切地說，相對(duì)于本文中所公開的和由 它們的氨基酸序列或其部分定義的本發(fā)明的特定聚合酶具有至少75%、優(yōu)選85%、更優(yōu)選 90%且最優(yōu)選超過95%、96%、97%、98%或99%的同一性的聚合酶。
[0162] 本發(fā)明的聚合酶活性展現(xiàn)部分還應(yīng)包括相對(duì)于本發(fā)明的聚合酶活性展現(xiàn)部分且 確切地說，相對(duì)于本文中所公開的和由它們的氨基酸序列定義的本發(fā)明的特定聚合酶活性 展現(xiàn)部分具有某種程度的同一性的聚合酶活性展現(xiàn)部分。更優(yōu)選地，本發(fā)明還包括相對(duì)于 本發(fā)明的聚合酶活性展現(xiàn)部分且確切地說，相對(duì)于本文中所公開的和由它們的氨基酸序列 或其部分定義的本發(fā)明的特定聚合酶活性展現(xiàn)部分具有至少75%、優(yōu)選85%、更優(yōu)選90% 且最優(yōu)選超過95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的同一性的那些聚合酶活性展現(xiàn)部分。
[0163] 結(jié)合本申請(qǐng)，如果不存在明確相反的指示，則術(shù)語核酸分子和核酸是W可互換的 方式使用。
[0164] 如本文中優(yōu)選使用，"核酸"是指多核巧酸或寡核巧酸，諸如脫氧核糖核酸（縮寫 DNA)和核糖核酸（縮寫RNA)。此外，術(shù)語"核酸唯括多種核酸。術(shù)語"核酸（nucleicacid) 和核酸（nucleicacids)"還應(yīng)理解為包括由核巧酸類似物制備的RNA或DNA的變體和類 似物、單鏈（有義或反義）和雙鏈多核巧酸或寡核巧酸作為等效物。脫氧核糖核巧酸包括 脫氧腺巧、脫氧胞巧、脫氧鳥巧和脫氧胸巧。核糖核巧酸包括腺巧、胞巧、鳥巧和尿巧。稱為 "多核巧酸"的核酸分子W其最廣泛的意義用于意指由共價(jià)鍵連接的兩個(gè)或更多個(gè)核巧酸 或核巧酸類似物，包括單鏈或雙鏈分子。術(shù)語"寡核巧酸"在本文中還用于意指由共價(jià)鍵連 接的兩個(gè)或更多個(gè)核巧酸或核巧酸類似物，但是如本文中所定義，寡核巧酸包含少于一百 個(gè)核巧酸。
[0165] 核酸的特征在于，形成核酸的所有連續(xù)核巧酸都是通過一個(gè)或多于一個(gè)共價(jià)鍵彼 此連接。更具體地說，所述核巧酸各自優(yōu)選通過磯酸二醋鍵或其它鍵與兩個(gè)其它核巧酸連 接或連接至兩個(gè)其它核巧酸，從而形成連續(xù)核巧酸的延伸段。然而，在所述排列中，兩個(gè)末 端核巧酸，即，優(yōu)選在5'端和3'端的核巧酸，各自僅連接到單個(gè)核巧酸，條件是所述排列是 線性的而不是環(huán)形的排列，且因而是線性的而不是環(huán)形的分子。
[0166] 在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含至少兩組連續(xù)核巧酸，由此在連續(xù) 核巧酸的各組內(nèi)，各核巧酸優(yōu)選通過磯酸二醋鍵或其它鍵與兩個(gè)其它核巧酸連接或連接至 兩個(gè)其它核巧酸，從而形成連續(xù)核巧酸的延伸段。然而，在所述排列中，兩個(gè)末端核巧酸， 目P，優(yōu)選在5'端和3'端的核巧酸，各自僅連接到單個(gè)核巧酸。然而，在所述實(shí)施方案中，兩 組連續(xù)核巧酸不是通過共價(jià)鍵彼此連接或連接至彼此，所述共價(jià)鍵通過共價(jià)鍵，優(yōu)選通過 所述兩個(gè)核巧酸之一的糖部分與所述兩個(gè)核巧酸或核巧中另一者的磯部分之間形成的共 價(jià)鍵來連接一組中的一個(gè)核巧酸與另一組或其它組中的一個(gè)核巧酸。然而，在替代實(shí)施方 案中，兩組連續(xù)核巧酸是通過共價(jià)鍵彼此連接或連接至彼此，所述共價(jià)鍵通過共價(jià)鍵，優(yōu)選 通過所述兩個(gè)核巧酸之一的糖部分與所述兩個(gè)核巧酸或核巧中另一者的磯部分之間形成 的共價(jià)鍵來連接一組中的一個(gè)核巧酸與另一組或其它組中的一個(gè)核巧酸。優(yōu)選地，所述至 少兩組連續(xù)核巧酸不通過任何共價(jià)鍵連接。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)組是 通過不同于磯酸二醋鍵的共價(jià)鍵連接。
[0167] 術(shù)語核酸優(yōu)選地還涵蓋D-核酸或k核酸。優(yōu)選地，核酸是心核酸1。另外，可能 的是核酸的一部分或若干部分作為D-核酸存在，且核酸的至少一部分或若干部分是k核 酸。術(shù)語核酸的"部分"應(yīng)意指僅僅一個(gè)核巧酸。所述核酸在本文中一般對(duì)應(yīng)地稱為D-核 酸和k核酸。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸由k核巧酸組成且包含 至少一個(gè)D-核巧酸。優(yōu)選地，所述D-核巧酸連接在任何延伸段和任何核酸的末端。
[0168] 如本文中所使用的k核酸是由k核巧酸組成，優(yōu)選完全由心核巧酸組成的核 酸。
[0169] 如本文中所使用的D-核酸是由D-核巧酸組成，優(yōu)選完全由D-核巧酸組成的核 酸。
[0170] 此外，如果無相反指示，則本文中W5'一3'方向闡述任何核巧酸序列。
[0171] 不管核酸是由D-核巧酸a-核巧酸或是兩者的組合組成，其中所述組合是例如隨 機(jī)組合或限定順序的由至少一個(gè)k核巧酸和至少一個(gè)D-核酸組成的延伸段，所述核酸分 子都可W由脫氧核糖核巧酸、核糖核巧酸或其組合組成。
[0172] 不考慮核酸是D-核酸、k核酸、其混合物、DNA或RNA或其中每一者和任何組合， 如本文中優(yōu)選使用的術(shù)語核酸還將涵蓋單鏈核酸和雙鏈核酸，由此經(jīng)歷根據(jù)本發(fā)明的方法 的核酸分子優(yōu)選為單鏈核酸。
[0173] 如本文中優(yōu)選使用的術(shù)語核酸還將涵蓋經(jīng)修飾的核酸。經(jīng)修飾的核酸可W是核巧 酸經(jīng)修飾的RNA或核巧酸經(jīng)修飾的DNA分子，由此所述RNA或DNA分子在個(gè)別核巧酸上經(jīng)廣 泛修飾W便通過具有抗核酸酶基團(tuán)的修飾增強(qiáng)穩(wěn)定性，例如2' -氨基、2' -C-帰丙基、2' -氣 基、2'-〇-甲基、2'-H(關(guān)于綜述，參見Usman&Cedergren, 1992)。
