草甘膦抗性植物和相關(guān)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一些從原核生物DGT酶衍生的多肽，和可用于編碼它們的核酸。
【專利說明】草甘麟抗性植物和相關(guān)方法
[0001] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0002] 本申請要求獲得于2012年2月1日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號61/593, 555 的利益，還要求獲得于2012年4月17日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號61/625, 222的利 益。
[0003] 根據(jù)37C. F. R. § 1. 821 (c)或（e)_作為ASCII文本文件提交的序列表的陳述
[0004] 根據(jù)37C. F. R. § 1. 821 (c)或（e)，含有ASCII文本格式的序列列表的文件已經(jīng)和 本專利申請一起提交。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本公開涉及植物生物技術(shù)。特定的實(shí)施方案涉及參與N-(膦酰基甲基）甘氨酸代 謝的新多肽，和編碼這些多肽的核酸。特定的實(shí)施方案涉及包含前述多肽和/或核酸的植 物、植物部分、和植物細(xì)胞。
[0006] 背景
[0007] 各種雜草很長時(shí)間以來都是耕地面臨的難題。盡管雜草控制可能是勞動(dòng)力密集型 的操作，但是高效的殺雜草化學(xué)除草劑的獲得已經(jīng)使它變得更加容易。除草劑的廣泛使用， 加上作物品種和肥料的改良，對農(nóng)業(yè)的"綠色革命"做出了顯著貢獻(xiàn)。特別有用的除草劑是 具有廣譜除草活性的除草劑。不幸的是，廣譜除草劑通常會(huì)對暴露于該除草劑的作物植株 造成有害影響?？朔@個(gè)問題的一個(gè)方法是產(chǎn)生能夠耐受廣譜除草劑的作物。
[0008] 廣譜除草劑的一個(gè)實(shí)例是N-膦酰甲基甘氨酸，也稱為草甘膦。草甘膦已經(jīng)被全世 界的農(nóng)民廣泛應(yīng)用于在作物種植之前，例如在免耕種植（no-till farming)中，控制雜草。 此外，草甘膦是一種用于在生長周期之間或作物輪作中控制雜草和自生植物（volunteer plant)的高效手段。草甘膦在使用后不會(huì)在土壤中遺留（carry-over)，因此被認(rèn)為是可用 于農(nóng)業(yè)的環(huán)境安全性最高的、廣泛有效的化學(xué)除草劑之一。
[0009] 草甘膦通過抑制莽草酸途徑殺死植物。這個(gè)途徑導(dǎo)向芳族化合物（包括氨基酸、 維生素和植物激素）的生物合成。草甘膦通過結(jié)合并抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷 酸合成酶（通常被稱作"EPSP合成酶"和"EPSPS"）的活性，阻斷磷酸烯醇式丙酮酸（PEP) 與3-磷代莽草酸縮合形成5-烯醇式丙酮酰-3-磷代莽草酸。
[0010] 不幸的是，已知沒有作物可以天然耐受草甘膦，因此，這種除草劑在栽培作物中控 制雜草的用途受到了限制。一種產(chǎn)生耐草甘膦作物的方法是，使用基因工程技術(shù)將編碼異 源草甘膦耐受形式的EPSPS的基因?qū)氲阶魑镏小＠没瘜W(xué)誘變，已經(jīng)在細(xì)菌中產(chǎn)生了草 甘膦耐受形式的EPSPS，并將該異源基因?qū)氲搅酥参矬w內(nèi)，產(chǎn)生了草甘膦耐受性植物。參 見，例如Comai et al. (1983) Science 221:370-71。可在作物中過表達(dá)異源EPSPS基因以 獲得期望的耐受水平。
[0011] 前述關(guān)于相關(guān)技術(shù)及其相關(guān)局限性的實(shí)例只是說明性的，而不是排它性的。通過 閱讀本說明書，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易想到相關(guān)技術(shù)的其它局限性。
[0012] 發(fā)明公開
[0013] 本文描述了與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的分離多肽，和編碼與SEQ ID N0:1具有至少90%同一性的多肽的核酸（例如SEQ ID N0s:2-4)。還描述了含有與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的異源多肽的植物、植物部分、植物器官、植物種子和植物細(xì)胞。
[0014] -些實(shí)施方案包括植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞，其包含 編碼與SEQ ID N0:1具有至少90%同一性的多肽異源核酸。在特定的實(shí)例中，該異源核酸 包含與SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3具有至少80%的序列同一性的核苷酸序列。一些實(shí)施 方案包括植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞，其包含在高嚴(yán)格條件下與 具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3的另一核酸雜交的異源核酸。在特定的實(shí)例中，包含在 高嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3的另一核酸雜交的異源核酸的植物、植 物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞包含由該異源核酸編碼的多肽，該多肽賦予該 植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞草甘膦耐受性（或者增加草甘膦耐受 性）。
[0015] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本公開涉及用于產(chǎn)生抗草甘膦的植物、植物部分、植物器 官、植物種子和/或植物細(xì)胞的的方法，包括：用編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性 的多肽的核酸轉(zhuǎn)化植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞；和表達(dá)該核酸，從 而產(chǎn)生與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的多肽。
[0016] 其他實(shí)施方案包括這樣的載體，其包含編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性 的多肽的核酸。特定的實(shí)例包括這樣的載體，其包括編碼與SEQ ID NO: 1具有至少95%同 一性的多肽的核酸。例如，載體可包含與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3具有至少90%同一 性的核酸序列。
[0017] 特定的實(shí)施方案包括草甘膦耐受性植物和植物細(xì)胞，其表達(dá)與SEQ ID NO: 1具有 至少90%同一性的異源多肽。
[0018] 其他實(shí)施方案包括用于在含有抗除草劑植物的田地或耕種區(qū)內(nèi)控制雜草的方法， 其中該方法可以包括：在田地或耕種區(qū)內(nèi)種植含有編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一 性的異源多肽的核酸的植物或植物種子；和向該田地或耕種區(qū)施用足以控制田中的雜草、 而不會(huì)顯著影響該植物的量的草甘膦。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，本公開涉及可再生的細(xì)胞，用于抗草甘膦植物的組織培養(yǎng)。這 種組織培養(yǎng)物可以能夠再生出具有前述的抗草甘膦植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，還 能夠再生出與抗草甘膦植物具有基本上相同的基因型的植物。這樣組織培養(yǎng)物中的可再生 細(xì)胞可以是，例如，胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種 子、莢果、和莖。特定的實(shí)施方案涉及從根據(jù)前述的組織培養(yǎng)物再生的植物。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，本公開涉及不能再生產(chǎn)生植物的細(xì)胞，例如用于產(chǎn)生耐受草 甘膦的植物細(xì)胞系。在其它實(shí)施方案中，本公開涉及部分地包含這些細(xì)胞的植物。
[0021] 在某些實(shí)施方案中，本公開涉及向耕種區(qū)域內(nèi)種植的作物施用多種除草劑。在多 種除草劑的基礎(chǔ)上附加過頂施用（over the top application)草甘膦，可以對除草劑的不 同性質(zhì)加以利用，從而提供將更好的靈活性與經(jīng)濟(jì)性相結(jié)合的雜草控制。例如，各種除草劑 可能在耕種區(qū)域內(nèi)具有不同的耐久性；即某些除草劑在施用到該區(qū)域后可能持續(xù)存在并在 相對長的時(shí)間內(nèi)有效，而其它除草劑可能會(huì)被快速降解成其它的和/或無活性的化合物。 根據(jù)特定的實(shí)施方案，改良的除草劑施用系統(tǒng)允許使用草甘膦和多種除草劑，從而種植者 能夠根據(jù)具體的使用情況調(diào)整具體除草劑的選擇。
[0022] 在其他實(shí)施方案中，本公開涉及用于制作和使用耐受多于一種除草劑或除草劑類 型或亞型的植物的方法和組合物，如下文所述。在特定的實(shí)施方案中，提供了同時(shí)耐受草甘 膦和至少一種其它除草劑（或除草劑類型或亞型）或化學(xué)品（或化學(xué)類型或亞型）（例如殺 真菌劑、殺蟲劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等）的植物。這類植物可以用于，例如，包括用多種除草劑 處理作物的方法。因此，本公開提供了除草劑抗性植物，其耐受用除草劑或除草劑組合（包 括各自通過不同的除草活性模式發(fā)揮作用的除草劑的組合）的處理，或者耐受用至少一種 除草劑和至少一種其它化學(xué)品的組合的處理。通過這種方式，本公開描述了用于種植作物 的改良方法，其中選擇性地控制雜草。
[0023] 根據(jù)一些實(shí)施方案的除草劑抗性植物可以包括編碼可賦予草甘膦耐受性的異源 多肽的核酸分子，和編碼賦予2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D)耐受性的多肽的核酸分子。根據(jù) 前面的段落，提供至少包括第三核酸分子的植物，該第三核酸分子編碼賦予植物從下組選 出的一種性狀的多肽：除草劑耐受性性狀；昆蟲抗性性狀；農(nóng)藝學(xué)性狀；疾病抗性性狀；修 飾的脂肪酸性狀；和植酸降低的性狀。
[0024] 在一些實(shí)例中，除草劑抗性的植物包含編碼賦予草甘膦耐受性的多肽的異源核酸 分子，和編碼賦予草胺膦耐受性的多肽的核酸分子。一些實(shí)例包括這樣的除草劑抗性植物， 它們包含編碼賦予植物選自下組的性狀的多肽的核酸分子：除草劑耐受性性狀；昆蟲抗性 性狀；農(nóng)藝性狀；抗病性性狀；修飾的脂肪酸性狀；和植酸降低的性狀。
[0025] 在特定的實(shí)例中，除草劑抗性植物包括編碼賦予草甘膦耐受性的多肽的異源核酸 分子，和編碼賦予對抑制乙酰乳酸合酶（ALS) ((Lee et al. (1988)EMBOJ. 7:1241)，也稱乙 酰輕酸合成酶（AHAS) (Miki et al. (1990)Theor. Appl. Genet. 80:449))的除草劑的耐受性 的多肽的核酸分子。一些實(shí)例包括這樣的除草劑抗性植物，它們包含編碼賦予植物選自下 組的性狀的多肽的核酸分子：除草劑耐受性性狀；昆蟲抗性性狀；農(nóng)藝性狀；抗病性性狀； 修飾的脂肪酸性狀；和植酸降低的性狀。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，一種核酸可以在植物中與任何其他的核酸分子組合（或"疊 加"），以便，例如但不限于，提供額外的對草甘膦或其它除草劑的抗性或耐受性，提供對選 定的昆蟲或疾病的抗性，或提供營養(yǎng)強(qiáng)化，提供改良的農(nóng)藝學(xué)性狀，和提供可用于飼料、食 品、工業(yè)用途、醫(yī)藥用途、和/或其它用途的蛋白或其它有用產(chǎn)品。實(shí)例包括在植物基因組 內(nèi)疊加兩種或更多種感興趣的核酸。這種"基因疊加"可以通過使用兩個(gè)或多個(gè)事件的常 規(guī)植物育種、用含有感興趣的序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物、轉(zhuǎn)基因植物的再轉(zhuǎn)化、或通過同源重 組介導(dǎo)的靶向整合添加新的性狀來加以實(shí)現(xiàn)。這種疊加的具體實(shí)例包括如下的任意組合： dgt-28 核酸；Cry34Abl 核酸；Cry35Abl 核酸；CrylF 核酸；CryIAc 核酸；aad-12 核酸；aad-1 核酸；pat核酸；和DSM-2核酸。
