克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的方法，所述方法包括：a.提供兩組或更多組元件序列，每組元件序列一起構(gòu)成至少一種功能性表達(dá)盒，各元件序列兩側(cè)側(cè)翼為IIs型限制內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，之后是其識別位點(diǎn)，所述IIs型限制內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)被選擇成使得所述元件序列的組可組裝成功能性表達(dá)盒；b.提供至少兩種骨架進(jìn)入載體，各骨架進(jìn)入載體按以下這種順序包含：(i)限制酶切割位點(diǎn)與其識別位點(diǎn)，和第一連接物序列(LF)；(ii)包含可選擇標(biāo)記基因的載體骨架；以及(iii)第二連接物序列(RF)，和限制酶識別位點(diǎn)與其切割序列；以及(iv)任選地，在(i)和(iii)的識別位點(diǎn)之間的插入物，任何骨架進(jìn)入載體上的連接物序列RF和LF被選擇成使得其可分別與相同或不同骨架進(jìn)入載體上的LF或RF連接物序列組裝；以及c.使用基于經(jīng)由所述切割位點(diǎn)使用限制酶消化和連接的方法，在至少兩種骨架進(jìn)入載體中組裝所述兩組或更多組元件序列作為功能性表達(dá)盒，從而制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒。
【專利說明】克隆方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于制備標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的方法。本發(fā)明還涉及用于在宿主細(xì)胞中 體內(nèi)重組所述標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的方法。另外，本發(fā)明涉及用于將核酸序列整合在靶位點(diǎn) (target locus)的方法。本發(fā)明還涉及用于制備標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的系統(tǒng)，以及用于產(chǎn)生整 合在靶位點(diǎn)的目的核酸構(gòu)建體的系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用遺傳改造來研發(fā)具有新型表型的以供在基于生物的轉(zhuǎn)化過程 中使用的生物體，所述轉(zhuǎn)化過程應(yīng)用在食品、飼料（feed)、醫(yī)藥、材料以及能源方面。這包括 設(shè)計(jì)和產(chǎn)生正常情況下不會(huì)在目的生產(chǎn)宿主中發(fā)現(xiàn)或（在已知情況下）完全非天然的新型 表型。應(yīng)用的實(shí)例包括（但不限于）微生物產(chǎn)生化學(xué)前體、工業(yè)酶、抗生素以及生物燃料。
[0003] 需要新型技術(shù)來設(shè)計(jì)更好、構(gòu)筑更快且測試更多的DNA構(gòu)建體，以用于更快并且 更佳的菌株改造。這可以通過DNA構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化、模塊化以及自動(dòng)化來著手進(jìn)行。另外，再 利用現(xiàn)有的元件或所謂的生物磚（biobrick)的能力將有助于更好地表征這些元件和降低 構(gòu)建體合成和/或組裝的成本。所述生物磚可為例如啟動(dòng)子（P)、5'UTR(U)、信號序列（S)、 開放閱讀框架（〇)、基因組序列（G)、終止子（T)以及其它功能或調(diào)節(jié)DNA元件。
[0004] 科學(xué)家正仔細(xì)調(diào)查生物和改造工具來研發(fā)用于改造細(xì)胞的新型方法。復(fù)雜DNA盒 可以被設(shè)計(jì)并且被需要來使改造細(xì)胞用于新型目的和高效的轉(zhuǎn)化。因此，需要研發(fā)高通量 低成本的DNA組裝方法，以用于實(shí)際處理和探索更大組的設(shè)計(jì)。所需要的DNA盒可通過基 因合成和連接來產(chǎn)生。然而，這通常是必需針對每種構(gòu)建體進(jìn)行重復(fù)的高成本的過程。已 經(jīng)提出再利用DNA構(gòu)筑塊和模塊式盒來減少成本和時(shí)間。因此，對于基因組合的最佳使用 和探索以及代謝途徑的調(diào)諧（又稱為合成生物學(xué)）來說，需要研發(fā)物理地組裝含有大量呈 多種排布的天然或人工基因的復(fù)雜DNA分子的新型方法。對于DNA盒的模塊式構(gòu)建來說， 需要使用基本構(gòu)筑塊來物理組裝和構(gòu)筑這些盒的有效方法。當(dāng)前可用的用于組裝表達(dá)盒的 方法由 Wang T 等人（2012)于 Appl Microbiol Biotechnol (2012)93 :1853-1863 進(jìn)行綜 述，并且包括如 Goldenfcaid(Sarrion-Perdigones A. (2012)，PL〇S ONE 6(7) :e21622)和 模塊克?。∕odular Cloning) (Weber Ε· (2011)，PLoS ONE 6(2) :el6765 以及 EP2395087)。
[0005] 然而，這些方法相當(dāng)復(fù)雜，因?yàn)槠浒ㄟB續(xù)的體外步驟或反復(fù)的重組（Wingler LM(2011)PNAS USA 108(37) :15135-15140)來用于體內(nèi)組裝多基因途徑的文庫。
[0006] 雖然在過去的數(shù)年已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但大的重組DNA分子的物理構(gòu)建仍代表著 對于每種應(yīng)用來說都尚沒有適合解決方案的主要瓶頸（Weber E. (2011)，PLoS ONE 6(2): el6765以及EP2395087)。重組DNA分子傳統(tǒng)上使用II型限制酶和連接酶來構(gòu)建。雖然極 為通用，但這種方法緩慢且冗長，并且僅允許產(chǎn)生相對小尺寸且僅含有數(shù)個(gè)基因的構(gòu)建體。 具體來說，這種方法受到以下事實(shí)的限制：對于大的構(gòu)建體來說，設(shè)計(jì)克隆策略變得極其困 難，因?yàn)樗锌捎玫南拗泼笇⒃谒鰳?gòu)建體中切割許多次。在過去的數(shù)年中，已經(jīng)研發(fā)許多 不同的方法來克服這些限制。這些方法包括基于重組酶的克隆、不依賴連接的克隆、基于同 源重組和基于PCR組裝的克隆?；谥亟M酶的克隆消除了來自限制位點(diǎn)多次出現(xiàn)在大的構(gòu) 建體中的問題，但受以下事實(shí)限制：重組位點(diǎn)留在最終的構(gòu)建體中，從而妨礙蛋白質(zhì)編碼序 列的無縫組裝（Weber E. (2011)，PLoS ONE 6(2) :e 16765 以及 EP2395087)。此外，基于重 組酶的克隆受以下事實(shí)限制：迄今為止，僅4個(gè)片段可同時(shí)在一個(gè)構(gòu)建體中組裝。
[0007] 盡管所有這些技術(shù)具有其自身的優(yōu)勢，并且對于特定應(yīng)用來說極其有用，但無一 滿足產(chǎn)生多遺傳變體組合的任務(wù)所需的所有要求，所述多遺傳變異組合的產(chǎn)生是成功設(shè)計(jì) 和構(gòu)建具有新型表型的生物體所需的。