[0174] 如本文中優(yōu)選使用的術(shù)語核酸還將涵蓋完全閉合的核酸。如果核巧酸序列根據(jù)本 發(fā)明加W確定的核酸優(yōu)選通過共價(jià)鍵閉合，則實(shí)現(xiàn)了核酸的完全閉合，即環(huán)形結(jié)構(gòu)，由此更 優(yōu)選所述共價(jià)鍵在如本文中所公開的核酸分子序列的5'端與3'端之間制得。
[0175] 如優(yōu)選使用的術(shù)語核酸還將涵蓋包含非核酸分子部分的任何核酸分子。所述非核 酸分子部分可W選自如下文將更詳細(xì)概述的包括膚、寡膚、多膚、蛋白質(zhì)、碳水化合物、各種 基團(tuán)的基團(tuán)。術(shù)語核酸因而還將涵蓋包含至少一個(gè)核酸部分和至少一個(gè)可用于促進(jìn)核酸分 子遞送到生物系統(tǒng)（諸如細(xì)胞）中的其它部分的綴合物和/或復(fù)合物。所提供的綴合物和 復(fù)合物可W通過越過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移治療性化合物、改變藥物動(dòng)力學(xué)和/或調(diào)節(jié)本發(fā)明的核酸 的定位來賦予治療活性。該些種類的綴合物和復(fù)合物優(yōu)選地適合于越過細(xì)胞膜遞送的分 子，包括但不限于小分子、脂質(zhì)、磯脂、核巧、核巧酸、核酸、抗體、毒素、帶負(fù)電的聚合物及其 它聚合物，例如蛋白質(zhì)、膚、激素、碳水化合物、聚己二醇或聚胺。一般來說，所描述的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白被設(shè)計(jì)成能在存在或不存在可降解的連接子的情況下單獨(dú)地或作為多組分系統(tǒng)的一部 分加W使用。期望該些化合物能改善核酸分子在存在或不存在血清的情況下在來源于不同 組織的許多細(xì)胞類型中的遞送和/或定位（參見美國專利US5, 854, 038)。本文中所描述 的分子的綴合物可W經(jīng)由可生物降解的連接子，諸如可生物降解的核酸連接子分子而連接 到生物活性分子。
[0176] 如下文結(jié)合將測(cè)定序列的核酸所詳述，非核酸部分可W是PEG部分，即聚（己二 醇）部分，或肥S部分，即輕己基淀粉部分。
[0177] 非核酸部分和優(yōu)選地PEG和/或肥S部分可W直接或通過連接子連接到核酸分 子。核酸分子包含一個(gè)或多個(gè)修飾，優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)PEG和/或肥S部分也在本發(fā) 明內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)別連接子分子將多于一個(gè)PEG部分或肥S部分連接到核酸分 子。結(jié)合本發(fā)明使用的連接子本身可W是線性的或分支的。該些種類的連接子對(duì)于本領(lǐng)域 技術(shù)人員是已知的且進(jìn)一步描述于專利申請(qǐng)WO2005/074993和WO2003/035665中。
[0178] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述連接子是可生物降解的連接子。由于修飾從核酸 分子中釋放，故可生物降解的連接子允許尤其在動(dòng)物體（優(yōu)選為人體）內(nèi)停留時(shí)間方面 對(duì)核酸分子的特征進(jìn)行修飾?？缮锝到獾倪B接子的使用可W允許更好地控制核酸分子 的停留時(shí)間。所述可生物降解的連接子的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是可生物降解的連接子，諸 如在但不局限于國際專利申請(qǐng)WO2006/052790、WO2008/034122、WO2004/092191 和WO 2005/099768中所描述的可生物降解的連接子，由此在國際專利申請(qǐng)WO2004/092191和WO 2005/099768中，所述連接子是由一個(gè)或兩個(gè)如本文中所描述的修飾、核酸分子和介于其之 間的可生物降解的連接子組成的聚合寡核巧酸前藥的一部分。
[0179] 如本文中優(yōu)選使用，"核巧酸"包括但不限于天然存在的DNA核巧單磯酸鹽、二磯酸 鹽和H磯酸鹽：脫氧腺巧單磯酸鹽、二磯酸鹽和H磯酸鹽；脫氧鳥巧單磯酸鹽、二磯酸鹽和 H磯酸鹽；脫氧胸巧單磯酸鹽、二磯酸鹽和H磯酸鹽；和脫氧胞巧單磯酸鹽、二磯酸鹽和H 磯酸鹽。（在本文中對(duì)應(yīng)地稱為dA、dG、dT和dC或A、G、T和C)。術(shù)語核巧酸還包括天然 存在的RNA核巧單磯酸鹽、二磯酸鹽和H磯酸鹽；腺巧單磯酸鹽、二磯酸鹽和H磯酸鹽；鳥 嘿嶺單磯酸鹽、二磯酸鹽和H磯酸鹽；尿巧單磯酸鹽、二磯酸鹽和H磯酸鹽；和胞巧單磯酸 鹽、二磯酸鹽和H磯酸鹽（在本文中對(duì)應(yīng)地稱為A、G、U和C)是指堿基-糖-磯酸鹽組合， 目P，核酸分子（即，DNA分子和RNA分子）的單體單元。然而，換言之，術(shù)語"核巧酸"是指含 有環(huán)狀巧喃糖巧型糖（RNA中的P-D/1-核糖和DNA中的P-D/1-2' -脫氧核糖）的任何化合 物，其在5'位置經(jīng)磯酸化且具有經(jīng)由-葡糖基Cr-N鍵連接在C-1'糖位置的嘿嶺或嚼巧 型堿基。核巧酸可W是天然的或合成的，包括經(jīng)過塊修飾的核巧酸，尤其包括具有含經(jīng)修飾 堿基（例如5-甲基胞嚼巧）和經(jīng)修飾糖基（例如2' -O-甲基核糖基、2' -O-甲氧基己基核 糖基、2' -氣基核糖基、2' -氨基核糖基等等）的經(jīng)修飾核巧的核巧酸。
[0180]術(shù)語"核堿基"覆蓋天然存在的核堿基腺嘿嶺（A)、鳥嘿嶺（G)、胞嚼巧（C)、胸腺嚼 巧（T)和尿嚼巧做W及非天然存在的核堿基，諸如黃嘿嶺、二氨基嘿嶺、8-氧代-N6-甲基 腺嘿嶺、7-脫氮黃嘿嶺、7-脫氮鳥嘿嶺、M，M-橋亞己基胞嚼巧、N6,N6-橋亞己基-2, 6-二 氨基嘿嶺、5-甲基胞嚼巧、5?（C3-C6)-快基-胞嚼巧、5-氣尿嚼巧、5-漠尿嚼巧、假異胞嚼 巧、2-輕基-5-甲基-4-H哇并化巧、異胞嚼巧、異鳥嘿嶺、肌巧和美國專利US5, 432, 272 中、Rreier和Altmann的出版物（Rreier&Altmann, 1997)中所描述的"非天然存在的"核 堿基。術(shù)語"核堿基"因而不僅包括已知的嘿嶺和嚼巧雜環(huán)，而且包括其雜環(huán)類似物和互變 異構(gòu)體。