[0027] 除了上述示例性方面和實(shí)施方案之外，進(jìn)一步的方面和實(shí)施方案通過研宄下面的 描述將易于想到。
[0028] 附圖簡述
[0029] 圖1包括示例EPSP合酶（g卩，DGT-28、DGT-32、DGT-33及其它）的部分序列比對。 這3種示例DGT酶都在aroA EPSP合酶氨基酸位置96處具有一個(gè)保守的丙氨酸。該氨基 酸的位置用星號指示，且該氨基酸被下劃線標(biāo)出。
[0030] 圖2包括示例DGT酶（即，DGT-l、DGT-3和DGT-7)的比對結(jié)果。第一個(gè)星號指示 了從甘氨酸變成丙氨酸的突變氨基酸殘基的位置。第二個(gè)星號指示了從蘇氨酸變成異亮氨 酸的第二個(gè)突變氨基酸殘基的位置。第三個(gè)星號指示了從脯氨酸變成絲氨酸的第三個(gè)突變 氨基酸殘基的位置。
[0031] 圖3-30包括各種示例質(zhì)粒的圖譜：pDAB107527 (圖3) ;pDAB105530 (圖4); pDAB105531(圖 5) ;pDAB105532(圖 6) ;pDAB105533(圖 7) ;pDAB105534(圖 8); pDAB4104(圖 9) ;pDAB102715(圖 10) ;pDAB107532(圖 11) ;pDAB107534(圖 12); pDAB102785(圖 13) ;pDAB100445(圖 14) ;pDAB102946(圖 15) ;pDAB100469(圖 16); pDAB102028(圖 17) ;pDAB102029(圖 18) ;pDAB102032(圖 19) ;pDAB102034(圖 20); pDAB100429(圖 21) ;pDAB100442(圖 22) ;pDAB100430(圖 23) ;pDAB102036(圖 24); pDAB102038(圖 25) ;pDAB102040(圖 26) ;pDAB102042(圖 27) ;pDAB107712(圖 28); PDAB107713 (圖 29);和 pDAB107714 (圖 30)。
[0032] 圖31包括在DGT-I (A)和DGT-7 (B)中導(dǎo)入不同突變后用ImM PEP獲得的IC5。值。 對于圖31㈧和圖31⑶的IC5tl曲線，實(shí)心三角形代表野生型，實(shí)心圓形代表GA突變體，空 心方形代表GAPS突變體，實(shí)心方形代表TIPS突變體。
[0033] 圖32-46包括各種示例質(zhì)粒的圖譜：pDAB102719(圖32) ;pDAB102718(圖33); pDAB107663(圖 34) ;pDAB107664(圖 35) ;pDAB107665(圖 36) ;pDAB107666(圖 37); pDAB109812(圖 38) ;pDAB101556(圖 39) ;pDAB107698(圖 40) ;pDAB108384(圖 41); pDAB108385(圖 42) ;pDAB108386(圖 43) ;pDAB108387(圖 44) ;pDAB102716(圖 45); pDAB102717(圖 46) ;pDAB110828(圖 47) ;pDAB110827(圖 48) ;pDAB107545(圖 49); pDAB107548(圖 50) ;pDAB107553(圖 51) ;pDAB102792(圖 52) ;pDAB107602(圖 53);和 pDAB107533(圖 54)。
[0034] 實(shí)施本發(fā)明的模式
[0035] I.概覽
[0036] 本文公開了參與N-(膦?；谆└拾彼岽x的新多肽，和編碼這些多肽的核酸。 在一些實(shí)例中，在異源表達(dá)這些多肽的植物細(xì)胞中這些多肽賦予（或提高）對草甘膦的耐 受性，而例如不會(huì)對EPSP合酶與其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)的結(jié)合造成不良影 響。
[0037] IL 術(shù)語
[0038] 為了進(jìn)一步闡明本公開的范圍，提供了下列具體的定義、術(shù)語和縮寫。
[0039] 除非特別定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 所普遍理解的相同的含義。除非它出現(xiàn)的上下文中另有明確指示，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括 復(fù)數(shù)形式，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解為包括單數(shù)形式。因此，不定冠詞"一個(gè)/種"和"該"當(dāng)在要 素或組分的前面使用時(shí)對該元件或組分的實(shí)例（即出現(xiàn)）數(shù)目沒有限定作用。當(dāng)在本文中 提供數(shù)值的范圍時(shí)（例如，"小于大約x"，"小于X"和"例如，XI...和X2"），該范圍應(yīng)當(dāng)理 解為包括所提供范圍內(nèi)包含的所有數(shù)值和數(shù)值范圍，就如同這些所包含的數(shù)值和范圍被明 確地列舉一樣。
[0040] 如本文中所使用的，術(shù)語"包括"，"包含"，"具有"和"含有"及其變化形式，是開放 式的（即，非排他的）。例如，包含一系列要素的組合物或方法，不必僅限于那些要素。這 樣的組合物或方法可以（或者可以不）包括其他未明確列出的或該組合物或方法固有的要 素。此外，除非明確相反地說明，否則"或"的使用表示包含的（不是排他的）意義。例如， 條件"A或B"可由下列的任一種滿足:A真（或存在）且B假（或不存在）；-A假（或不存 在）且B真（或存在）；-A和B都真（或存在）。
[0041] 植物：如本文所使用的，術(shù)語"植物"包括整個(gè)植物及植物的任何后代、細(xì)胞、組織、 或部分。術(shù)語"植物部分"包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：種子（包括成熟種子 和未成熟種子）；植物插條；植物細(xì)胞；植物細(xì)胞培養(yǎng)物；植物器官（如花粉、胚、花、果實(shí)、 芽（shoot)、葉、根、莖、和外植體）。植物組織或植物器官可以是種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、 或者任何其他被組織成一定結(jié)構(gòu)或功能單元的植物細(xì)胞群。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物可能能 夠再生出具有該細(xì)胞或組織所來源的植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，并且可能能夠再 生出與該植物具有基本上相同的基因型的植物。與之相反，一些植物細(xì)胞不能夠再生產(chǎn)生 植物。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以是胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈傷組 織、花粉、葉、花藥、根、根尖、須、花、果仁、穗、穗軸、殼、或莖。
[0042] 植物部分包括可收獲的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部 分包括，例如但不限于：種子；果實(shí)；插條；苗；塊莖；和根砧木。植物的可收獲部分可以是 植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；塊莖；葉；莖；果實(shí)；種子；和根。
[0043] 植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理的單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以是 分離的單細(xì)胞或細(xì)胞聚集體的形式（例如，松散型（friable)愈傷組織和培養(yǎng)細(xì)胞），并且 可以是更高級有組織單元的一部分（例如，植物組織、植物器官、和植物）。因此，植物細(xì) 胞可以是原生質(zhì)體、配子產(chǎn)生細(xì)胞、或可以再生成完整植物的細(xì)胞或細(xì)胞集合。因此，包括 多個(gè)植物細(xì)胞并能夠再生為完整植物的種子，在本文的實(shí)施方案中被認(rèn)為是一個(gè)"植物細(xì) 胞"。
[0044] 除草劑抗性/耐受性：當(dāng)指稱抗草甘膦或耐受草甘膦的植物時(shí)，它意味著對該植 物施用一定量的草甘膦不會(huì)顯著影響或殺死植物，而相同物種的野生型植物將由于該一定 量的草甘膦的施用而受到顯著影響和/或被殺死。植物可能天然耐受特定的除草劑，或者 植物可能作為遺傳工程的結(jié)果而被賦予除草劑耐受性，所述遺傳工程例如選擇性育種、遺 傳轉(zhuǎn)化、和/或在植物基因組中導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。"草甘膦抗性植物"是指含有如下多肽或核酸 分子的植物，其中當(dāng)將該多肽或核酸分子提供給表達(dá)它的異源植物或其他生物時(shí)，它賦予 除草劑耐受性（即，使植物或其它生物對除草劑耐受）。
[0045] 對草甘膦抗性或耐受性植物施用草甘膦，植物可能會(huì)顯示受到施用的某些微小的 影響。例如，植物的正常生長和發(fā)育可能會(huì)發(fā)生改變，其中植物可會(huì)顯示與脅迫或疾病相關(guān) 的征象或癥狀。對草甘膦抗性或耐受性植物施用草甘膦造成的這種微小影響，與對草甘膦 敏感植物施用草甘膦造成的有害影響形成對照。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以區(qū)分出草甘膦抗性植 物和草甘膦敏感植物之間的差異。對含有賦予草甘膦耐受性的核酸的植物施用草甘膦造成 的影響顯著小于對不含賦予草甘膦耐受性的核酸分子的相同物種植物施用相同量的草甘 膦。
[0046] 耐受除草劑或其它化學(xué)品的植物比合適的對照植物顯示更好的耐受性。除草劑或 其它化學(xué)品處理所造成的損害可以通過評估植物生長或良好生存狀態(tài)的任何參數(shù)進(jìn)行評 價(jià)。這些參數(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員自由裁量。植物 損害可以通過對植物個(gè)體或植物群的一個(gè)或多個(gè)合適的植物生長或良好生存狀態(tài)參數(shù)進(jìn) 行目測檢查和/或統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行評價(jià)。因此，可以通過評估包括例如但不限于下列的參數(shù) 來評價(jià)損害：植株尚度；植株重量；葉色；葉長；開花；育性；抽須（silking);產(chǎn)量；和種子 產(chǎn)生。還可以通過評估到特定發(fā)育階段（例如抽須、開花和花粉脫落）為止所經(jīng)過的時(shí)間， 或者到植物從特定化學(xué)品和/或除草劑處理恢復(fù)為止所經(jīng)過的時(shí)間來評價(jià)損害。
[0047] 在進(jìn)行損害評價(jià)時(shí)，可以給特定的損害程度賦值，以便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析或定量比 較。使用值的范圍描述特定程度的損害是本領(lǐng)域已知的，并且可以使用任何合適的范圍或 量表。例如，可以指配除草劑損傷得分（也稱作耐受性得分）。相應(yīng)地，如果在該量表中其 他級別處，合適的對照植物（或?qū)φ罩参锶海╉憫?yīng)于除草劑處理顯示的得分統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著 地低于主題群，則除草劑耐受性也可以用該量表中的其它級別表示。
[0048] 由除草劑或其它化學(xué)品導(dǎo)致的損害可以在用除草劑處理植物之后不同時(shí)間進(jìn)行 評估。很多時(shí)候，損害評價(jià)大約在對照植物表現(xiàn)出最大損傷時(shí)進(jìn)行。有時(shí)，待沒有用除草劑 或其它化學(xué)品處理的對照植物經(jīng)過一段時(shí)間，與給予處理之時(shí)的大小和發(fā)育階段相比已經(jīng) 發(fā)生了可測量的生長和/或發(fā)育之后，再評估損害。損害評估可以在任何合適的時(shí)間進(jìn)行， 合適的時(shí)間有許多，例如在用除草劑處理主題植物后12小時(shí)；1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11， 12,13,和/或14天；3和/或4周；或者更長的時(shí)間。任何評估時(shí)間，只要容許檢測測試植 物與對照植物對處理的響應(yīng)差異，就是合適的。