[0008] 用于DNA構(gòu)建體組裝的方法由Wang等人于2012年描述。多組分蛋白復(fù)合體的結(jié) 構(gòu)生物學(xué)、代謝工程學(xué)以及合成生物學(xué)的研究經(jīng)常依賴于這些亞單元或酶在同一細(xì)胞中的 有效過度表達(dá)。作為第一步，如果使用基于經(jīng)典且常規(guī)的消化和連接的克隆方法，構(gòu)建多 個(gè)表達(dá)盒將為復(fù)雜且耗時(shí)的工作。已經(jīng)研發(fā)了一些更有效的方法，包括（1)采用多相容質(zhì) 粒表達(dá)系統(tǒng)；（2)載體的基于稀有切點(diǎn)的設(shè)計(jì)（rare-cutter-based design) ; (3)體外重 組（不依賴于序列和連接的克隆，DNA分子在單一反應(yīng)中的等溫酶促組裝）；以及（4)使用 有效重組的酵母進(jìn)行體內(nèi)重組（體內(nèi)組裝重疊片段，反復(fù)重組用于外源表達(dá)盒的染色體整 合）。
[0009] 最近，已經(jīng)研發(fā)基于IIs型限制酶的克隆方法（(W0 2008/095927)，Engler等 人.PLoS ONE 4(2009)e5553)描述了使用IIs型限制酶通過使10個(gè)未消化的輸入質(zhì)粒的 混合物簡單地經(jīng)受限制-連接反應(yīng)并且將所得混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，一步并且在一 個(gè)管中將至少九個(gè)獨(dú)立的DNA片段一起組裝到受體載體中的方案。這種方案稱為"Golden Gate"克隆。
[0010] 雖然合成生物學(xué)代表一個(gè)新的領(lǐng)域，但它利用遺傳改造，并且因此應(yīng)從現(xiàn)有成熟 的技術(shù)如機(jī)械工程學(xué)來習(xí)得。復(fù)雜裝置的成功工程化的重要考慮因素包括部件的標(biāo)準(zhǔn)化。 對于合成生物學(xué)來說，標(biāo)準(zhǔn)化將允許從一個(gè)項(xiàng)目到下一個(gè)項(xiàng)目隨意地再利用先前驗(yàn)證的模 塊，并且因此使得更有效地改造新生物學(xué)功能或生物體。標(biāo)準(zhǔn)化的一個(gè)重要方面在于可將 預(yù)定值與各部分相關(guān)聯(lián)，例如，啟動(dòng)子的限定活性（但應(yīng)理解啟動(dòng)子活性可受附近序列中 存在的增強(qiáng)子序列影響）或針對給定多肽的比酶活性。這是極為重要的，因?yàn)楦脑煨鹿δ?或生物體將需要如此大量的部分一起工作，這樣使得將需要針對許多項(xiàng)目進(jìn)行測試的基因 組合的數(shù)量有可能過大而在物理上不可能。這個(gè)要素是實(shí)現(xiàn)合成生物學(xué)的可能性所需要的 必要要素。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 我們已經(jīng)研發(fā)了一種體外/體內(nèi)雜合方法，所述方法應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的生物元件經(jīng)由 中間 Golden Gate 組裝步驟（Engler C. (2008) PLoS ONE 3(11) :e3647)形成復(fù)雜 DNA 盒用 于在目的宿主中進(jìn)行表達(dá)，并且應(yīng)用專門設(shè)計(jì)的用于在標(biāo)準(zhǔn)化的盒組裝中進(jìn)一步使用的進(jìn) 入載體（entry vector) 〇
[0012] 使用這種新型有效兩步法允許以高效的方式構(gòu)建模塊式DNA盒。另外，我們已 經(jīng)研發(fā)并且顯示了測量啟動(dòng)子強(qiáng)度的小型途徑表征法（mini-pathway characterization method)，其包括兩個(gè)內(nèi)部參照測量（參見實(shí)施例1)。在所述實(shí)施例中，GFP、LacZ以及RFP 組合到一個(gè)途徑中。所述方法還應(yīng)用來表征終止子序列，并且可類似地用于表征信號序列， 5' UTR或感興趣的任何其它調(diào)節(jié)部分或突變、插入或缺失。
[0013] 基于同源重組的方法是有用的，但要求模塊之間共有最少量的序列，這限制了自 由組合不同序列的標(biāo)準(zhǔn)模塊的能力。然而，本發(fā)明的方法通過使用約9 bp(或更長）的標(biāo) 準(zhǔn)化的連接物元件來用于體外組裝或約25 bp (或更長）的標(biāo)準(zhǔn)化的連接物元件來用于體 內(nèi)組裝，規(guī)避了這個(gè)問題。兩種方法均可應(yīng)用來組裝表達(dá)盒，或研發(fā)敲除或插入序列，如下 文中所解釋的。此外，通過在連接物序列處有效使用利用標(biāo)準(zhǔn)化的引物的PCR法，可從含有 標(biāo)準(zhǔn)化的連接物序列的骨架盒有效地回收模塊式盒。連接物序列可含有IIS型限制酶識別 位點(diǎn)，以在所要求位置處在所進(jìn)行的步驟中進(jìn)行準(zhǔn)確切割，從而允許無縫體內(nèi)同源重組，如 果需要無縫體內(nèi)同源重組來維持或恢復(fù)DNA構(gòu)建體的功能性的話。
[0014] 因此，本發(fā)明提供核酸分子的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)可用于由期望數(shù)目優(yōu)選至少3個(gè)片 段來體內(nèi)組裝目的核酸盒，并且整合在靶位點(diǎn)處，其中至少一個(gè)片段含有功能性表達(dá)元件。 功能性表達(dá)元件含有（但不限于）啟動(dòng)子DNA序列（pro)、開放閱讀框架DNA序列（orf)、 終止子DNA序列（ter)以及稱為連接物（connector)的用于體內(nèi)組裝的左和右側(cè)翼DNA序 列（分別為Icon和rcon)。
[0015] DNA分子的系統(tǒng)含有一組至少2個(gè)或3個(gè)骨架（bbn)進(jìn)入載體，其被設(shè)計(jì)成在進(jìn)入 載體中具有至少一個(gè)Icon和一個(gè)rcon序列，其可與元件載體一起應(yīng)用在單鍋（one-pot) Golden-Gate組裝反應(yīng)中，以產(chǎn)生功能性表達(dá)元件（Μ)和單一 II型限制酶按功能性順序的 使用 ° 例如，lcon-pr〇-〇rf-ter_rcon〇
[0016] 所述系統(tǒng)應(yīng)可針對目的核酸構(gòu)建體從許多表達(dá)元件的組裝進(jìn)行縮放，而同時(shí)避免 對構(gòu)建與構(gòu)成目的核酸盒的片段或表達(dá)元件的數(shù)量一樣多的骨架載體的需要。
[0017] 本發(fā)明的核酸分子的系統(tǒng)允許組裝數(shù)量比系統(tǒng)中所存在的骨架載體的數(shù)量少的 表達(dá)元件，以及數(shù)量比系統(tǒng)中所存在的骨架載體的數(shù)量高的表達(dá)元件。本發(fā)明提供一種標(biāo) 準(zhǔn)化的連接物核酸分子的系統(tǒng)，其可用于由期望數(shù)量的表達(dá)元件組裝任何目的核酸盒。
[0018] 因此，本發(fā)明提供用于制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的方法，所述方法包 括：
[0019] a.提供兩組或更多組元件序列，
[0020] 每組元件序列一起構(gòu)成至少一種功能性表達(dá)盒，
[0021] 各元件序列的兩側(cè)側(cè)翼為IIS型限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，之后是其識別位點(diǎn)，
[0022] 所述IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)被選擇成使得所述元件序列的 組可組裝成功能性表達(dá)盒；
[0023] b.提供至少兩種骨架進(jìn)入載體，
[0024] 各骨架進(jìn)入載體按以下這種順序包含：⑴限制酶與其識別位點(diǎn)，和第一連接物 序列（LF) ;(ii)包含可選擇標(biāo)記基因的載體骨架；以及（iii)第二連接物序列（RF)，和限 制酶識別位點(diǎn)與其切割序列；以及（iv)任選地，在（i)和（iii)的識別位點(diǎn)之間的插入物 (insert)，