[0181]單鏈核酸可W形成獨(dú)特而又穩(wěn)定的H維結(jié)構(gòu)且特異性地結(jié)合祀分子（如抗體） 在本發(fā)明范圍內(nèi)。由D-核巧酸構(gòu)成的所述核酸分子稱為適體?？蒞針對(duì)若干個(gè)例如小分 子、蛋白質(zhì)、核酸的祀分子和甚至細(xì)胞、組織、和生物體鑒別適體，并且適體可W抑制特定祀 分子的體外和/或體內(nèi)功能。通常由稱為體外選擇的祀定向選擇方法或指數(shù)富集的配體 系統(tǒng)進(jìn)化（縮寫SELE)〇 來鑒別適體（Bock等，1992;Ellington&Szostak, 1990;Tuerk& Gold, 1990)。未經(jīng)修飾的適體主要由于核酸酶降解而快速從血流中清除，半衰期為數(shù)分鐘 到數(shù)小時(shí)，且通過腎從體內(nèi)清除，因?yàn)檫m體的分子量固有地較低。因此，為了在治療上使用 適體，它們必須在糖（例如核糖）骨架的2'位置上經(jīng)修飾炬urmester等，2006)。
[0182] 無所不在的核酸酶說明了適體的不穩(wěn)定性，其由手性構(gòu)筑塊，即k氨基酸組成。 因此，核酸酶的結(jié)構(gòu)也固有地是手性的，從而引起立體特異性底物識(shí)別。因此，該些酶僅接 受呈勝任的手性構(gòu)型的底物分子。因?yàn)檫m體和天然存在的核酸分子由D-核巧酸構(gòu)成，故 心寡核巧酸將逃脫酶識(shí)別和隨后的降解。不幸的是，由于相同的原理，在該種情況下，自然 界未產(chǎn)生能擴(kuò)增所述鏡像核酸的酶活性。因此核酸適體不能采用SELEX方法直接獲得。 但是，立體化學(xué)原理掲示了最終產(chǎn)生所要的功能k核酸適體的迂回途徑。
[0183] 如果體外選擇的值-)適體結(jié)合其天然祀，則該個(gè)適體的結(jié)構(gòu)鏡像W相同特征結(jié) 合所述天然祀的鏡像。該里，兩種相互作用配偶體具有相同的（非天然的）手性。由于生 命化學(xué)物和大部分生物化學(xué)化合物的同手性，所述對(duì)映RNA配體當(dāng)然將具有受限制的實(shí)際 用途。另一方面，如果針對(duì)（非天然的）鏡像祀進(jìn)行SELEX方法，則將獲得識(shí)別該個(gè)（非 天然的）祀的適體。所述適體，即所要的k適體的相應(yīng)鏡像構(gòu)型又識(shí)別天然祀。該種用 于產(chǎn)生生物穩(wěn)定的核酸分子的鏡像選擇方法在1996年首先公開化Iussmann等，1996 ; Nolte等，1996)，且產(chǎn)生了不僅對(duì)給定的祀分子呈現(xiàn)出高親和力和特異性，而且同時(shí)還呈 現(xiàn)出生物學(xué)穩(wěn)定性的功能鏡像核酸分子配體。在本發(fā)明內(nèi)，單鏈核酸分子是該樣的配體結(jié) 合心核酸，其稱為'鏡像異構(gòu)體'（來自于德語詞語'Spiegel'，鏡像）（參見'The Aptamer Hanclbook' ;Klussmann編，2006)
[0184] 其中，根據(jù)本發(fā)明的核酸可W包含修飾，所述修飾優(yōu)選地允許檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的 核酸。所述修飾優(yōu)選地選自放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記和英光標(biāo)記。所述修飾還選自本身可能被 選自放射性標(biāo)記、酶標(biāo)記和英光標(biāo)記的修飾修飾過的D-核巧酸。
[0185] 各種SEQ. ID. No.、本文中所使用的核酸、膚、寡膚和蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)、其實(shí)際序 列和內(nèi)部參考物編號(hào)匯總于下表中。
[0186]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于添加一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸到第一L-核酸的3'端的方法，其中所述方法包 括在包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)存在下使所述一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸與所述第一L-核酸 反應(yīng)的步驟，其中所述酶活性能夠添加一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸到所述第一L-核酸的3'端。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶活性展現(xiàn)部分由氨基酸序列組成，其中所 述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶活性 展現(xiàn)部分。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶活性是聚合酶活性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述聚合酶活性是熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸 序列包含至少300個(gè)氨基酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含介于 300和900個(gè)之間的個(gè)氨基酸，優(yōu)選介于300和600個(gè)之間的氨基酸，更優(yōu)選介于300和360 個(gè)之間的氨基酸，最優(yōu)選340至360個(gè)氨基酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述DNA聚合酶活性是DNA依賴性DNA聚合酶活 性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶活性展現(xiàn)部分是酶。