[0049] 當(dāng)除草劑對植物無影響，當(dāng)除草劑對植物有一些影響但植物隨后從影響恢復(fù)，或 者當(dāng)除草劑對植物產(chǎn)生一些有害的影響但是有害的影響被抵消，例如被該特定的除草劑對 雜草的影響所抵消時(shí)，則除草劑對植物沒有"顯著影響"。因此，例如，如果植物與合適的對 照植物（例如相同物種的未被處理的植物）相比，至少一個(gè)可以指示植物健康和/或生產(chǎn) 力的合適參數(shù)顯示的降低小于約25 %，小于約20 %，小于約15 %，小于約10 %以下，大于約 9%，小于約8%，少于約7%，少于約6%，小于約5%，小于約4%，少于約3%，小于約2%， 或小于約1%，則作物可能不被除草劑或其它處理"顯著影響"。在特定的實(shí)施方案中，如 果植物與合適的對照植物相比，其顯示的損害相比于對照植物所顯示的損害低至少40%， 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % , 75 %, 80 %, 90 %, 100 % ,150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 400 %，500 %，600 %，700 %，800 %，900 %，或1000 %或者更多，則該植物對除草劑或其它化 學(xué)品耐受。不被除草劑或其它處理顯著影響的作物可以在至少一個(gè)參數(shù)上顯示降低，但是 該降低在性質(zhì)上是暫時(shí)的，并且植物在例如約1周，約2周，約3周，約4周或約6周內(nèi)完全 恢復(fù)。在特定的實(shí)施方案中，耐受除草劑或其它化學(xué)品的植物可以有這樣的特征：即該植物 不被該除草劑或其它化學(xué)品的施用所顯著影響。
[0050] 可指示植物健康和/或生產(chǎn)力的合適參數(shù)包括，例如但不限于：植物高度；植株重 量；葉長；到特定發(fā)育階段為止所經(jīng)過的時(shí)間；開花；產(chǎn)量；和種子產(chǎn)生。參數(shù)評估可以通過 目視檢查和/或通過對參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來實(shí)施。當(dāng)對主題植物和對照植物進(jìn)行評價(jià)時(shí)， 可以進(jìn)行比較以確定主題植物是否被除草劑或其它化學(xué)品顯著影響。
[0051] 可用于確定對除草劑（或其它化學(xué)品）耐受性的合適對照植物包括屬于相同物種 但不含有推定的異源除草劑耐受性核酸和/或多肽的植物，和確實(shí)含有推定的異源除草劑 耐受性核酸和/或多肽但沒有用除草劑處理過的植物。
[0052] 除草劑："除草劑"是可以對植物造成暫時(shí)或永久損傷的化學(xué)品。本文其它地方更 詳細(xì)地列出并論述了除草劑的非限制性實(shí)例。除草劑可以被納入到植物或其細(xì)胞內(nèi)，或者 它可以在不被納入的條件下對植物或細(xì)胞發(fā)揮作用。"活性成分"是除草劑制劑中負(fù)責(zé)該制 劑的植物毒性的化學(xué)物質(zhì)。商業(yè)除草劑制劑中的活性成分通常在產(chǎn)品標(biāo)簽上被標(biāo)識為活性 成分。產(chǎn)品標(biāo)簽信息可以從美國環(huán)境保護(hù)局獲取，并在oaspub. epa. gov/pestlabl/ppls. own上有在線更新。產(chǎn)品標(biāo)簽信息還可以在www. cdms. net上在線獲取。
[0053] 當(dāng)關(guān)于除草劑使用時(shí)，術(shù)語"酸當(dāng)量"是指以除草活性母體酸計(jì)的比例或量。
[0054] 分離的："分離的"生物組分（例如，核酸或多肽）已經(jīng)與該組分天然存在的生物 細(xì)胞中的其它生物組分（即，其它染色體或染色體外DNA和RNA，和蛋白）實(shí)質(zhì)上分離、與 之分別產(chǎn)生、或從之純化出來，在分離、產(chǎn)生和純化的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了該組分的化學(xué)或功能變化 (例如核酸可以通過斷裂連接該核酸與染色體中其余DNA的化學(xué)鍵而從染色體分離）。已 經(jīng)"分離的"核酸分子和蛋白包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白。該術(shù)語還包括 通過在宿主細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)制備的核酸分子和蛋白，以及化學(xué)合成的核酸分子、蛋白和肽。
[0055] 核酸：術(shù)語"多核苷酸"、"核酸"和"核酸分子"在本文中可以互換使用，并包括單 個(gè)核酸、多個(gè)核酸、核酸片段、變體或其衍生物、和核酸構(gòu)建體（例如信使RNA(mRNA)和質(zhì)粒 DNA (pDNA))。多核苷酸或核酸可以含有全長cDNA序列、或其片段的核苷酸序列，包括非翻 譯的5'和/或3'序列和編碼序列。多核苷酸或核酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脫 氧核糖核苷酸構(gòu)成，其可以包括未修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或修飾的核糖核苷 酸或脫氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以包括單鏈、雙鏈DNA ;單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混 合物DNA ;單鏈和雙鏈RNA ;單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混合物RNA。包含DNA和RNA的雜交分子可以 是單、雙鏈、或單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物。前述術(shù)語還包括化學(xué)、酶學(xué)和代謝修飾形式的多 核苷酸或核酸。
[0056] 應(yīng)當(dāng)理解，具體的DNA還指其互補(bǔ)物，其序列根據(jù)脫氧核糖核苷酸堿基配對的規(guī) 則確定。
[0057] 如本文所使用的，術(shù)語"基因"是指編碼功能產(chǎn)物（RNA或多肽/蛋白）的核酸。基 因可以包含位于編碼功能產(chǎn)物的序列之前（5'非編碼序列）和/或之后（3'非編碼序列） 的調(diào)節(jié)序列。
[0058] 如本文所使用的，術(shù)語"編碼序列"是指編碼特定氨基酸序列的核酸序列。"調(diào)節(jié) 序列"是指位于編碼序列上游（例如，5'非編碼序列）、內(nèi)部或下游（例如，3'非編碼序列） 的核苷酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)節(jié)序列包括，例 如但不限于：啟動(dòng)子；翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；多腺苷酸化識別序列；RNA加工位點(diǎn)；效應(yīng)物 結(jié)合位點(diǎn)；和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0059] 如本文所使用的，術(shù)語"密碼子簡并性"是指遺傳密碼的冗余性，其允許特定核苷 酸序列發(fā)生變異但不會(huì)影響所編碼多肽的氨基酸序列。因?yàn)槊總€(gè)密碼子由3個(gè)核苷酸構(gòu) 成，并且構(gòu)成DNA的核苷酸被限制于4種特定的堿基，所以有64種可能的核苷酸組合，其中 61種編碼氨基酸（其余3個(gè)密碼子編碼終止翻譯信號）。結(jié)果，許多氨基酸被多于一種密 碼子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由4種三聯(lián)體編碼，絲氨酸和精氨酸由6種三聯(lián)體 編碼，而色氨酸和甲硫氨酸只有1種三聯(lián)體編碼。顯示哪些密碼子編碼哪些氨基酸的"遺傳 密碼"是本領(lǐng)域公知的。其中的簡并性允許DNA堿基在一個(gè)寬廣的范圍內(nèi)變化，而不會(huì)影響 由該DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0060] 在本文的一些實(shí)施方案中，當(dāng)設(shè)計(jì)密碼子序列用于在宿主細(xì)胞內(nèi)獲得改良的表達(dá) 時(shí)，設(shè)計(jì)基因使其中的密碼子使用頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子利用的頻率。因此，術(shù)語 "密碼子優(yōu)化的"是指用于轉(zhuǎn)化各種宿主的基因和核酸編碼序列，其中該基因或編碼序列的 密碼子已被改變，以反映宿主生物的典型密碼子利用率，但不改變由該核酸編碼的多肽。在 實(shí)例中，這種優(yōu)化包括用生物基因中更頻繁使用的一個(gè)或多個(gè)密碼子代替該基因或編碼序 列中的至少一個(gè)、超過1個(gè)、顯著數(shù)量的、和/或全部的密碼子。
[0061] 許多生物顯示偏好使用特定的密碼子來編碼伸長肽鏈中的特定氨基酸插入物。密 碼子優(yōu)先性或密碼子偏好性（在生物之間密碼子利用率的差異）是由遺傳密碼的簡并性提 供的，并且在許多生物中有大量證據(jù)證明。密碼子偏好性經(jīng)常與信使RNA(mRNA)的翻譯效 率相關(guān)，而該翻譯效率則被認(rèn)為依賴于（但不僅僅依賴于）接受翻譯的密碼子的性質(zhì)和特 定的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)分子的可得性。細(xì)胞內(nèi)選定的tRNA的優(yōu)勢一般反映了最頻繁用于肽 合成的密碼子。因此，可以根據(jù)密碼子優(yōu)化對基因進(jìn)行裁量或設(shè)計(jì)，以便在給定生物內(nèi)實(shí)現(xiàn) 最佳的基因表達(dá)。
[0062] 由于有多種多樣的動(dòng)物、植物和微生物物種的大量的基因序列可用，所以有可能 計(jì)算密碼子利用率的相對頻率。密碼子利用率表可以容易地獲得，例如在互聯(lián)網(wǎng)kazusa. or. jp/codon/上可訪問的"Codon Usage Database"中，并且這些表可以通過不同的方式調(diào) 整適用。見Nakamura et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28:292。利用密碼子利用率表，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能夠?qū)⑾鄳?yīng)于給定物種的頻率應(yīng)用于任何給定多肽序列，來設(shè)計(jì)和產(chǎn)生密碼子 優(yōu)化的編碼區(qū)的人造核酸片段，該編碼區(qū)編碼該多肽，但是使用對該物種而言最優(yōu)的密碼 子。
[0063] 密碼子偏好在蛋白編碼區(qū)的平均堿基組成上有反映。例如，基因組中G+C含量相 對較低的生物使用更多在同義密碼子第三位中具有A或T的密碼子，而G+C含量較高的生 物則使用更多在第三位是G或C的密碼子。此外，人們認(rèn)為在mRNA中存在的"稀有"密碼 子可能會(huì)降低該mRNA的絕對翻譯速度，特別是當(dāng)相應(yīng)于該稀有密碼子的負(fù)載tRNA的相對 豐度較低時(shí)。這個(gè)推理的一個(gè)推論是，對于多個(gè)稀有密碼子而言，單個(gè)稀有密碼子對翻譯速 度的減少可能至少是疊加性的。因此，具有高相對含量的稀有密碼子的mRNA的翻譯速度會(huì) 相應(yīng)降低。該速度可能反映在所編碼蛋白相對低水平上。
[0064] 密碼子偏好可以作為單個(gè)密碼子相對于所有氨基酸密碼子的相對使用頻率來計(jì) 算。或者，密碼子偏好可以作為用于編碼特定氨基酸的單個(gè)密碼子相對于該氨基酸的所有 其它密碼子（同義密碼子）的相對使用頻率來加以計(jì)算。
[0065] 術(shù)語"百分比同一性"（或" ％同一性"）是指兩個(gè)或多個(gè)多肽序列（或多核苷酸序 列）通過序列比較確定的相互關(guān)系。百分比同一性可以表示多肽（或多核苷酸）序列之間 序列相關(guān)性的程度，并可以通過這些序列的串之間的匹配加以確定。一般而言，同一性分別 是指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的精確核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸一致性。兩個(gè)序列， 無論是核酸還是氨基酸序列，的百分比同一性是兩個(gè)對齊的序列之間精確匹配的數(shù)目除以 較短序列的長度，再乘以 100。見 Russell and Barton(1994)J.Mol.Biol.244:33250。