[0025] 任何骨架進(jìn)入載體上的連接物序列RF和LF被選擇成使得其可分別與相同或不同 骨架進(jìn)入載體上的LF或RF連接物序列進(jìn)行組裝；
[0026] 以及
[0027] c.使用基于經(jīng)由切割位點(diǎn)使用限制酶消化和連接的方法，在所述至少兩種骨架進(jìn) 入載體中組裝兩組或更多組元件序列作為功能性表達(dá)盒，
[0028] 從而制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒。
[0029] 本發(fā)明還提供：
[0030] 用于在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處體內(nèi)重組兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的方法，所 述方法包括：
[0031] a.根據(jù)以上所述的方法制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒，其中：
[0032] i. RF和LF連接物序列包含同源重組序列；以及
[0033] ii.任何骨架進(jìn)入載體上的RF和LF序列被選擇成使得其可通過體內(nèi)重組分別與 LF或RF連接物序列、與相同或不同骨架進(jìn)入載體和/或與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行組裝；以 及
[0034] b.從包含LF和RF序列的骨架進(jìn)入載體回收表達(dá)盒；以及
[0035] c.在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將所回收的表達(dá)盒彼此體內(nèi)重組；和
[0036] 用于在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒體內(nèi)重組的方法， 所述方法包括：
[0037] a.根據(jù)以上所述的方法制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式（modular)表達(dá)盒，其 中：
[0038] i. RF和LF連接物序列包含至少9個(gè)堿基對的同源序列；以及
[0039] ii.任何骨架進(jìn)入載體上的RF和LF序列被選擇成使得其可使用這些序列通過體 外方法分別與LF或RF連接物序列、與相同或不同骨架進(jìn)入載體和/或與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序 列進(jìn)行組裝；以及
[0040] b.從通過LF和RF序列體外連接的骨架進(jìn)入載體組裝并且回收表達(dá)盒；以及
[0041] c.在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將所回收和組裝的表達(dá)盒體內(nèi)重組。
[0042] 本發(fā)明進(jìn)一步提供：
[0043] 用于制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：
[0044] a.兩組或更多組元件序列，
[0045] 每組元件序列一起構(gòu)成至少一種功能性表達(dá)盒，
[0046] 各元件序列兩側(cè)側(cè)翼為IIs型限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，之后是其識別位點(diǎn)，
[0047] 所述IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)被選擇成使得所述元件序列的 組可組裝成功能性表達(dá)盒；
[0048] b.至少兩種骨架進(jìn)入載體，
[0049] 各骨架進(jìn)入載體按以下這種順序包含：（i)限制酶與其識別位點(diǎn)，和第一連接物 序列（LF) ;(ii)包含可選擇標(biāo)記基因的載體骨架；以及（iii)第二連接物序列（RF)，和限 制酶識別位點(diǎn)與其切割序列；以及（iv)任選地，在（i)和（iii)的識別位點(diǎn)之間的插入物，
[0050] 任何骨架進(jìn)入載體上的連接物序列RF和LF被選擇成使得其可分別與相同或不同 骨架進(jìn)入載體上的LF或RF連接物序列進(jìn)行組裝；
[0051] 和
[0052] 用于產(chǎn)生整合在靶位點(diǎn)處的目的核酸構(gòu)建體的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：
[0053] a.如以上所述的系統(tǒng)；以及
[0054] b.至少兩種整合序列，其中一種與第一表達(dá)盒和靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組，并且其 中第二種與第二表達(dá)盒和靶位點(diǎn)另一側(cè)的側(cè)翼序列重組。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0055] 圖1提供用于產(chǎn)生目的核酸構(gòu)建體的2步克隆和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的概況。水平0:制備 或可獲得在適合的載體中的一組的元件序列，其具有IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和標(biāo) 準(zhǔn)化的切割位點(diǎn)（優(yōu)選4-bp)，所述位點(diǎn)被選擇成使得在使用Golden gate克隆組裝后，形 成功能性表達(dá)盒。在水平〇,還制備或可獲得一組骨架載體，其含有適于使用序列同源性進(jìn) 行組裝的左和右連接物序列，以用于在水平2組裝模塊式盒。選擇元件序列的亞組與骨架 (bbn)載體。在水平1，使用Golden Gate克隆將它們進(jìn)行組裝，從而產(chǎn)生含有至少一起編 碼啟動(dòng)子、orf以及終止子的序列的功能性表達(dá)盒。還可選擇用于在水平2在靶位點(diǎn)處進(jìn) 行整合的左和右側(cè)翼，并且添加左或右連接物序列或左和右連接物序列二者。例如，經(jīng)由在 適合的bbn載體中進(jìn)行克隆或經(jīng)由PCR反應(yīng)，其中con序列為所使用的引物的一部分。水 在適合的宿主細(xì)胞中發(fā)生功能性表達(dá)盒與整合側(cè)翼（int)和含有用于體內(nèi)組裝的連 接物（con)序列的可能的其它DNA序列的體內(nèi)組裝并且在靶位點(diǎn)處重組。通常地，待組裝 的所有DNA部分可通過PCR反應(yīng)從由水平1得到的載體中回收，以供在水平2使用，或例如 使用經(jīng)由第二適合的IIs限制酶以及其設(shè)計(jì)在con載體外側(cè)的識別位點(diǎn)切出這些片段并且 切割在其間包含DNA序列的con載體的方法。
[0056] 選項(xiàng)A與B提供用于在靶位點(diǎn)處組裝模塊式盒的方案。在選項(xiàng)B中，添加另外的 左和右整合位點(diǎn)用于第二宿主。選項(xiàng)B之后是水平3。水平3 :例如經(jīng)由PCR反應(yīng)或其它方 法從2B回收模塊式盒（或部分）。所回收的DNA用于轉(zhuǎn)化，并且隨后在第二宿主在靶位點(diǎn) 處整合模塊式DNA盒。
[0057] 圖2提供用于產(chǎn)生目的核酸構(gòu)建體的2步克隆和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的概況。水平0:制備 或可獲得在適合的載體中的一組元件序列，其具有IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn) 化的切割位點(diǎn)（優(yōu)選4-bp)，所述位點(diǎn)被選擇成使得在使用Golden gate克隆組裝后，形成 功能性表達(dá)盒。在水平〇,還制備或可獲得一組骨架載體，其含有適于使用序列同源性進(jìn)行 組裝的左和右連接物序列，以用于在水平2組裝模塊式盒。選擇元件序列的亞組連同骨架 (bbn)載體。在水平1，使用Golden Gate克隆將它們進(jìn)行組裝，從而產(chǎn)生含有至少一起編 碼啟動(dòng)子、orf以及終止子的序列的功能性表達(dá)盒。還可選擇用于在水平2步驟b在靶位 點(diǎn)處進(jìn)行整合的左和右側(cè)翼，并且添加左或右連接物序列或者左和右連接物序列二者。例 如，經(jīng)由在適合的bbn載體中進(jìn)行克隆或經(jīng)由PCR反應(yīng)，其中con序列為所使用的引物的一 部分。