11. 根據(jù)權(quán)利要求3至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分是聚合 酶。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至4和8至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部 分選自非洲豬瘟病毒聚合酶X、嗜熱細(xì)菌聚合酶X核心域、大鼠聚合酶3、真核生物聚合酶 3、克列諾片段、克列諾外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、測(cè)序酶、T7DNA聚合 酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A，及其中每一個(gè)和任一個(gè)的變體， 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為非洲豬瘟病毒聚合酶X或其變體，其由選自以下 的氨基酸序列的所選氨基酸序列組成：根據(jù)SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:2 的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDN0:3的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDN0:4的氨基酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分選自聚 合酶DP04、嗜熱高溫球菌DNA聚合酶、火球菌屬某種DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚合酶、 Pfuturbo聚合酶、硫磺礦硫化葉菌DNA聚合酶、嗜熱古細(xì)菌DNA聚合酶、K0D聚合酶、Taq聚 合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合酶、Pab 聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合 酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、 Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片段、9°NmDNA聚 合酶、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelity聚合酶、Paq5000、Pfx-50、 Proofstart、FideliTaq、Elongase及其變體， 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為Dp〇4聚合酶或其變體，其由選自以下的氨基酸 序列的所選氨基酸序列組成：根據(jù)SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 16的氨基 酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根據(jù)SEQID NO: 19的氨基酸序列、根據(jù)SEQ ID NO:20的氨基酸序列、根據(jù)SEQ ID NO:21的氨基酸序列 和根據(jù)SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟是在允許進(jìn)行所 述添加所述至少一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸到所述第一 L-核酸，優(yōu)選允許進(jìn)行所述添加5至 20, 000個(gè)L-核苷酸、優(yōu)選10至2, 000個(gè)L-核苷酸、更優(yōu)選50至500個(gè)L-核苷酸、最優(yōu)選 50至100個(gè)L-核苷酸的條件下進(jìn)行。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述添加所述至少一個(gè)或多個(gè) L-核苷酸到所述第一 L-核酸是所述至少一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸共價(jià)結(jié)合到所述第一 L-核 酸，優(yōu)選通過在所述第一 L-核酸的3' 0H與所述至少一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸之一的5'磷酸 之間形成3'-5'磷酸二酯鍵。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 L-核酸是由DNA、RNA、 經(jīng)修飾的DNA、經(jīng)修飾的RNA或其組合組成的引物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 L-核酸由L-核苷酸和 任選的修飾組成。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 L-核酸由L-核苷酸組 成。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述反應(yīng)還包含第二L-核酸，其 中優(yōu)選通過沃森-克里克堿基配對(duì)使一分子的所述第一 L-核酸與一分子的所述第二L-核 酸雜交。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分合成與所述第二L-核 酸互補(bǔ)的第三L-核酸，其中所述第三L-核酸包含所述第一 L-核酸和添加到所述第一 L-核 酸的3'端的L-核苷酸。
21. -種用于在L-核苷酸和包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)存在下擴(kuò)增靶L-核酸的方 法，其中所述酶活性能夠擴(kuò)增所述靶L-核酸。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述酶活性展現(xiàn)部分由氨基酸序列組成，其中 所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21和22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶活 性展現(xiàn)部分。