[0066] 用于比對核酸和氨基酸序列并確定同一性的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括例如 但不限于，在下列文獻(xiàn)中提供的 Computational Molecular Biology (1988) (Lesk, A. Μ. , Ed.) Oxford University, NY ：Biocomputing:Informatics and Genome Projects (1993) (Smith, D. ff. , Ed. ) Academic, NY ：Computer Analysis of Sequence Data,Part I(1994) (Griffin, A. M.，and Griffin, H. G.，編輯）Humania, NJ ：Seguence Analysis in Molecular Biology(1987)(von Heinje，G.，Ed. ) Academic, NY ;和 Sequence Analysis Primer(1991) (Gribskov, M. and Devereux, J.，Eds.) Stockton, NY。用于確定兩個(gè)序列之間百分比同一性 的技術(shù)可包括提供mRNA或基因的核苷酸序列和/或提供或推斷由其編碼的氨基酸序列，和 將該序列與第二個(gè)核苷酸和/或氨基酸序列進(jìn)行比較。基因組序列也可以按照這種方式加 以確定和比較。
[0067] 此外，用于比對核酸和氨基酸序列和確定同一性的方法納入在各種公眾可得 的計(jì)算機(jī)軟件程序中。序列比對和百分比同一性計(jì)算可以使用，例如，如下程序?qū)嵤?Vector NTIu 軟件包的 AlignX?程序（Invitrogen, Carlsbad, CA)或 LASERGENE ?生物 信息學(xué)計(jì)算軟件包的MegAlign?程序（DNASTAR? Inc.，Madison，WI)。序列的多重比對 可以用Clustal?方法實(shí)施，其包括多種比對算法版本，包括Clustal TM V和Clustal? ff(Higgins and Sharp(1989)〇 CABIOS 5:1513 ；Higgins et al. (1992)Comput. Appl. Biosci. 8:18991)。對于Clustal? V中的多重比對，可使用的默認(rèn)值包括空位罰分=10和 空位長度罰分=10。Clustal? W中多重比對的默認(rèn)參數(shù)包括（空位罰分=10,空位長度罰 分=〇· 2,延遲發(fā)散序列（Delay Divergen Seqs) (%) =30, DNA轉(zhuǎn)換權(quán)重（DNA Transition Weight) =0.5、蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣（Protein Weight Matrix) =Gonnet 系列、DNA 權(quán)重矩陣 (DNA Weight Matrix) = IUB)。可以在Clustal?方法中使用的用于在蛋白序列之間進(jìn)行 逐對比對和百分比同一性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)是：KTUPLE = 1、空位罰分=3、窗口（WINDOW)= 5和DIAGONALS SAVED = 5。對于核酸，這些默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE = 2,空位罰分=5,窗口 = 4和DIAGONALS SAVED = 4。在用Clustal?程序進(jìn)行序列比對后，有可能通過觀察相同程 序中的"序列距離"（sequence distances)表來獲得"百分比同一性"。
[0068] 在一些實(shí)施方案中，核酸編碼如下的多肽，該多肽（當(dāng)與參考多肽比較時(shí)， 例如DGT多肽）具有例如但不限于：至少大約55 % ;至少大約60 % ;至少大約65 % ; 至少大約70 % ;至少大約75 % ;至少大約80 % ;至少大約85 % ;至少大約90 % ;和 至少大約95%的同一性，具有與參考多肽相同或相似的功能。因此，在本文中可以 使用從例如55 %至100 %同一性的任何整數(shù)百分比描述特定的核酸，例如但不限于： 55% , 56% , 57% , 58% , 59% , 60% , 61% , 62% , 63% , 64% , 65% , 66% , 67% , 68% , 69% , 70 %,71%, 72%,73%, 74%, 75%,76%, 77%,78%, 79%,80%,81%,S2%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89 %，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，和 99%。某些核酸片段不僅具 有前述的序列同一性，而且可以編碼如下的多肽，該多肽具有，例如但不限于：至少50個(gè)氨 基酸；至少100個(gè)氨基酸；至少150個(gè)氨基酸；至少200個(gè)氨基酸；和至少250個(gè)氨基酸。特 定的實(shí)施方案包括與SEQ ID NO: 1具有至少大約90%同一性的核酸（例如，至少89%同一 性；至少大約90%同一1性；至少大約91 %同一1性；至少大約92%同一1性；至少大約93%同 一,性；至少大約94%同一^性；至少大約95%同一^性；至少大約96%同一^性；至少大約97% 同一^性；至少大約98%同一 1性；至少大約99%同一1性；和至少大約99. 5%同一1性）。
[0069] 術(shù)語"序列分析軟件"是指一種計(jì)算機(jī)算法或軟件程序，其可用于分析核苷酸或氨 基酸序列。"序列分析軟件"可以商業(yè)獲得或獨(dú)立開發(fā)。序列分析軟件的非限制性實(shí)例包 括：GCG 程序軟件包（Wisconsin Package Version 9.0，Genetics ComputerGroup (GCG)， Madison，WI);BLASTP?，BLASTN?，*BLASTXTM(Altschuletal.(1990)J.Mol. Biol.215:403-10) ；DNASTAR?(DNASTAR?,Inc. Madison, WI) ；Sequencher?(Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI);和整合了 Smith Waterman 算法的 FASTA?程 序(Pearson(1994)Comput. Methods Genome Res.「Proc. Int. Symp. I, Meeting Date 1992(Suhai and Sandor,編輯），Plenum:New York, NY, pp. 111-20)。在本文中使用序列分 析軟件分析核苷酸或氨基酸序列時(shí)，除非另外指明，否則所顯示的分析結(jié)果是使用所參考 程序的默認(rèn)值產(chǎn)生的。如本文所使用的，術(shù)語"默認(rèn)值"是指在首次初始化軟件時(shí)，序列分 析軟件最初加載的一系列值或參數(shù)。
[0070] 雜交：包含全部或部分核苷酸序列的核酸可以用作探針，與克隆的基因組DNA片 段或cDNA片段（例如，來自所選生物的基因組或cDNA文庫）群體中存在的、與探針序列具 有顯著量的序列同一性的核苷酸序列選擇性"雜交"。雜交探針可以是基因組DNA片段、質(zhì) 粒DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR擴(kuò)增的DNA片段、寡核苷酸、或其他多聚核苷酸，并 且探針可以用可檢測的基團(tuán)（例如 32P)或任何其他可檢測的標(biāo)記標(biāo)記。因此，例如但不限 于，用于雜交的探針可以通過標(biāo)記可特異性雜交本文中的核酸（例如與SEQ ID N0:1具有 至少大約90%同一性的核酸）的人造寡核苷酸加以制備。用于制備雜交探針和用于構(gòu)建 cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域已知的。Sambrook等人.(1989)Molecular CloningiA Laboratory Manual.Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY。關(guān)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可以參見Sambrook等人（1989)，同上；和 Ausubel 等人(1997) Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, Wiley, NY, New York,pp.2-40〇
[0071] 在一些實(shí)施方案中，核酸雜交（例如，對擴(kuò)增的DNA的雜交）可用于鑒定樣品中轉(zhuǎn) 基因事件的存在。核酸分子或其片段能夠在某些條件下與另一個(gè)核酸分子"特異性雜交"。 在一些實(shí)例中，核酸在嚴(yán)格的條件下與靶核酸特異性雜交。如本文所使用的，如果兩個(gè)核酸 分子能夠在嚴(yán)格（例如高嚴(yán)格度）條件下形成反平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則稱這兩個(gè)核酸分子 能夠彼此特異性雜交。
[0072] 如果一個(gè)核酸分子與另一個(gè)核酸分子顯不完全的序列互補(bǔ)性，則稱這兩個(gè)核酸分 子"互補(bǔ)"。如本文所使用的，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則 說核酸顯示"完全互補(bǔ)性"。顯示完全互補(bǔ)性的分子一般可以彼此雜交，并具有足夠的穩(wěn)定 性，從而允許它們在常規(guī)的"高嚴(yán)格度"條件下仍保持彼此退火。常規(guī)的高嚴(yán)格條件如上文 Sambrook 等人（1989)所述。
[0073] 如果兩個(gè)分子彼此雜交，并具有足夠的穩(wěn)定性，從而允許它們至少在常規(guī)的"低 嚴(yán)格度"條件下仍保持彼此退火，則稱它們顯示"最小互補(bǔ)性"。常規(guī)的低嚴(yán)格條件如上文 Sambrook等人（1989)所述。核酸分子要用作引物或探針，僅需要顯示能夠在所采用的特定 溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)的最小的序列互補(bǔ)性即可。
[0074] 影響雜交嚴(yán)格度的因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括例如：溫度；pH ;離子 強(qiáng)度；和有機(jī)溶劑（例如甲酰胺和二甲基亞砜）的濃度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，雜交嚴(yán) 格度隨著溫度升高、離子強(qiáng)度降低、和溶劑濃度降低而增加。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn) 定劑例如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)。
[0075] 術(shù)語"嚴(yán)格條件"或"嚴(yán)格度條件"是考慮一個(gè)核酸與另一個(gè)靶核酸（即，與包含感 興趣的特定核苷酸序列的核酸分子）根據(jù)Sambrook等人（1989)，同上（在9. 52-9. 55)中討 論的具體雜交程序的雜交而定義的。另見Sambrook等人（1989)-9. 47-9. 52和9. 56-9. 58。
[0076] 在許多應(yīng)用中，特異性與雜交后洗滌條件有關(guān)，其中因素包括洗滌溶液的離子強(qiáng) 度和溫度。對于DNA-DNA雜交，熔點(diǎn)溫度（T m)可以近似地用如下的公式計(jì)算：
[0077] Im= 81. 5°C+16. 6(logM)+0. 41(% GC)-〇. 61(% 甲）-500/L， (I)
[0078] 其中M是單價(jià)陽離子的摩爾數(shù)，％ GC是DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分 比，％甲是雜交溶液中甲酰胺的百分比，L是堿基對的雜交長度。Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-84。
[0079] Tm是這樣的溫度（在特定的離子強(qiáng)度和pH下）：在此溫度，50%的互補(bǔ)靶序列與 完美匹配的探針雜交。每有1%的錯(cuò)配，T m下降大約1°C。因此，可以調(diào)整！^、雜交、和/或 洗滌條件，以便讓具有期望的同一性的序列雜交。例如，如果尋找有90%同一性的雜交序 列，則可以將T m降低KTC (在特定的離子強(qiáng)度和pH下）。例如，嚴(yán)格條件可以選擇比具體 序列與其互補(bǔ)物在特定離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)（Tm)低大約5°C的溫度。然而，極嚴(yán)格條 件可以在比TJS 1、2、3或4°C的溫度下進(jìn)行雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以使用比T m 低6、7、8、9或10°C的溫度進(jìn)行雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以使用比Tm低11-20°C的溫 度進(jìn)行雜交和/或洗滌。