[0058] 通常地，待組裝的所有DNA部分可通過PCR反應(yīng)從由水平1得到的載體中回收，以 供在水平2步驟a中使用，或例如使用經(jīng)由第二適合的IIs限制酶以及其設(shè)計(jì)在con載體 外側(cè)的識別位點(diǎn)切出這些片段并且切割在其間包含DNA序列的con載體的方法。
[0059] 水平2步驟a :使用體外組裝反應(yīng)例如吉布森(Gibson)克隆將一個(gè)或更多個(gè)功能 性表達(dá)盒和/或整合側(cè)翼與連接物序列組裝在一起，以形成模塊式盒。接下來在水平2步驟 h :在適合的宿主細(xì)胞中發(fā)生包括單獨(dú)的或已經(jīng)作為模塊式盒的模塊式盒、整合側(cè)翼（int) 以及含有用于體內(nèi)組裝的連接物（con)序列的可能的其它DNA序列的體內(nèi)組裝并且在靶位 點(diǎn)處重組。選項(xiàng)A與B提供用于在靶位點(diǎn)處組裝模塊式盒的方案。在選項(xiàng)B中，添加另外 的左和右整合位點(diǎn)用于第二宿主。選項(xiàng)B之后是水平3。水平3 :例如經(jīng)由PCR反應(yīng)或其它 方法從2B回收模塊式盒（或部分）。所回收的DNA用于轉(zhuǎn)化，并且隨后在第二宿主在靶位 點(diǎn)處整合模塊式DNA盒。
[0060] 圖3示出水平1的組裝選項(xiàng)（但不限于這些），其中第iii項(xiàng)為使用優(yōu)選地單一 IIS型核酸內(nèi)切酶和4 bp伸出序列（overhang)在切割和連接后組裝功能性表達(dá)盒的優(yōu)選 方法。ii.示出開放閱讀框架可分開成信號序列和開放閱讀框架的獨(dú)立部分，或i.以及開 放閱讀框架為多個(gè)片段的形式，這例如是由于蛋白質(zhì)的大小或模塊式特征，例如具有獨(dú)立 的結(jié)構(gòu)域的酶像PKS、NRPS、纖維素等，或僅僅由于大小或出于蛋白質(zhì)改造目的，以產(chǎn)生orf 部分的文庫序列。第iv項(xiàng)不出orf分開成3片。第v項(xiàng)不出啟動(dòng)子中分開成這樣的啟動(dòng) 子，其中單獨(dú)添加基因的5' UTR部分。應(yīng)注意，這些為實(shí)例，并且基本上可設(shè)計(jì)以多部分的 形式分開的DNA序列并且使用IIs型系統(tǒng)連接，以產(chǎn)生無痕的DNA序列。在所示情況下，在 蛋白質(zhì)的蛋氣fe起點(diǎn)使用AATG。此處，啟動(dòng)子序列的最后個(gè)核昔fe始終被修飾為A。選 擇TAAA來橋接終止子，其中基因的終止密碼子被修飾為TAA，并且終止子序列的第一位被 修飾為A修飾或在5'延伸A。應(yīng)注意，為有效使用Golden Gate (或其它依賴于IIS型的克 隆系統(tǒng)），優(yōu)選（使得）所有序列不含用于切割的限制酶的識別位點(diǎn)。
[0061] 圖4針對骨架（bbn)載體變體的連接物（con)部分示出這些載體。第v項(xiàng)示出通 常地應(yīng)用來在水平1 (圖1和圖2)用指定的（但不限于）給定4 bp連接物產(chǎn)生功能性表達(dá) 盒的變體。第iv項(xiàng)和第ii項(xiàng)提供bbn載體變體，其中連接物中的一個(gè)被分別用于在革巴位 點(diǎn)處進(jìn)行整合的左和右整合側(cè)翼置換或與其組合。第ii項(xiàng)和第i項(xiàng)為變體，其中僅左或右 連接物為骨架的一部分。這些通常地為僅可用在模塊式盒的末端的，例如以與整合側(cè)翼一 起使用，并且在載體中儲(chǔ)存這些。第vi項(xiàng)示出可在用于插入元件序列的IIs型限制位點(diǎn)內(nèi) 使用逆選擇標(biāo)記物用于Golden Gate克?。ɑ蚱渌?yīng)注意，所述方法不限于使用Bsal 作為IIs型限制酶，也不限于使用IIS限制酶，只要由限制得到的側(cè)翼與待插入的單一或模 塊式元件或int/側(cè)翼序列的側(cè)翼相容即可。
[0062] 圖5示出在此文件中所描述的方法和系統(tǒng)在水平1的模塊性。通過從水平0選擇 多個(gè)元件并且用在單鍋Golden Gate (或其它）克隆反應(yīng)中，產(chǎn)生待在水平2 (圖1或2)用 作文庫的功能性表達(dá)盒的文庫，并且可能地可與圖6的步驟2組合。
[0063] 圖6示出在此文件中所描述的方法和系統(tǒng)在水平2的模塊性（針對圖1)。功能性 表達(dá)盒的文庫可添加待經(jīng)由體內(nèi)組裝和重組組裝的一個(gè)或更多個(gè)模塊，從而產(chǎn)生在靶位點(diǎn) 處含有多樣的模塊式DNA盒的宿主細(xì)胞的文庫。任選地，可在水平3回收所述文庫。
[0064] 圖7示出在此文件中所描述的方法和系統(tǒng)在水平2的模塊性（針對圖2)。類似于 圖6,但在水平2步驟a具有中間體外步驟：功能性表達(dá)盒的文庫可添加待經(jīng)由體外組裝而 組裝的一個(gè)或更多個(gè)模塊。這個(gè)步驟可通過所得（并且可能回收的）多部分DNA序列的體 內(nèi)組裝來進(jìn)行，從而產(chǎn)生在靶位點(diǎn)處含有多樣的模塊式DNA盒的宿主細(xì)胞的文庫。任選地， 可在水平3回收所述文庫。
[0065] 圖8示出并且在水平2(A)_(E)的多個(gè)變體（但不限于這些）中描述：具有獨(dú)特 至少25 bp連接物序列的相同的骨架（bbn)載體可被應(yīng)用來體內(nèi)產(chǎn)生敲除或整合構(gòu)建體， 如以下所述。水平1示出水平〇的不同元件（但不限于其）可如何插入骨架載體（還參見 圖4)，可組裝來產(chǎn)生側(cè)翼為用于按規(guī)定順序在水平2進(jìn)行體內(nèi)組裝所需要的一個(gè)或兩個(gè)連 接物序列的模塊式元件。這些獨(dú)特連接物使得可以有效地再利用這些元件載體并且允許按 組合方式直接使用或作為文庫使用，以產(chǎn)生例如涵蓋多個(gè)基因的DNA伸展序列的敲除，或 在文庫中與int-L和int-R序列（水平2C)產(chǎn)生在宿主細(xì)胞中具有減少的質(zhì)粒、染色體或 其它DNA片的宿主細(xì)胞的文庫。通常地，將應(yīng)用功能性標(biāo)記物盒與至少一個(gè)int-L和一個(gè) int-R序列（按所述順序處于靶位點(diǎn)處，但不一定連接）。以下為數(shù)種策略（但不限于此）： (A)產(chǎn)生標(biāo)記物的插入以置換靶位點(diǎn)處的orf ;(B)產(chǎn)生標(biāo)記物的插入以置換靶位點(diǎn)處的由 int-L和int_R限定的所選擇DNA部分；(C)產(chǎn)生標(biāo)記物的插入以置換靶位點(diǎn)處的由作為文 庫添加的int-L和int_R序列的組合可能性限定的所選擇DNA部分，從而導(dǎo)致小至較大的 DNA部分被置換，這取決于選擇用于至少一種染色體、質(zhì)粒或其它靶DNA的int-L與int-R 序列的最大距離；(D)示出部分（B)可被改變來在靶位點(diǎn)處插入特定元件或其一部分。這可 應(yīng)用來以標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式方式，通過合理設(shè)計(jì)或作為文庫方法交換蛋白質(zhì)中的信號序列、 啟動(dòng)子、5'UTR或模塊式部分?？尚械膶?shí)例為啟動(dòng)子調(diào)諧（promoter tuning)，或另一種模 塊式蛋白像NRPS、PKS、纖維素酶以及其它模塊式蛋白等的變體的產(chǎn)生；(E)示出當(dāng)使用多 于一種的標(biāo)記物和第二組與第一種不相容的連接物序列時(shí)，可一次進(jìn)行多個(gè)動(dòng)作。