24. 根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶活性是聚合酶活性。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述聚合酶活性是熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基 酸序列包含至少300個(gè)氨基酸。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含介 于300和900個(gè)之間的氨基酸，優(yōu)選介于300和600個(gè)之間的氨基酸，更優(yōu)選介于300和 360個(gè)之間的氨基酸，最優(yōu)選介于340和360個(gè)之間的氨基酸。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性是DNA聚合酶活 性。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述DNA聚合酶活性是DNA依賴性DNA聚合酶 活性。
30. 根據(jù)權(quán)利要求21至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶活性展現(xiàn)部分是酶。
31. 根據(jù)權(quán)利要求23至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分是聚合 酶。
32. 根據(jù)權(quán)利要求21至24和28至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性展 現(xiàn)部分選自非洲豬瘟病毒聚合酶X、嗜熱細(xì)菌聚合酶X核心域、大鼠聚合酶3、真核生物聚 合酶0、克列諾片段、克列諾外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、測(cè)序酶、T7DNA 聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A，及其中每一個(gè)和任一個(gè)的變體， 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為非洲豬瘟病毒聚合酶X或其變體，其由選自以下 的氨基酸序列的所選氨基酸序列組成：根據(jù)SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:2 的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:3的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDNO:4的氨基酸序列。
33. 根據(jù)權(quán)利要求21至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分選自 聚合酶DP04、嗜熱高溫球菌DNA聚合酶、火球菌屬某種DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚合酶、 Pfuturbo聚合酶、硫磺礦硫化葉菌DNA聚合酶、嗜熱古細(xì)菌DNA聚合酶、K0D聚合酶、Taq聚 合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合酶、Pab 聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合 酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、 Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片段、9°NmDNA聚 合酶、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelity聚合酶、Paq5000、Pfx_50、 Proofstart、FideliTaq、Elongase及其變體， 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為Dp〇4聚合酶或其變體，其由選自以下的氨基酸 序列的所選氨基酸序列組成：根據(jù)SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 16的氨基 酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根據(jù)SEQID NO: 19的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:20的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:21的氨基酸序列 和根據(jù)SEQIDNO:22的氨基酸序列。
34. 根據(jù)權(quán)利要求21至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述反應(yīng)步驟是在允許擴(kuò)增所述 靶L-核酸的條件下進(jìn)行。
35. 根據(jù)權(quán)利要求21至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法使用至少一種引物，優(yōu) 選使用兩種引物，其中所述至少一種引物由L-核苷酸和任選的修飾組成。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述引物由L-核苷酸組成。
37. 根據(jù)權(quán)利要求21至36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶L-核酸由L-核苷酸組 成。
38. 根據(jù)權(quán)利要求21至37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
39. 根據(jù)權(quán)利要求21至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶L-核酸由L-DNA組成。