[0080] 在一些實(shí)例中，嚴(yán)格條件是如下的條件，其中鹽濃度小于大約I. 5M Na+(例如大 約0· Ol-L OM Na+)，pH 7. 0-8. 3,溫度為短核苷酸（例如長度為10-50個(gè)核苷酸）至少大 約30°C和長探針（例如長度大于50個(gè)核苷酸）至少大約60°C。低嚴(yán)格條件的實(shí)例包括在 37°C的30-35%甲酰胺緩沖液、LOM NaCl、0. 1%十二烷基硫酸鈉（SDS)中雜交，在50-55°C 的1X-2X SSC(20X SSC = 3. OMNaCl/O. 3M檸檬酸三鈉）中洗滌。中嚴(yán)格條件的實(shí)例包括在 37°〇的40-45%甲酰胺、1.011恥(：1、0.1%503中雜交，在55-60°〇的0.5父-1父35(：中洗滌。 高嚴(yán)格條件的實(shí)例包括在37°C的大約50%甲酰胺、大約I. OM鈉鹽、大約0. 1 % SDS中雜交， 在約60-65°C的約0. IX SSC中洗滌。
[0081] 如本文所使用的，術(shù)語"多肽"包括單個(gè)多肽、多個(gè)多肽、和其片段。該術(shù)語是指由 通過酰胺鍵（也稱作肽鍵）線性連接的單體（氨基酸）構(gòu)成的分子。術(shù)語"多肽"是指兩個(gè) 或多個(gè)氨基酸構(gòu)成的任何鏈，且不指示產(chǎn)物的具體長度和大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、 蛋白質(zhì)、氨基酸鏈、和任何其它用于指示有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的鏈的術(shù)語均包含在"多肽" 的定義之內(nèi)，并且前述術(shù)語在本文中可以和"多肽"互換使用。多肽可以是從天然生物源分 離的或者通過重組技術(shù)產(chǎn)生的，但是具體的多肽不一定是從特定的核酸翻譯產(chǎn)生的。多肽 可以用任何合適的方式產(chǎn)生，包括例如但不限于，通過化學(xué)合成。
[0082] 內(nèi)源的和異源的：如本文所使用的，術(shù)語"天然的"是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的、并與其 自身的調(diào)節(jié)序列（如果存在的話）在一起的多核苷酸、基因或多肽形式。術(shù)語"內(nèi)源的"是 指處于生物或生物基因組中的天然位置處的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。
[0083] 相反，術(shù)語"異源的"是指在參考（宿主）生物的位置處通常不會(huì)發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、 基因或多肽。例如，異源核酸可以是通常在參考生物的不同基因組位置處被發(fā)現(xiàn)的核酸。作 為進(jìn)一步的實(shí)例，異源核酸可以是通常不會(huì)在參考生物中被發(fā)現(xiàn)的核酸。含有異源多核苷 酸、基因或多肽的宿主生物可以通過將異源多核苷酸、基因或多肽導(dǎo)入到宿主生物內(nèi)而產(chǎn) 生。在特定的實(shí)例中，異源多核苷酸包括以不同于相應(yīng)的天然多核苷酸的形式被重新導(dǎo)入 到來源生物內(nèi)的天然編碼序列、或其部分。在特定的實(shí)例中，異源基因包括以不同于相應(yīng)的 天然基因的形式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然編碼序列或其部分。例如，異源基因可以 包括天然編碼序列，該天然編碼序列是含有非天然調(diào)節(jié)區(qū)的嵌合基因的一部分，該嵌合基 因被重新導(dǎo)入到天然宿主內(nèi)。在特定的實(shí)例中，異源多肽是以不同于相應(yīng)的天然多肽的形 式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然多肽。
[0084] 異源基因或多肽可以是這樣的基因或多肽，其包含功能性多肽或編碼功能性多肽 的核酸序列，該功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列與其它基因或多肽融合從而產(chǎn)生 嵌合或融合的多肽或編碼它的基因。基因和蛋白的特定實(shí)施方案包括具體例舉的全長序列 和部分、區(qū)段、片段（包括與全長分子相比具有內(nèi)部和/或末端缺失的連續(xù)片段）、變體、突 變體、嵌合體、以及這些序列的融合。
[0085] 修飾：如本文所使用的，術(shù)語"修飾"可以指特定參考多核苷酸內(nèi)的改變，其導(dǎo)致 由該參考多核苷酸編碼的多肽的活性降低、基本上消失、或消失。修飾還指參考多肽中的 改變，其導(dǎo)致參考多肽的活性減低、基本上消失、或消失?；蛘?，術(shù)語"修飾"可以指參考多 核苷酸中的改變，其導(dǎo)致該參考多核苷酸編碼的多肽的活性增加或提高，以及參考多肽中 的改變，其導(dǎo)致參考多肽的活性增加或提高。諸如前述的改變可以通過任何本領(lǐng)域眾所周 知的方法實(shí)現(xiàn)，這樣的方法有若干種，包括，例如但不限于：缺失參考分子的一部分；突變 參考分子（例如通過自發(fā)誘變；通過隨機(jī)誘變；通過增變基因?qū)е碌恼T變；和通過轉(zhuǎn)座子誘 變）；取代參考分子的一部分；在參考分子內(nèi)插入元件；下調(diào)參考分子的表達(dá)；改變參考分 子的細(xì)胞定位；改變參考分子的狀態(tài)（例如通過參考多核苷酸的甲基化，和通過參考多肽 的磷酸化或泛素化）；除去參考分子的輔助因子；導(dǎo)入靶向參考分子的反義RNA/DNA ;導(dǎo)入 靶向參考分子的干擾RNA/DNA ;參考分子的化學(xué)修飾；參考分子的共價(jià)修飾；用UV輻射或 X射線輻照參考分子；改變參考分子的同源重組；改變參考分子的有絲分裂重組；代替參考 分子的啟動(dòng)子；和/或前述的任意組合。
[0086] 可以通過比較參考多核苷酸或多肽的序列與同源（例如同源酵母或細(xì)菌）多核苷 酸或多肽的序列，并使高度同源區(qū)（保守區(qū)）或共有序列中的修飾數(shù)目最大化，來找到確定 在具體實(shí)例中哪些核苷酸或氨基酸殘基可以被修飾的指引。
[0087] 衍生物和變體：如本文所使用的，術(shù)語"衍生物"是指本文示例序列的修飾物。這 些修飾包括本文中的編碼序列中的一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、插入、和/或缺失，這些修飾可 保留、略微改變、或增加該編碼序列在作物物種中的功能。這些衍生物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人 員容易地確定，例如但不限于，通過使用用于預(yù)測和優(yōu)化序列結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)建模技術(shù)來確 定。因此，術(shù)語"衍生物"也包括這樣的異源核酸，它們包含與本文中的示例序列具有相當(dāng) 大的序列同一性的序列，從而使它們可具有相同、略微改變、或增加的用于在作物植物中表 達(dá)DGT-28的功能性。
[0088] 如本文所使用的，術(shù)語"變體"是指這樣的多肽，其由于氨基酸的插入、缺失、突變、 和/或取代而與本文的示例多肽有差異，插入、缺失、突變、和/或取代可以使用，例如但不 限于，重組DNA技術(shù)加以導(dǎo)入。關(guān)于確定參考氨基酸序列中的哪些氨基酸殘基可以取代、添 加或缺失的指引，可以通過比較特定參考多肽的序列與同源多肽的序列，并使高度同源區(qū) (保守區(qū)）中被改變的氨基酸序列數(shù)目最小化，或通過用共有序列代替這些氨基酸來找到。 變體多肽可以具有被取代的氨基酸，但同時(shí)仍保留參照多肽的功能活性。"變體"基因包括 編碼與參考基因相同的多肽，或者與參考多肽具有等價(jià)或相似活性的等價(jià)多肽的核苷酸序 列。
[0089] 在一些實(shí)施方案中，變體基因可用于產(chǎn)生變體蛋白，并且重組宿主可用于產(chǎn)生變 體蛋白。例如，可以構(gòu)建成含有任何本文例證序列的連續(xù)殘基（氨基酸或核苷酸）的變 體基因和蛋白。變體基因或蛋白可以具有，例如但不限于：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、 168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、 187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、 206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、 244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、 263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、 282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、和293個(gè)連續(xù)殘基（氨基酸或核苷酸）， 其相應(yīng)于示例序列中的一個(gè)（相同大小的）區(qū)段。類似大小的區(qū)段，特別是保守區(qū)的區(qū)段， 也可用作探針和/或引物。
[0090] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，許多水平的序列同一性均可用于鑒定與參考多肽具 有相同或相似功能或活性的多肽（例如，來自其它物種）。在一些實(shí)施方案中，具有例如，但 不限于：至少大約55% ;至少大約60% ;至少大約65% ;至少大約70% ;至少大約75% ;至 少大約80% ;至少大約85% ;至少大約90% ;和至少大約95%序列同一性（與參考多肽， 例如DGT 28多肽相比）的變體多肽具有與參考多肽相同或相似的功能。
[0091] 可以通過獲取并檢查感興趣蛋白的結(jié)構(gòu)（例如，從晶體結(jié)構(gòu)和/或分子模型獲得 原子3-D (三維）坐標(biāo)），來確定包含特定分子的連續(xù)殘基的變體基因和蛋白的設(shè)計(jì)和構(gòu)建 策略。在一些實(shí)例中，策略可以指向蛋白質(zhì)中對于修飾而言理想的某些區(qū)段，例如表面暴露 的區(qū)段，而不是涉及蛋白質(zhì)折疊和至關(guān)重要的3-D結(jié)構(gòu)完整性的內(nèi)部區(qū)段。例如，美國專利 No. 5, 605, 793涉及通過在隨機(jī)或聚焦（focused)斷裂之后利用DNA再裝配來生成額外的 分子多樣性的方法。這可以稱作基因"改組（shuffling)"，其通常包括混合兩種或多種不 同DNA分子的（期望大小的）片段，然后進(jìn)行重復(fù)多輪復(fù)性。這種處理可以改進(jìn)由主題基 因編碼的蛋白質(zhì)的活性。結(jié)果可能是一種嵌合蛋白質(zhì)，其具有改進(jìn)的活性、改變的底物特異 性、增加的酶穩(wěn)定性、改變的立體特異性（stereospecificity)、或其他特征。