[0066] 應(yīng)注意對于（D)，int-R需要與靶位點(diǎn)正確匹配，從而不擾亂原始閱讀框架。
[0067] 當(dāng)然，圖8的方法可與圖1或圖2組合來使一個(gè)或更多個(gè)模塊式DNA盒插入一個(gè) 或更多個(gè)靶位點(diǎn)，同時(shí)如圖8所述、作為一個(gè)或更多個(gè)預(yù)定序列或作為文庫方法（圖5-7) 將標(biāo)記物插入在第二位置并且去除或插入DNA序列。
[0068] 圖9示出2步途徑構(gòu)筑法的一般方案，所述方法為一種快速、有效且靈活的方法， 這是由于用于golden gate克隆的標(biāo)準(zhǔn)化的遺傳元件與提供用于體內(nèi)重組的同源性的標(biāo)準(zhǔn) 化的連接物相組合。
[0069] 圖10示出基于所獲得的GFP結(jié)果，啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度的排序。所述方法的功效通過 小的標(biāo)準(zhǔn)差示出，這表明了大量的正確轉(zhuǎn)化株。
[0070] 圖11示出在針對各個(gè)啟動(dòng)子的lacZ和GFP報(bào)告子測定中獲得的結(jié)果之間的相關(guān) 性是可接受的，報(bào)道基因測定證實(shí)并且加強(qiáng)了針對各啟動(dòng)子獲得的結(jié)果。
[0071] 圖12闡述終止子對GFP表達(dá)的影響。再次，各系列的4個(gè)測試菌落的小標(biāo)準(zhǔn)差指 示高百分比的正確轉(zhuǎn)化株。以最暗灰色描述的終止子的所發(fā)現(xiàn)大標(biāo)準(zhǔn)差是由沒有GFP信號 的轉(zhuǎn)化株（不正確轉(zhuǎn)化株的幾個(gè)例外的一個(gè)）引起。
[0072] 圖13闡述在凝膠上針對衣康酸途徑的組裝分析的PCR反應(yīng)的結(jié)果。PCR反應(yīng)產(chǎn)生 正確的帶大小，從而指示基因組中途徑的正確整合與組裝。
[0073] 圖14示出質(zhì)粒Te pep. bbn的示意圖，所述質(zhì)粒用于組裝EBA328和EBA332表達(dá) 盒。所述載體包含在ReP印A 0RF上游1.5 kb用于靶向到ReP印A位點(diǎn)中的1500 bp 5'側(cè) 翼區(qū)、1οχ66位點(diǎn)、由構(gòu)巢曲霉（A. nidulans)gpdA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ble編碼區(qū)的非功能5'部 分（5, ble)，以及ccdB基因。
[0074] 圖15示出質(zhì)粒pEBA1006的示意圖，所述質(zhì)粒與pEBA328_EBA332組合用于二 分基因祀向法中，目標(biāo)為在Rasamsonia emersonii中通過兩個(gè)GH61表達(dá)盒置換RePepA 0RF和起始ATG密碼子上游的約1500個(gè)核苷酸。所述載體包含ble編碼區(qū)的3'部分、構(gòu) 巢曲霉trpC終止子、1οχ71位點(diǎn)、ReP印A 0RF的2500 bp 3'側(cè)翼區(qū)以及pUC 19的骨架 (Invitrogen，Breda, The Netherlands)。通過用限制酶Notl消化去除大腸桿菌DNA，之后 轉(zhuǎn)化R. emersonii菌株。
[0075] 圖16示出質(zhì)粒pEBA328的示意圖，所述質(zhì)粒用作PCR的模板，以使用吉布森 克隆獲得質(zhì)粒pEBA328_EBA332。所述載體包含在ReP印A 0RF上游1.5 kb用于靶向到 RePepA位點(diǎn)中的1500 bp 5'側(cè)翼區(qū)，由黃青霉（P. chrysogenum)Paf啟動(dòng)子、嗜熱籃狀菌 (Talaromyces thermophilus)GH61編碼區(qū)以及黃青霉penDE終止子組成的EBA328表達(dá) 盒，1οχ66位點(diǎn)、由構(gòu)巢曲霉gpdA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ble編碼區(qū)的非功能性5'部分（5'ble)。 PEBA328為pEBA332的代表，其含有EBA332表達(dá)盒而非EBA328表達(dá)盒。EBA332表達(dá)盒由 R. emersonii啟動(dòng)子2、綿毛嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosa)GH61編碼區(qū)以及構(gòu)巢 曲霉amdS終止子（TamdS)組成。
[0076] 圖17示出質(zhì)粒pEBA328 EBA332的示意圖，所述質(zhì)粒與pEBA1006載體組合用于 二分基因祀向法中，目標(biāo)為在Rasamsonia emersonii中通過兩個(gè)GH61表達(dá)盒置換RePepA 0RF和起始ATG密碼子上游的約1500個(gè)核苷酸。所述載體包含在ReP印A 0RF上游1. 5 kb 用于靶向到RePepA位點(diǎn)中的1500 bp 5'側(cè)翼區(qū)，由黃青霉Paf啟動(dòng)子、嗜熱籃狀菌GH61 編碼區(qū)以及黃青霉penDE終止子組成的GH61表達(dá)盒EBA328,由R. emersonii啟動(dòng)子2、綿 毛嗜熱絲孢菌GH61編碼區(qū)以及構(gòu)巢曲霉amdS終止子（TamdS)組成的GH61表達(dá)盒EBA332， 1οχ66位點(diǎn)、由構(gòu)巢曲霉gpdA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ble編碼區(qū)的非功能性5'部分（5'ble)。通過 用限制酶Notl消化去除大腸桿菌DNA，之后轉(zhuǎn)化R. emersonii菌株。
[0077] 圖18示出質(zhì)粒ρΕΒΑΙΟΟΙ的示意圖，所述質(zhì)粒與pEBA1002載體組合用于二分基因 革巴向法中，目標(biāo)為在Rasamsonia emersonii中使ReKu80 0RF缺失。所述載體包含2500 bp 5'上游側(cè)翼區(qū)、1οχ66位點(diǎn)、由構(gòu)巢曲霉gpdA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ble編碼序列的5'部分以及 pUC19的骨架（Invitrogen，Breda, The Netherlands)。通過用限制酶Notl消化去除大腸 桿菌DNA，之后轉(zhuǎn)化R. emersonii菌株。
[0078] 圖19示出質(zhì)粒pEBA1002的示意圖，所述質(zhì)粒與ρΕΒΑΙΟΟΙ載體組合用于二分基因 革巴向法中，目標(biāo)為在Rasamsonia emersonii中使ReKu80 0RF缺失。所述載體包含ble編 碼區(qū)的3'部分、構(gòu)巢曲霉trpC終止子、1οχ71位點(diǎn)、ReKu80 0RF的2500 bp 3'下游側(cè)翼區(qū) 以及pUC19的骨架（Invitrogen，Breda, The Netherlands)。通過用限制酶Notl消化去除 大腸桿菌DNA，之后轉(zhuǎn)化R. emersonii菌株。
[0079] 圖20示出用于使R. emersonii的ReKu80基因缺失的策略。用于使ReKu80缺失 的載體包含側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的重疊非功能性ble選擇標(biāo)記物片段（分開的（split)標(biāo)記 物）以及用于靶向的ReKuSO基因的5'和3'同源區(qū)（1)。所述構(gòu)建體通過三重同源重組 (X)在基因組ReKuSO位點(diǎn)以及重疊同源非功能性ble選擇標(biāo)記物片段處整合（2)并且置換 基因組ReKuSO基因拷貝（3)。隨后，通過ere重組酶的瞬時(shí)表達(dá)去除選擇標(biāo)記物，從而在 1οχ66與1οχ71位點(diǎn)之間引起重組，導(dǎo)致ble基因缺失，而剩余雙重突變1οχ72位點(diǎn)留在基 因組中（4)。使用這種總體策略，從基因組中去除ReKu80 0RF。