40. 根據(jù)權(quán)利要求21至39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶L-核酸由20至20, 000 個(gè)L-核苷酸，優(yōu)選30至2, 000個(gè)L-核苷酸，更優(yōu)選40至500個(gè)L-核苷酸，最優(yōu)選50至 100個(gè)L-核苷酸組成。
41. 一種包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)，其中所述酶活性展現(xiàn)部分由氨基酸序列組成， 其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸，其中所述酶活性能夠添加一個(gè)或多個(gè)L-核苷 酸到所述第一L-核酸的3'端。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的蛋白質(zhì)，其中所述酶活性展現(xiàn)部分是聚合酶活性展現(xiàn)部 分。
43. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的蛋白質(zhì)，其中所述酶活性是聚合酶活性。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的蛋白質(zhì)，其中所述聚合酶活性是熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
45. 根據(jù)權(quán)利要求42至44中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨 基酸序列包含至少300個(gè)氨基酸。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的蛋白質(zhì)，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分的氨基酸序列包含 介于300和900個(gè)之間的氨基酸，優(yōu)選介于300和600個(gè)之間的氨基酸，更優(yōu)選介于300和 360個(gè)之間的氨基酸，最優(yōu)選介于340和360個(gè)之間的氨基酸。
47. 根據(jù)權(quán)利要求43至46中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述聚合酶活性是DNA聚合酶 活性。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的蛋白質(zhì)，其中所述DNA聚合酶活性是DNA依賴性DNA聚合 酶活性。
49. 根據(jù)權(quán)利要求41至48中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述酶活性展現(xiàn)部分是酶。
50. 根據(jù)權(quán)利要求42至48中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分是聚 合酶。
51. 根據(jù)權(quán)利要求41至43和47至50中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述聚合酶活性展 現(xiàn)部分選自非洲豬瘟病毒聚合酶X、嗜熱細(xì)菌聚合酶X核心域、大鼠聚合酶3、真核生物聚 合酶0、克列諾片段、克列諾外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、測(cè)序酶、T7DNA 聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶A，及其中每一個(gè)和任一個(gè)的變體， 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為非洲豬瘟病毒聚合酶X或其變體，其由選自以下 的氨基酸序列的所選氨基酸序列組成：根據(jù)SEQIDNO: 1的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:2 的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDN0:3的氨基酸序列和根據(jù)SEQIDN0:4的氨基酸序列。
52. 根據(jù)權(quán)利要求41至50中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分選 自聚合酶DP04、嗜熱高溫球菌DNA聚合酶、火球菌屬某種DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚合 酶、Pfuturbo聚合酶、硫磺礦硫化葉菌DNA聚合酶、嗜熱古細(xì)菌DNA聚合酶、K0D聚合酶、Taq 聚合酶、Tth聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、Sac聚合酶、Bst聚合酶、Poc聚合酶、 Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand 聚合酶、PlatinumTaq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚 合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、AmpliTaq、Stoffel片段、9°NmDNA 聚合酶、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelity聚合酶、Paq5〇00、Pfx_5〇、 Proofstart、FideliTaq、Elongase及其變體， 其中所述聚合酶活性展現(xiàn)部分優(yōu)選為Dp〇4聚合酶或其變體，其由選自以下的氨基酸 序列的所選氨基酸序列組成：根據(jù)SEQIDNO: 15的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 16的氨基 酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 17的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO: 18的氨基酸序列、根據(jù)SEQID NO: 19的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:20的氨基酸序列、根據(jù)SEQIDNO:21的氨基酸序列 和根據(jù)SEQIDNO:22的氨基酸序列。