[0092] 氨基酸"取代"可以是用另一個(gè)具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸代替參考 序列中的一個(gè)氨基酸（即，保守的氨基酸取代），或者可用一個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性 質(zhì)的氨基酸代替參考序列中的一個(gè)氨基酸（即，非保守的氨基酸取代）。氨基酸可以分成 如下的結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)類別：非極性、不帶電荷的極性、堿性、和酸性。相應(yīng)地，可以根據(jù)所 涉及的殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、或兩親性質(zhì)上的相似性進(jìn)行"保守"氨基 酸取代。例如，非極性（疏水）氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；不帶電荷的（中性）極性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半 胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷的（堿性）氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組 氨酸；帶負(fù)電荷的（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸?；蛘撸梢酝ㄟ^選擇這些氨基酸 中的任何種類在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、或兩親性質(zhì)上的差異性來進(jìn)行"非保 守"氨基酸取代。"插入"或"缺失"可以在重組蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)或功能上可以耐受的變化范圍 內(nèi)。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，變體蛋白質(zhì)相對于參考全長蛋白質(zhì)是"截短的"。在一些實(shí)例 中，截短的蛋白質(zhì)保留參考蛋白質(zhì)的功能活性。"截短的"蛋白質(zhì)意思是指蛋白質(zhì)的一部分 可以被例如切掉，而剩下的截短的蛋白質(zhì)在切割后仍保留并顯示期望的活性。切割可以用 任何蛋白質(zhì)酶實(shí)現(xiàn)，這樣的蛋白酶有很多種。此外，有效切割的蛋白質(zhì)可以用分子生物學(xué) 技術(shù)產(chǎn)生，其中通過限制性內(nèi)切核酸酶消化或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的其它技術(shù)，從 編碼序列中去除編碼蛋白質(zhì)的一部分的DNA堿基。截短的蛋白質(zhì)可以在異源系統(tǒng)中表達(dá)， 例如，大腸桿菌、桿狀病毒、基于植物的病毒系統(tǒng)和酵母。賦予除草劑耐受性的截短蛋白質(zhì) 可以通過使用異源系統(tǒng)在除草劑耐受性生物測定體系中表達(dá)蛋白質(zhì)來加以確認(rèn)，例如本文 中所述。本領(lǐng)域公知，可成功地產(chǎn)生截短蛋白質(zhì)，并使它們保留全長參考蛋白質(zhì)的功能活 性。例如，Bt蛋白質(zhì)可以以一種截短的（核心蛋白質(zhì)）形式使用。參見，例如，Hofte and Whiteley(1989)Microbiol. Rev. 53(2) :24255;和 Adang et al. (1985)Gene 36:289300。
[0094] 在一些情況下，特別是用于在植物中表達(dá)的情況下，使用表達(dá)截短蛋白質(zhì)的截短 基因可能是有利的。截短基因可以編碼由例如全長蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、或99%構(gòu)成的多肽。
[0095] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定保留作為其設(shè)計(jì)來源的參考序列的功能的變體基因和 蛋白質(zhì)，例如通過測定重組變體的活性加以確定。如果這種活性測定是已知的并且已經(jīng)被 表征，那么功能變體的確定僅需要常規(guī)的實(shí)驗(yàn)。
[0096] 可以對酶"活性位點(diǎn)"進(jìn)行特異性改變，以影響其在活性或立體結(jié)構(gòu)特異性方面的 固有功能性。參見 Muller et.al.(2006)Protein Sci. 15(6):135668。例如，已知的 tauD 結(jié)構(gòu)已被用作一種模式雙加氧酶，用來在與其固有底物?；撬峤Y(jié)合的情況下確定活性位 點(diǎn)殘基。參見 Elkins et al.(2002)Biochemistry41 (16) :518592。關(guān)于酶活性位點(diǎn)的序 列優(yōu)化和可設(shè)計(jì)性的信息可以參見Chakrabarti et al. (2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(34):1203540。
[0097] 可以改變蛋白質(zhì)的各種結(jié)構(gòu)性質(zhì)和三維結(jié)構(gòu)特征，而不對蛋白質(zhì)的活性/功能 性造成不良影響?？梢赃M(jìn)行不會(huì)對分子活性和/或三維構(gòu)象造成不良影響的保守氨基酸 取代（"耐受性（tolerated)"取代）。還可以設(shè)計(jì)與參考蛋白質(zhì)在序列水平上不同、但 保留相同或相似的總體關(guān)鍵三維結(jié)構(gòu)、表面電荷分布等的變體蛋白質(zhì)。參見例如美國專 利 7,058,515 ;Larson et al. (2002)Protein Sci. 11:280413 ;Crameri et al. (1997) Nat.Biotechnol. 15:4368 ；Stemmer(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1074751 ； Stemmer(1994)Nature 370:38991 ；Stemmer(1995)Bio/Technology 13:54953 ；Crameri et al. (1996)Nat. Med. 2:1003;和 Crameri et al. (1996)Nat. Biotechnol. 14:3159。
[0098] 對適合于在表達(dá)構(gòu)建體（例如，DGT-28表達(dá)構(gòu)建體）中使用的5'或3'UTR(例 如，人造發(fā)夾）也可以實(shí)施計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，這樣的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)可用于設(shè)計(jì)本文一些實(shí)施 方案的核酸內(nèi)的元件。用于預(yù)測/評估5'或3'UTR衍生物的計(jì)算機(jī)建模和UTR和 計(jì)算機(jī)建模技術(shù)包括，例如但不限于：MFoLd?3. 1版（可以從Genetics Corporation Group,Madison, WI 獲得；見 Zucker et al. "Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction:A Practical Guide," 錄自 RNA Biochemistry and Biotechnology,1143, T. Barciszewski&B. F. C. Clark 編輯,NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999 ；Zucker et al. (1999) J. Mol. Biol. 288:91140 ;Zucker et al. "RNA Secondary Structure Prediction," 錄 自 Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D.Glick，and R.A.Jones 編輯，John Wiley&Sons，New York，11.2.111.2.10,2000);和 C0VE?(使用協(xié)方差模型分析RNA結(jié)構(gòu)（隨機(jī)上下文無關(guān)文法方法（stochastic context free grammar methods)))v. 2. 4. 2(Eddy and Durbin(1994)Nucl. Acids Res. 22:207988), 其以源代碼免費(fèi)發(fā)布，并可以通過登錄網(wǎng)址genetics, wustl. edu/eddy/software/下載； 和FOLDALIGN?(見Gorodkin et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25(18) :372432和Gorodkin et al. (1997)Proceedings International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology ISMB International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology 5:120123)，其也是免費(fèi)發(fā)布的，并可以在網(wǎng)址 foldalign.ku.dk/ software/index. html 上下載。
[0099] 啟動(dòng)子：術(shù)語"啟動(dòng)子"指一種能夠控制核酸編碼序列或功能RNA的表達(dá)的DNA序 列。在實(shí)例中，受控制的編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3'?？梢詮奶烊换蛑姓w獲得啟動(dòng) 子，啟動(dòng)子可以包括來自天然出現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件，或者啟動(dòng)子甚至可以包括人 造的DNA片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，不同的啟動(dòng)子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類 型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán)境或生理?xiàng)l件表達(dá)。所有上述啟動(dòng)子的實(shí) 例都是已知的，并且在本領(lǐng)域中用于控制異源核酸的表達(dá)。指導(dǎo)基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中 在大部分時(shí)間里表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為"組成型啟動(dòng)子"。此外，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng) 嘗試界定調(diào)節(jié)序列的確切邊界（在許多情況下未成功），但是已經(jīng)認(rèn)識到，長度不同的DNA 片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。特定核酸的啟動(dòng)子活性可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行 測定。
[0100] 可操作連接：術(shù)語"可操作連接"是指單一核酸上的多個(gè)核酸序列的關(guān)聯(lián)，其中一 個(gè)核酸序列的功能受到另一個(gè)的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(shí)（例如， 編碼序列在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下），啟動(dòng)子與編碼序列就是可操作連接的。編碼序列可以 沿著有義和反義方向與調(diào)節(jié)序列可操作連接。
[0101] 表達(dá)：如本文所使用的，術(shù)語"表達(dá)"可以指衍生自DNA的有義（mRNA)或反義RNA 的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還指mRNA翻譯成多肽。如本文所使用的，術(shù)語"過表達(dá)"是指高 于相同基因或相關(guān)基因的內(nèi)源表達(dá)的表達(dá)。因此，如果異源基因的表達(dá)高于可比較的內(nèi)源 基因的表達(dá)，則該異源基因被"過表達(dá)"。
[0102] 轉(zhuǎn)化：如本文所使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指核酸或其片段被轉(zhuǎn)移并整合到宿主生物 內(nèi)，導(dǎo)致基因上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化核酸的宿主生物被稱作"轉(zhuǎn)基因"、"重組"或"轉(zhuǎn)化"生 物。已知的轉(zhuǎn)化方法包括，例如但不限于：根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)或 發(fā)根土壤桿菌（A. rhizogenes)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；磷酸媽轉(zhuǎn)化；聚凝胺轉(zhuǎn)化；原生質(zhì)體融合；電 穿孔；超聲波方法（例如，超聲波穿孔（sonoporation));脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化；顯微注射；用裸DNA 轉(zhuǎn)化；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化；用病毒載體轉(zhuǎn)化；基因槍轉(zhuǎn)化（微粒轟擊）；碳化硅WHISKERS (晶 須）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；氣溶膠射線轉(zhuǎn)化（aerosol-beaming);和PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