[0080] 圖21示出用于在真菌中瞬時(shí)表達(dá)ere重組酶的質(zhì)粒pEBA513的示意圖。pEBA513 為PAMPF21衍生的載體，其含有AMA1區(qū)和CAT氯霉素抗性基因。描繪了 ere重組酶基因 (ere)表達(dá)盒，其含有黑曲霉（A. niger)glaA啟動(dòng)子（Pgla)、cre重組酶編碼區(qū)以及niaD終 止子。另外，示出了由構(gòu)巢曲霉gpdA啟動(dòng)子（PgpdA)、hygB編碼區(qū)以及黃青霉penDE終止 子（TpenDE)組成的潮霉素抗性盒。
[0081] 圖22示出在2%玉米秸桿活性測定中測試的上清液的劑量應(yīng)答曲線。將不同劑 量的上清液的搖瓶發(fā)酵物與2%玉米秸桿一起孵育，并且在65°C下孵育72小時(shí)。使用NMR 量化釋放的糖。X軸：（稀釋）上清液的蛋白濃度，將200 μ 1上清液添加至800 μ 1底物，得 到1 ml的最終測定體積。Υ軸：相對葡萄糖釋放（AGlc，任意單位）：針對酶溶液中存在的 殘余糖（由空白測量）以及酸預(yù)處理的玉米秸桿中存在的殘余糖，校準(zhǔn)樣品中測量的葡萄 糖?？招膱A：pEBA328_EBA332轉(zhuǎn)化株；空心方塊：2個(gè)空參考菌株的曲線；虛線：pEBA328_ EBA332 曲線擬合的95%置信區(qū)間。
[0082] 圖23示出選擇標(biāo)記物盒的使用。在選項(xiàng)1中，可共用一個(gè)或更多個(gè)啟動(dòng)子-開放 閱讀框架-終止子（Ρ0Τ)盒，其編碼可選擇標(biāo)記物，以用于在宿主1中進(jìn)行組裝并且在宿主 2中應(yīng)用，例如P〇T 2。在選項(xiàng)2中，在內(nèi)部側(cè)翼之外的一個(gè)或更多個(gè)Ρ0Τ盒編碼可選擇標(biāo)記 物以用于在宿主1中組裝，并且另外的在內(nèi)部側(cè)翼中的一個(gè)或更多個(gè)Ρ0Τ用于在宿主2中 應(yīng)用，例如卩〇1' 2用于宿主1，并且卩01'3用于宿主2。
[0083] 序列表說明
[0084] SEQ ID N0 :1至30闡述啟動(dòng)子元件的序列如下：SEQ ID N0 :1 :啟動(dòng)子元件 Sc. EN01. Pro ;Seq ID N0 :2 :啟動(dòng)子元件Sc PDCI. pro ;Seq ID N0 :3 :啟動(dòng)子元件ScEN02· IDN0 :6 :啟動(dòng)子元件 Sc PGK1. pro ;Seq ID NO :7 :啟動(dòng)子元件 Sc GPM1. pro ;Seq ID NO :8 : 啟動(dòng)子元件 Sc PMA1_L pro ;Seq ID NO :9 :啟動(dòng)子元件 Sc 0YE2. pro ;Seq ID NO :10 :啟動(dòng) 子元件 Sc TALL pro ;Seq ID NO :11:啟動(dòng)子元件 Sc TDHI. pro ;Seq ID NO :12:啟動(dòng)子元 件ScTDH3·pro;SeqIDN0:13:啟動(dòng)子元件ScTEFI·pro ;SeqIDN0:14:啟動(dòng)子元件Sc 丁卩11邛1'〇;569 10勵(lì)：15:啟動(dòng)子元件5。4(：1'1邛1'〇;569 10勵(lì)：16:啟動(dòng)子元件48了6打· pro ;Seq ID NO :17 :啟動(dòng)子元件 Sc PRE3. pro ;Seq ID NO :18 :啟動(dòng)子元件 Sc VPS68. pro ; Seq ID NO :19 :啟動(dòng)子元件KLLA0A09185g(乳酸克魯維酵母（K. lactis)啟動(dòng)子1) ;Seq ID 冊：20:啟動(dòng)子元件1(^\(^110118(乳酸克魯維酵母啟動(dòng)子2);5叫10勵(lì) ：21:啟動(dòng)子元件 KLLA0B08998g(乳酸克魯維酵母啟動(dòng)子3) ;Seq ID NO :22 :啟動(dòng)子元件KLLA0B14839g(乳 酸克魯維酵母啟動(dòng)子4);5叫10^):23:啟動(dòng)子元件1(^\(? 148838(乳酸克魯維酵母啟 動(dòng)子5);5叫10勵(lì)：24:啟動(dòng)子元件1(^\00)55668(乳酸克魯維酵母啟動(dòng)子6) ;5叫10 N0 :25 :啟動(dòng)子元件KLLA0D00979g(乳酸克魯維酵母啟動(dòng)子7) ;Seq ID N0 :26 :啟動(dòng)子元件 KLLA0D07634g(乳酸克魯維酵母啟動(dòng)子8) ;Seq ID N0:27:啟動(dòng)子元件KLLA0E01057g(乳酸 克魯維酵母啟動(dòng)子9) ;Seq ID勵(lì)：28:啟動(dòng)子元件1(^\(^1826(^(乳酸克魯維酵母啟動(dòng)子 10);5叫10勵(lì)：29:啟動(dòng)子元件虬1^(^200318(乳酸克魯維酵母啟動(dòng)子11) ;以及5叫10 N0 :30 :啟動(dòng)子元件KLLA0F20988g(乳酸克魯維酵母啟動(dòng)子12)。
[0085] SEQ ID N0 :31 至 35 闡述 0RF 的序列如下：Seq ID NO :31 :0RF 元件 vGFP ;Seq ID NO :32 :0RF 元件 RFP ;Seq ID NO :33 :0RF 元件 LacZ ;Seq ID NO :34 :0RF 元件 GFPmut3 ;以 及 Seq ID NO :35 :0RF 元件 GFP-pest。
[0086] SEQ ID NO :36至49闡述終止子序列如下：Seq ID NO :36 :元件ADH1終止子；Seq ID NO :37 :元件 ADH2 終止子；Seq ID NO :38 :元件 EN01 終止子；Seq ID NO :39 :元件 GPM1 終止子；Seq ID NO :40 :元件 PDCI 終止子；Seq ID NO :41 :元件 PGI1 終止子；Seq ID NO : 42 :元件PGK1終止子；Seq ID NO :43 :元件PMA1終止子；Seq ID NO :44 :元件TALI終止子； Seq ID NO :45 :元件 TDH1 終止子；Seq ID NO :46 :元件 TDH3 終止子；Seq ID NO :47 :元件 TEF1終止子；Seq ID NO :48 :元件TEF2終止子；以及Seq ID NO :49 :元件TPI1終止子。
[0087] SEQ ID NO :50闡述用于SEQ ID NO :1至49的所有元件的大腸桿菌載體的序列。
[0088] SEQ ID N0 :51至63闡述連接物的序列（參見實(shí)施例）。
[0089] Seq ID N0 :64至SEQ ID N0 :85闡述骨架進(jìn)入載體的序列（參見實(shí)施例）。
[0090] Seq ID N0 :86闡述用于SEQ ID N0 :64至85的所有骨架進(jìn)入載體的大腸桿菌載 體的序列。