53. -種包含根據(jù)SEQIDNO: 15的氨基酸序列的聚合酶，其中所述氨基酸序列的氨基 酸是D-氨基酸。
54. -種包含根據(jù)SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的聚合酶，其中所述氨基酸序列的氨基酸 是D-氨基酸。
55. -種野生型聚合酶的聚合酶變體，其中所述野生型聚合酶由根據(jù)SEQ ID NO: 15的 氨基酸序列組成，且其中所述聚合酶變體具有聚合酶活性，優(yōu)選具有熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體包含氨基酸序列，其中 所述聚合酶變體的氨基酸序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在至少一個(gè)氨基酸位置 上不同。
57. 根據(jù)權(quán)利要求55至56中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體的氨基酸 序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在一個(gè)或兩個(gè)氨基酸位置上不同。
58. 根據(jù)權(quán)利要求55至57中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體的氨基酸 序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在根據(jù)SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的氨基酸位置 155和/或203上或在與其對(duì)應(yīng)的氨基酸位置上不同，其中優(yōu)選以半胱氨酸取代位置155和 /或203上的氨基酸。
59. 根據(jù)權(quán)利要求55至58中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體由選自以 下的氨基酸序列組成：根據(jù)SEQ ID NO: 16的氨基酸序列、根據(jù)SEQ ID NO: 17的氨基酸序列 和根據(jù)SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。
60. 根據(jù)權(quán)利要求55至57中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體由選自 以下的氨基酸序列組成：根據(jù)SEQ ID NO: 19的氨基酸序列、根據(jù)SEQ ID N0:20的氨基酸序 列、根據(jù)SEQ ID NO:21的氨基酸序列和根據(jù)SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
61. 根據(jù)權(quán)利要求55至60中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體的氨基酸 序列的氨基酸是D-氨基酸。
62. 根據(jù)權(quán)利要求55至60中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體的氨基酸 序列的氨基酸是L-氨基酸。
63. -種野生型聚合酶的聚合酶變體，其中所述野生型聚合酶由根據(jù)SEQ ID NO: 1的氨 基酸序列組成，并且其中所述聚合酶變體具有聚合酶活性。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體包含氨基酸序列，其中 所述聚合酶變體的氨基酸序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在至少一個(gè)氨基酸位置 上不同。
65. 根據(jù)權(quán)利要求63至64中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體的氨基酸 序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在一個(gè)氨基酸位置上不同。
66. 根據(jù)權(quán)利要求63至65中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體的氨基 酸序列與所述野生型聚合酶的氨基酸序列在至少一個(gè)氨基酸位置上不同，其中所述至少一 個(gè)氨基酸位置選自氨基酸位置80、氨基酸位置86和氨基酸位置124,各氨基酸序列根據(jù)SEQ ID NO: 1或在與其對(duì)應(yīng)的氨基酸位置上。
67. 根據(jù)權(quán)利要求63至66中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體由選自以 下的氨基酸序列組成：根據(jù)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列、根據(jù)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列和 根據(jù)SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
68. 根據(jù)權(quán)利要求63至67中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體的氨基酸 序列的氨基酸是D-氨基酸。
69. 根據(jù)權(quán)利要求63至67中任一項(xiàng)所述的聚合酶變體，其中所述聚合酶變體的氨基酸 序列的氨基酸是L-氨基酸。
70. -種包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)的用途，其用于添加一個(gè)或多個(gè)L-核苷酸到 L-核酸的3'端的方法。
71. -種包含酶活性展現(xiàn)部分的蛋白質(zhì)的用途，其用于在L-核苷酸存在下擴(kuò)增靶L-核 酸的方法。
72. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的用途，其中所述用于擴(kuò)增靶L-核酸的方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)。
73. 根據(jù)權(quán)利要求70至72中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述蛋白質(zhì)是根據(jù)權(quán)利要求41 至69中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)由氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列的 氨基酸是D-氨基酸。
74. -種用于鑒別結(jié)合靶分子的L-核酸分子的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 產(chǎn)生L-核酸分子的異源群體； (b) 使步驟（a)的L-核酸分子的異源群體與所述靶分子接觸； (c) 分離未被所述靶分子結(jié)合的所述L-核酸分子；和 (d) 擴(kuò)增被所述靶分子結(jié)合的所述L-核酸分子，其中所述擴(kuò)增步驟使用根據(jù)權(quán)利要求 41至69中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)， 其中所述蛋白質(zhì)由氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
75. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，還包括以下步驟： (e) 對(duì)被所述靶分子結(jié)合的L-核酸分子進(jìn)行測(cè)序；和 (f) 合成核苷酸序列與步驟（e)中所測(cè)序的所述L-核酸分子的核苷酸序列一致的核酸 分子。
76. 根據(jù)權(quán)利要求74至75中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟（a)的L-核酸分子的異源 群體的核酸分子在其5'端及其3'端上包含引物結(jié)合位點(diǎn)和分別與引物結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的序 列，這允許通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來擴(kuò)增步驟（d)中所獲得的所述L-核酸分子，其中所述聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所使用的所述聚合酶是根據(jù)權(quán)利要求40至69中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，所 述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所使用的所述引物由L-核苷酸組成，且所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所使 用的所述核苷酸是L-核苷酸。
77. 根據(jù)權(quán)利要求74至76中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟（d)之后引入以下步驟： (da)使所述擴(kuò)增的核酸分子與所述靶分子接觸，其中 步驟（b)和任選的步驟（c)和/或⑷是在步驟（e)之前進(jìn)行，其中步驟（da)、（b)、 (c)和任選的（d)是按照這個(gè)順序進(jìn)行一次或若干次。
78. 根據(jù)權(quán)利要求74至77中任一項(xiàng)所述的方法，其中結(jié)合所述靶分子的L-核酸是 DNA。
79. 根據(jù)權(quán)利要求74至78中任一項(xiàng)所述的方法，其中結(jié)合所述靶分子的L-核酸分子 由L-核苷酸組成。
80. -種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求41至69中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的方法，其中 a)化學(xué)合成根據(jù)權(quán)利要求41至69中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的兩個(gè)或更多個(gè)片段，其中 所述片段以其整體形式形成所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列，優(yōu)選通過固相肽合成來合成所述片 段，且 b)通過鏈段縮合、天然化學(xué)連接、酶連接或其組合將步驟a)的所述片段彼此連接， 其中所述蛋白質(zhì)由氨基酸序列組成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。
81. 根據(jù)權(quán)利要求80所述的用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其中用于酶連接的所述酶是梭菌 蛋白酶。
82. -種用于通過酶連接將第一D-肽或第一D-蛋白質(zhì)與第二D-肽或第二D-蛋白質(zhì) 彼此連接的方法，其中 所述第一D-肽或所述第一D-蛋白質(zhì)在其N末端由保護(hù)基保護(hù)，且在其C末端由4-胍 基苯基酯基團(tuán)保護(hù)，且 所述第二D-肽或所述第二D-蛋白質(zhì)包含游離N末端和處于其C末端的硫代烷基酯基 團(tuán)或硫代芳基酯基團(tuán)。
83. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中用于所述酶連接的酶是梭菌蛋白酶。
【文檔編號(hào)】C12P21/00GK104379748SQ201380024198
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月16日
【發(fā)明者】A·佩什, R·大衛(wèi), F·雅羅什, M·雅恩茲, S·克魯斯曼 申請(qǐng)人:諾松制藥股份公司