[0103] 導(dǎo)入：如本文所使用的，術(shù)語"導(dǎo)入"（在將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的上下文中）包括細(xì)胞 的轉(zhuǎn)化，以及包含核酸的植物與第二種植物的雜交，從而使第二種植物含有該核酸，這可以 用常規(guī)植物育種技術(shù)實(shí)施。這些育種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。關(guān)于植物育種技術(shù)的討論，見 Poehlman(1995)Breeding Field Crops,第 4 版，AVI Publication Co.，Westport CT〇
[0104] 回交方法可用于將核酸導(dǎo)入植物。這種技術(shù)用于將性狀導(dǎo)入植物已有幾十年的歷 史。回交（以及其它的植物育種方法學(xué)）的描述實(shí)例可以參見，例如，P〇elman(1995)，同 上：和.Tensen (1988)Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NY。在一個(gè)不例性回 交方案中，將感興趣的原始植物（以下簡稱"輪回親本"）與攜帶要導(dǎo)入的核酸的第二個(gè)植 物（"非輪回親本"）雜交。然后，將此雜交產(chǎn)生的子代再次與輪回親本雜交，并重復(fù)該過程 直到獲得轉(zhuǎn)化植物，其中除了來自非輪回親本的核酸之外，轉(zhuǎn)化植物還復(fù)原了輪回親本的 幾乎全部的期望形態(tài)和生理特征。
[0105] 質(zhì)粒/載體：如本文所使用的，術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"是指一種染色體外元件，其 可攜帶一個(gè)或多個(gè)非細(xì)胞核心代謝部分的基因。質(zhì)粒和載體通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子。然 而，質(zhì)粒和載體可以是線性或環(huán)狀核酸，呈單鏈或雙鏈DNA或RNA，并可以衍生自任何來源， 其中若干核苷酸序列被連接或重組成一個(gè)獨(dú)特的構(gòu)建體，其能夠?qū)?dòng)子片段和編碼DNA 序列與任何合適的3'非翻譯區(qū)一起導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。在實(shí)例中，質(zhì)粒和載體可以包括自主復(fù) 制序列、基因組整合序列、和/或噬菌體或核苷酸序列。
[0106] III. DGT-28 和 DGT-28 編碼序列
[0107] 本文的一些實(shí)施方案提供了分離的多肽，其與SEQ ID NO: 1具有至少大約90%同 一性（例如89%，至少90%，至少91 %，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%， 至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%同一性）。這種多肽在本文被稱作DGT-28 多肽。本文的一些實(shí)施方案提供了編碼與SEQ ID NO: 1具有至少大約90%同一性的多肽的 核酸。這類核酸的特定實(shí)例在本文被稱作"dgt-28"核酸。在多種多樣的應(yīng)用中期望修飾 植物細(xì)胞中的草甘膦代謝（例如，導(dǎo)入草甘膦抗性），Dgt-28核酸可用于任何這樣的應(yīng)用。
[0108] 為舉例目的提供的Dgt-28核酸的特定實(shí)例是SEQ ID NOs:2和3。因此，一些實(shí)施 方案提供了包含如下核苷酸序列的核酸，其與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少大約 80%序列同一性（例如79%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，至少 85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%的，至少90%，至少91%，至少92%，至少 93 %，至少94 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，和至少99 %同一性）；其中該 核酸編碼與SEQ ID NO: 1具有至少大約90%同一性的多肽。Dgt-28核酸的特定實(shí)例包括 在嚴(yán)格（例如高嚴(yán)格）條件下與具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的核酸特異性雜交的核 酸。
[0109] 在一些實(shí)施方案中，提供了密碼子優(yōu)化的Dgt-28核酸。例如，為了在植物中獲得 異源基因的高表達(dá)，可能期望設(shè)計(jì)基因并對基因進(jìn)行重新工程化，從而使它在植物細(xì)胞內(nèi) 更高效地表達(dá)。在期望在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)細(xì)菌基因的場合，這個(gè)策略是特別可取的。
[0110] 因此，本文的一些實(shí)例提供了編碼DGT-28蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因，和設(shè)計(jì)它的方 法，用來產(chǎn)生能夠在雙子葉或單子葉植物中最優(yōu)表達(dá)的DNA序列，并且其中序列修飾不會(huì) 干擾翻譯或轉(zhuǎn)錄。對于以在單子葉和雙子葉植物中表達(dá)相同的DGT-28蛋白質(zhì)為目的的優(yōu) 化Dgt-28基因設(shè)計(jì)，在本文中用該優(yōu)化表達(dá)基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的再工程化進(jìn)行了示例。 本文中植物優(yōu)化的Dgt-28核酸的實(shí)例包括SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
[0111] 在對編碼用于在雙子葉植物或單子葉植物（例如，棉花、加拿大油菜、煙草、玉米、 大豆、小麥和水稻）中表達(dá)的DGT-28蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行工程化時(shí)，可以確定預(yù)期的宿主植 物的密碼子偏好，例如通過使用可公開獲得的DNA序列數(shù)據(jù)庫找到關(guān)于植物基因組或各種 植物基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)的密碼子分布信息來加以確定。
[0112] 在設(shè)計(jì)用于植物表達(dá)的核酸中的編碼區(qū)時(shí)，當(dāng)存在多種選擇時(shí)，應(yīng)當(dāng)確定植物優(yōu) 選的主要（"第一選擇"）密碼子，以及優(yōu)選密碼子的第二、第三、第四選項(xiàng)等。然后，可以設(shè) 計(jì)編碼相同肽（例如，DGT-28蛋白質(zhì)）的氨基酸序列的新DNA序列，但是新DNA序列與原始 DNA序列的區(qū)別在于用植物（第一優(yōu)選的、第二優(yōu)選的、第三優(yōu)選的、或第四優(yōu)選的，等等） 密碼子進(jìn)行了取代，以規(guī)定氨基酸序列中每個(gè)位置處的氨基酸。
[0113] 然后可以對新序列進(jìn)行分析，尋找可能由這些修飾產(chǎn)生的限制酶位點(diǎn)。對于鑒定 出的位點(diǎn)，可以進(jìn)一步通過用第一、第二、第三或第四選擇的優(yōu)選密碼子替換這些密碼子來 進(jìn)行修飾。序列中其他可能影響感興趣的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的位點(diǎn)是莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、外顯子： 內(nèi)含子接點(diǎn)（5'或3'）、多聚腺苷酸添加信號、和RNA聚合酶終止信號；這些位點(diǎn)可通過用 植物密碼子取代予以去除。可以對序列進(jìn)行進(jìn)一步的分析和修飾，以減少TA或CG雙聯(lián)體 (doublet)的頻率。除了雙聯(lián)體之外，具有超過大約6個(gè)相同殘基的G或C雙聯(lián)體序列區(qū) 塊（block)會(huì)影響序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯。因此，可以通過將密碼子的第一或第二選擇替換為 下一級優(yōu)選的密碼子等方式來對這些區(qū)塊進(jìn)行修飾。
[0114] SEQ ID N0:2 (Dgt-28 (v5))是針對雙子葉植物中的表達(dá)優(yōu)化的。SEQ ID NO: 3 (Dgt-28 (v6))是針對單子葉植物中的表達(dá)優(yōu)化的。這些人造序列中的密碼子利用率是 基于優(yōu)選的密碼子利用率而選擇的；即每一個(gè)的表達(dá)產(chǎn)物都是由具有單子葉或雙子葉植物 利用率偏好的密碼子編碼的，并且除去了有害的序列和多余的限制性位點(diǎn)，以增加 DGT-28 多肽的轉(zhuǎn)錄/翻譯效率且便于進(jìn)行DNA操作步驟。
[0115] 類似地，對SEQ ID NO: 4的核酸分子（Dgt-28 (vl))進(jìn)行了優(yōu)化，以提高在大腸桿 菌中的表達(dá)。SEQ ID N0:4中的密碼子利用率是根據(jù)大腸桿菌優(yōu)選的密碼子利用率而選擇 的；所表達(dá)的蛋白質(zhì)由具有大腸桿菌利用率偏好的密碼子所編碼。在重新設(shè)計(jì)過程中，除去 了有害的序列和多余的限制性位點(diǎn)，以增加 DGT-28編碼序列的轉(zhuǎn)錄/翻譯效率并便于進(jìn)行 DNA操作步驟。因此，在大腸桿菌中從包含SEQ ID NO:4的核酸表達(dá)DGT-28可導(dǎo)致強(qiáng)健的 蛋白質(zhì)表達(dá)，例如，用于DGT-28的酶學(xué)表征。
[0116] -旦在紙上或計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)出了優(yōu)化的（例如，植物優(yōu)化的）DNA序列，便可以在 實(shí)驗(yàn)室里人造出在序列上與設(shè)計(jì)的序列精確對應(yīng)的實(shí)際DNA分子?？梢詫@些人造的核酸 分子進(jìn)行克隆和進(jìn)行其他操作，完全如同它們來自自然或天然的來源一樣。
[0117] 本文中的核酸可以被克隆到載體中，用于轉(zhuǎn)化到原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和/ 或表達(dá)。載體可以是原核載體；例如，質(zhì)粒、或穿梭載體、昆蟲載體、或真核載體。本文的核 酸也可以被克隆到表達(dá)載體中，例如，用于施用到植物細(xì)胞中。在某些應(yīng)用中，可能優(yōu)選的 是具有在大腸桿菌中發(fā)揮功能的載體（例如，生產(chǎn)用于產(chǎn)生抗體的蛋白質(zhì)，DNA序列分析， 插入物構(gòu)建，獲得大量核酸）。
[0118] 為了在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)DGT-28蛋白質(zhì)，通常將編碼蛋白質(zhì)的核酸亞克隆到含有 指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的表達(dá)載體中。合適的細(xì)菌和真核啟動(dòng)子是本領(lǐng)域公知的，例如在 Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2 版 1989 ;第 3 版，2001 年）； Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al·，同上）中所述。本文中用于表達(dá)核 酸的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可以在，例如，大腸桿菌、芽孢桿菌屬和沙門氏菌屬中獲得（Palva et al. ,Gene 22:229235(1983))。用于這些表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒可以商購。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、 酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且也可以商購。
[0119] 考慮DGT-28蛋白質(zhì)的預(yù)期用途（例如，在植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物中表 達(dá)）來選擇用于將遺傳信息轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的具體表達(dá)載體。通用的細(xì)菌和動(dòng)物表達(dá)載體 是本領(lǐng)域已知的，并在例如，美國專利公開20050064474A1和國際專利公開WO 05/084190， W005/014791和W003/080809中有詳細(xì)說明?？梢杂猛ㄓ玫霓D(zhuǎn)染方法產(chǎn)生表達(dá)大量蛋白質(zhì) 的細(xì)菌細(xì)胞系，隨后可以使用通用技術(shù)加以純化。