[0091] SEQ ID N0 :87 至 SEQ ID NO :112 闡述 PCR 引物序列如下：Seq ID NO :87 :con5 forw ；Seq ID NO ：88 ：cona rev ；Seq ID NO：89 ：cona forw ；Seq ID NO ：90 ：conb rev ；Seq ID NO ：91 ：conb forw ；Seq ID NO ：92 ：conc rev ；Seq ID NO ：93 ：conc forw ；Seq ID NO ： 94 ：conD rev ；Seq ID NO：95 ：conD forw ；Seq ID NO：96 ：conE rev ；Seq ID NO：97 ：conE forw ；Seq ID NO ：98 ：conF rev ；Seq ID NO ：99 ：conF forw ；Seq ID NO ：100 ：conG rev ；Seq ID NO ：101 ：conG forw ；Seq ID NO ：102 ：conH rev ；Seq ID NO ：103 ：conH forw ：Seq ID NO： 104 ：conl rev ；Seq ID N0：105：conl forw ；Seq ID N0：106：conJ rev ；Seq ID NO： 107： conj forw ；Seq ID N0：108：conK rev ；Seq ID NO ：109 ：conK fw ；Seq ID N0：110：con3 rev;Seq IDN0:lll:KanMX添加連接物上的 5950 正向引物；以及 Seq ID N0:112:KanMX 添 加連接物b上的5951反向引物。
[0092] Seq ID NO : 113闡述裝備有連接物a和b的PCR片段KanMX標(biāo)記物的序列。
[0093] SEQ ID :114闡述左側(cè)翼INT1上的正向引物的序列。
[0094] SEQ ID N0 :115闡述左側(cè)翼INT1添加連接物5上的反向引物序列。
[0095] SEQ ID N0 :116闡述具有用于在INT1進(jìn)行整合的連接物5的左側(cè)翼的序列。
[0096] SEQ ID N0 :117闡述右側(cè)翼INT1添加連接物3上的正向引物的序列。
[0097] SEQ ID NO :118闡述左側(cè)翼INT1上的反向引物的序列。
[0098] SEQ ID N0 :119闡述具有用于在INT1進(jìn)行整合的連接物3的右側(cè)翼的序列。
[0099] SEQ ID N0 :120、121、122、123、124以及125闡述針對在釀酒酵母中 (S. cerevisiae)產(chǎn)生衣康酸的代謝途徑的構(gòu)建而特定合成的開放閱讀框架（參見表5)。
[0100] SEQ ID N0:126闡述R. emersonii RePepA(包括側(cè)翼的基因組序列）的序列。
[0101] SEQ ID N0 :127 闡述 R. emersonii RePepA(cDNA)的序列。
[0102] SEQ ID NO :128 闡述 R. emersonii RePepA(蛋白質(zhì)）的序列。
[0103] SEQ ID NO :129闡述構(gòu)巢曲霉gpdA啟動(dòng)子和ble編碼區(qū)的5'部分的序列。
[0104] SEQ ID NO :130闡述ble編碼區(qū)的3'部分和構(gòu)巢曲霉TrpC終止子的序列。
[0105] SEQ ID NO :131闡述黃青霉Paf啟動(dòng)子的序列。
[0106] SEQ ID NO :132闡述嗜熱籃狀菌GH61的序列。
[0107] SEQ ID NO :133闡述黃青霉penDE終止子的序列。
[0108] SEQ ID N0 :134 闡述 R. emersonii 啟動(dòng)子 2 的序列。
[0109] SEQ ID NO :135闡述綿毛嗜熱絲孢菌GH61的序列。
[0110] SEQ ID NO :136闡述構(gòu)巢曲霉AmdS終止子的序列。
[0111] SEQ ID NO :137闡述正向吉布森引物的序列。
[0112] 用于接合pEBA1013載體部分與EBA328表達(dá)盒的5' ReP印A區(qū)-Ppaf。
[0113] SEQ ID NO :138闡述反向吉布森引物TpenDE的序列。
[0114] SEQ ID N0:139闡述用于接合EBA328 與EBA332 表達(dá)盒的正向吉布森引物 TpenDE-Ppra 的序列。
[0115] SEQ ID NO :140闡述反向吉布森引物Tamds的序列。
[0116] SEQ ID NO :141闡述用于接合EBA332表達(dá)盒與pEBA1013載體部分的正向吉布森 引物 Tamds-loxP-gpd-ble 的序列。
[0117] SEQ ID NO :142闡述反向吉布森引物Y ReP印A的序列。
[0118] SEQ ID NO :143闡述ReKu80(基因組序列，具有側(cè)翼的編碼區(qū)）的序列。
[0119] SEQ ID NO :144 闡述 ReKu80(cDNA)的序列。
[0120] SEQ ID NO :145 闡述 ReKu80(蛋白質(zhì)）的序列。
[0121] 發(fā)明詳沭
[0122] 貫穿本說明書和隨附權(quán)利要求書，詞語"包含"、"包括"和"具有"以及變型應(yīng)解釋 為包括性的。即，這些詞語旨在傳達(dá)在上下文允許的情況下，可包含未具體列舉的其它元件 或整體。
[0123] 在本文中未使用數(shù)量詞時(shí)用來指語法對象有一個(gè)或一個(gè)以上（即一個(gè)或至少一 個(gè)）。舉例來說，"元件"可意指一個(gè)元件或一個(gè)以上的元件。
[0124] 本發(fā)明的系統(tǒng)包含具有高多樣性和靈活性的限定組的部件，借此給定系統(tǒng)可容易 地應(yīng)用于許多不同的應(yīng)用。值得注意的是，給定系統(tǒng)可用于包含不同數(shù)量的待組裝成目的 核酸盒的表達(dá)元件的應(yīng)用。本發(fā)明的極大優(yōu)勢在于許多不同的表達(dá)元件可與數(shù)量比待組合 的表達(dá)元件的數(shù)量小的骨架載體組合。因此，所述系統(tǒng)可根據(jù)許多不同的表達(dá)元件的組合 和表達(dá)元件數(shù)量進(jìn)行縮放，而無需用于使連接物適合于大量表達(dá)元件的額外的克隆工作。
[0125] 因此根據(jù)本發(fā)明，提供一種用于制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式表達(dá)盒的方 法，所述方法包括：
[0126] a.提供兩組或更多組元件序列，
[0127] 每組元件序列一起構(gòu)成至少一種功能性表達(dá)盒，
[0128] 各元件序列兩側(cè)側(cè)翼為IIs型限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，之后是其識別位點(diǎn)，
[0129] 所述IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)被選擇成使得所述元件序列的 組可組裝成功能性表達(dá)盒；
[0130] b.提供至少兩種骨架進(jìn)入載體，
[0131] 各骨架進(jìn)入載體按以下這種順序包含：（i)限制酶與其識別位點(diǎn)，和通常地至少 約9 bp長的第一連接物序列（LF) ;(ii)包含可選擇標(biāo)記基因的載體骨架；以及（iii)同樣 通常地至少約9 bp長的第二連接物序列（RF)，和限制酶識別位點(diǎn)與其切割序列；以及（iv) 任選地，在（i)和（iii)的識別位點(diǎn)之間的插入物，
[0132] 任何骨架進(jìn)入載體上的連接物序列RF和LF被選擇成使得其可分別與相同或不同 骨架進(jìn)入載體上的LF或RF連接物序列進(jìn)行組裝；
[0133] c.使用基于經(jīng)由所述切割位點(diǎn)使用限制酶消化和連接的方法，在所述至少兩種骨 架進(jìn)入載體中組裝所述兩組或更多組元件序列作為功能性表達(dá)盒，
[0134] 從而制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒。
[0135] 所述標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒可易于在體內(nèi)重組。因此，本發(fā)明提供用于在宿主細(xì)胞中在 靶位點(diǎn)處體內(nèi)重組兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式表達(dá)盒的方法，所述方法包括：