[0120] 用于指導(dǎo)本文核酸表達(dá)的啟動(dòng)子的選擇取決于特定的應(yīng)用。在本文的實(shí)施方案中 可以使用多種在植物中指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以從組成型、化學(xué)調(diào)節(jié)型、誘 導(dǎo)型、組織特異型、和種子優(yōu)選型啟動(dòng)子中選擇。例如，適合于宿主細(xì)胞的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子 可用于表達(dá)和純化DGT-28蛋白質(zhì)。植物啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括來自如下來源的啟動(dòng) 子序列：擬南芥泛素-10 (ubi 10) (Callis, et al·，1990, J. Biol. Chem. ,265:1248612493); 根癌土壤桿菌甘露喊合酶（Amas) (Petolino et al.，U.S. Patent No. 6, 730, 824);和 / 或木薯葉脈花葉病毒（CsVMV) (Verdaguer et al·，1996, Plant Molecular Biology 31:11291139)。
[0121] 組成型啟動(dòng)子包括，例如，核心花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子（Odell et al. (1985) Nature 313:810812);水稻肌動(dòng)蛋白質(zhì)啟動(dòng)子（McElroy et al. (1990)Plant Cell 2:163171);玉米泛素啟動(dòng)子（美國專利號 5, 510, 474 ;Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619632 和 Christensen et al. (1992)Plant Mol. Biol. 18:675689); pEMU 啟動(dòng)子（Last et al. (1991) Theor.Appl. Genet. 81:581588) ;ALS 啟動(dòng)子（美 國專利號 5, 659, 026);玉米組蛋白啟動(dòng)子（Chabout6 et al. Plant Molecular Biology, 8:179191 (1987));等。
[0122] 可用的植物兼容性啟動(dòng)子的范圍包括組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型調(diào)控元 件是能夠響應(yīng)誘導(dǎo)劑而直接或間接激活一種或多種DNA序列或基因的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件。在 沒有誘導(dǎo)物時(shí)，上述DNA序列或基因?qū)⒉槐晦D(zhuǎn)錄。通常，特異性結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)控元件從而 激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無活性的形式存在，隨后會(huì)被誘導(dǎo)劑直接或間接地轉(zhuǎn)化為活性形 式。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)劑，例如蛋白質(zhì)、代謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物，或由熱、 冷、鹽、或有毒元素所直接施用的生理脅迫，或通過病原體或致病劑如病毒而間接施用的生 理脅迫。典型地，特異性結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)控元件從而激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無活性的形式 存在，隨后會(huì)被誘導(dǎo)劑直接或間接地轉(zhuǎn)化為活性形式?？梢酝ㄟ^從外部將誘導(dǎo)物施用給細(xì) 胞或植物，例如通過噴霧、澆水、加熱或類似的方法，而將含有誘導(dǎo)型調(diào)控元件的植物細(xì)胞 暴露于誘導(dǎo)物。
[0123] 在本文的實(shí)施方案中可以使用任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。見Ward et al. Plant Mol. Biol. 22:361366(1993)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括，例如但不限于：蛻皮激素受體啟動(dòng) 子（美國專利號6, 504, 082);來自ACEl系統(tǒng)的響應(yīng)銅的啟動(dòng)子（Mett et al. PNAS 90:45674571(1993));來自玉米的響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的In2-1和In2-2基因（美 國專利號 5,364,780;他『81^^6七&1.，]\1〇1.6611.66116衍。8227:229-237(1991)和6&七2 6七 al.，Mol.Gen.Genetics 243:32-38 (1994));來自 TnlO 的 Tet 阻遏物（6&七2 6七&1.，]?〇1· Gen. Genet. 227:229-237 (1991);來自類固醇激素基因的啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性受到糖皮質(zhì)激 素的誘導(dǎo)（Schena et al·，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:10421 (1991)和 McNellis et al.，（1998)Plant J. 14(2):247-257);玉米GST啟動(dòng)子，其被用作預(yù)應(yīng)急除草劑的疏水親 電子化合物激活（參見美國專利No. 5, 965, 387和國際專利申請公開No. WO 93/001294); 和煙草PR-Ia啟動(dòng)子，其被水楊酸激活（見Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K. , "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-Ia Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System, "Biosci Biotechnol Biochem.2011S印23 ;75(9) :1796-800)。其他受化學(xué)調(diào)控的感興趣的啟動(dòng)子 包括四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型的啟動(dòng)子（參見，例如，Gatz et al.,(1991)Mol.Gen. Genet. 227:229-237,和美國專利號 5, 814, 618 和 5, 789, 156)。
[0124] 其它可調(diào)節(jié)的感興趣啟動(dòng)子包括冷應(yīng)答調(diào)控元件或熱激調(diào)控元件，其轉(zhuǎn)錄分別 受到冷或熱暴露的影響（Takahashi et al. ,Plant Physiol. 99:383-390, 1992);可被厭 氧條件誘導(dǎo)的醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子（Gerlach et al.，PNAS USA 79:2981-2985(1982); Walker et al·，PNAS 84(19) :6624-6628 (1987))，來自豌豆 rbcS 基因或豌豆 psaDb 基 因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2) :255-265);光誘導(dǎo)型 調(diào)節(jié)元件（Feinbaum et al.，Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991 ;Lam and Chua, Science 248:471, 1990 ；Matsuoka et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; Orozco et ah (1993)Plant MohBio. 23(6):1129-1138);植物激素誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件 (Yamaguchi Shinozaki et al. , Plant Mol. Biol. 15:905, 1990 ；Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990)，等等。誘導(dǎo)型調(diào)控元件還可以是玉米In2-1或In2-2基因，它們響 應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑（Hershey et al.，Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991 ;Gatz et al.，Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994)，和轉(zhuǎn)座子TnlO 的四環(huán)素阻遏物（63七2 6七&1.，]?〇1· Gen. Genet. 227:229-237, 1991)。
[0125] 脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括鹽/水脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如P5CS(Zang et al. (1997) Plant Sciences 129:81-89);冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如 corl5a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), corl5b(ffilhelm et al. (1993)Plant Mol Biol 23:1073-1077), wscl20(0uellet et al. (1998)FEBS Lett. 423324-328), ci7 (Kirch et al.(1997)Plant Mol Biol. 33:897-909),和 ci21A(Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113:335-45);干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如 Trg_31(Chaudhary et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57)和 rd29(Kasuga et al. (1999)Nature Biotechnology 18:287-291)。滲透壓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如 Rabl7(Vilardell et al.(1991)Plant Mol. Biol.17:985-93)和滲壓素（osmotin)(Raghothama et al. (1993)Plant Mol Biol 23:1117-28)。熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如熱激蛋白（Barros et al. (1992)Plant Mol. 19:665-75 ; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14:27-41) > smHSP (Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338);和來自歐芹泛素啟動(dòng)子的熱激誘導(dǎo)型元件（WO 03/102198)。其它 脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括rip2 (美國專利號5, 332, 808和美國
【發(fā)明者】J·M·里拉, R·M·西奇洛, C·耶基斯, A·E·魯賓遜 申請人:陶氏益農(nóng)公司