[0136] a.根據(jù)本文以上所述的方法制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式表達(dá)盒，其中：
[0137] i. RF和LF連接物序列包含通常地至少25個(gè)堿基對長的同源重組序列；以及
[0138] ii.任何骨架進(jìn)入載體上的RF和LF序列被選擇成使得其可通過體內(nèi)重組分別與 LF或RF連接物序列、與相同或不同骨架進(jìn)入載體和/或與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行組裝；以 及
[0139] b.從包含LF和RF序列的骨架進(jìn)入載體回收表達(dá)盒；以及
[0140] c.在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將所回收的表達(dá)盒彼此體內(nèi)重組。
[0141] 還提供用于在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒體內(nèi)重組 的方法，所述方法包括：
[0142] a.根據(jù)以上所述的方法制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式表達(dá)盒，其中：
[0143] i. RF和LF連接物序列包含至少9個(gè)堿基對的同源序列；以及
[0144] ii.任何骨架進(jìn)入載體上的RF和LF序列被選擇成使得其可使用這些序列通過體 外方法分別與LF或RF連接物序列、與相同或不同骨架進(jìn)入載體和/或與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序 列進(jìn)行組裝；以及
[0145] b.從通過LF和RF序列體外連接的骨架進(jìn)入載體組裝并且回收表達(dá)盒；以及
[0146] c.在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將所回收和組裝的表達(dá)盒體內(nèi)重組。
[0147] 在本發(fā)明中，組裝目的核酸構(gòu)建體并且通常地整合在靶位點(diǎn)處。通常地，可將一系 列表達(dá)盒整合在祀位點(diǎn)處。
[0148] 根據(jù)本發(fā)明的方法涉及核酸分子彼此以及與靶位點(diǎn)的重組。重組是指其中核酸分 子斷裂并且然后接合至不同核酸分子的過程。本發(fā)明的重組過程通常地涉及可來自相同或 不同生物體的不同核酸分子的人工和有意重組，從而產(chǎn)生重組核酸。
[0149] 本發(fā)明的方法通常地依賴于同源重組反應(yīng)。"同源重組"是指具有含有相似核苷 酸序列（即，同源序列）的對應(yīng)位點(diǎn)的核苷酸序列之間的反應(yīng)，通過其分子可相互作用（重 組），從而形成新的重組核酸序列。相似核苷酸序列的位點(diǎn)在本文中各自稱為"同源序列"。 通常，同源重組的頻率隨著同源序列的長度增加而增加。因此，盡管同源重組可發(fā)生在不太 一致的兩個(gè)核酸序列之間，但重組頻率（或效率）隨著兩個(gè)序列之間的相異性增加而下降。
[0150] 可使用本發(fā)明的方法將一系列組裝的表達(dá)盒整合在靶位點(diǎn)處（通常地通過同源 重組）。
[0151] 靶位點(diǎn)為期望整合組裝的核酸的任何位置。位點(diǎn)可為染色體位點(diǎn)，即在宿主細(xì)胞 的基因組內(nèi)，或?yàn)槿旧w外位點(diǎn)，例如質(zhì)?；蛉斯と旧w。用于靶向所選擇的靶位點(diǎn)的序列 將通常地為靶位點(diǎn)側(cè)翼的序列。核酸序列在靶位點(diǎn)處的整合可導(dǎo)致所述序列在沒有序列丟 失的情況下整合在靶位點(diǎn)處?；蛘?，整合可伴隨有序列從靶位點(diǎn)的丟失。因此，核酸序列在 靶位點(diǎn)處的整合可導(dǎo)致編碼序列的部分或完全缺失，例如這樣使得一個(gè)或更多個(gè)基因被部 分或完全敲除。
[0152] 兩種或更多種表達(dá)盒可根據(jù)本發(fā)明在2步法中按模塊式方式進(jìn)行組裝（參見圖1 和圖1. 2)。
[0153] 在水平1，將元件序列的組與含有允許組裝功能盒的左和右連接物DNA序列的骨 架DNA序列（LF和RF con序列）組裝在一起，其通常地含有包括啟動(dòng)子、orf以及終止子 序列的至少2個(gè)元件。
[0154] 在水平2,發(fā)生至少一種表達(dá)盒、但通常地兩種或更多種表達(dá)盒與用于靶向整合的 5' DNA側(cè)翼以及用于靶向整合的3' DNA側(cè)翼的體內(nèi)組裝，并且在靶位點(diǎn)處發(fā)生整合。
[0155] 另外，在水平3,可進(jìn)行步驟來從宿主細(xì)胞獲得組裝的表達(dá)盒，以用于在宿主細(xì)胞 外進(jìn)行進(jìn)一步處理和/或用來修飾另一宿主細(xì)胞，或作為DNA產(chǎn)物。這可通過以下方式來 實(shí)現(xiàn)：提供用于與另外的序列進(jìn)行整合的，被設(shè)計(jì)成允許在第二靶位點(diǎn)處、通常地在第二宿 主細(xì)胞中進(jìn)行整合的序列。
[0156] 在圖1中，水平2描述了模塊式表達(dá)盒從功能性表達(dá)盒以及5'和'3盒通過體內(nèi) DNA重組在靶位點(diǎn)處的組裝。圖2描述了替代方案，其中水平2分成a和b，即首先進(jìn)行體 外組裝步驟以獲得模塊式表達(dá)盒，其在水平2b在宿主中在靶位點(diǎn)處進(jìn)一步體內(nèi)重組成完 整的模塊式DNA表達(dá)盒。
[0157] 在水平2a (圖2)，可應(yīng)用但不限于稱為SLIC、吉布森以及CPEC的方法。這些方法 是提供標(biāo)準(zhǔn)化的、無痕（scarless)的、（大部分）不依賴于序列的、多部分DNA組裝的相關(guān) 方法。由于起始材料和最終產(chǎn)物對于這三種方法是相同的，因此均可使用至少9 bp并且對 于具體方法的效率來說可需要更長的相同同源連接物序列來加以應(yīng)用（http ://j5. jbei. org/j5manual/pages/22. html)〇
[0158] 在水平1，通常地通過單一 IIs型限制核酸內(nèi)切酶來催化限制。然而，也可以應(yīng)用 多個(gè)IIs型限制核酸內(nèi)切酶，或針對元件序列載體的IIs型限制核酸內(nèi)切酶與產(chǎn)生伸出序 列（overhang)的II型限制酶的組合，所述伸出序列與對用于組裝功能性表達(dá)盒的元件或 具有整合側(cè)翼（int)的表達(dá)盒的左和右元件設(shè)計(jì)的那些相容。連接是通過連接酶來催化。
[0159] 本發(fā)明的方法允許通過經(jīng)由在片段兩端形成的單鏈伸出序列、使用IIs型限制核 酸內(nèi)切酶來組裝核酸片段構(gòu)建體由元件序列組產(chǎn)生目的表達(dá)盒。在本發(fā)明中，可使用IIs 型限制酶。IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)為限制核酸內(nèi)切酶識別雙鏈DNA并且在切割位 點(diǎn)切割雙鏈DNA的識別位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)在雙鏈DNA的識別位點(diǎn)外。IIs型限制核酸內(nèi) 切酶進(jìn)行切割，以使得產(chǎn)生3至6個(gè)核苷酸的伸出序列，這取決于具體IIs型限制核酸內(nèi)切 酶。通常地，在本發(fā)明的方法中，可使用產(chǎn)生4個(gè)核苷酸的伸出序列的酶。然而，還可使用 產(chǎn)生更長單鏈伸出序列的IIs型核酸內(nèi)切酶。在切割時(shí)形成伸出序列的核苷酸范圍在本文 中稱為切割位點(diǎn)。由于切割位點(diǎn)的核苷酸不是識別位點(diǎn)的一部分，因此其可根據(jù)期望在不 破壞IIs型限制核酸內(nèi)切酶的切割活性的情況下進(jìn)行選擇。表5給出適于本發(fā)明的方法的 IIs型限制核酸內(nèi)切酶的實(shí)例。
[0160] 對于實(shí)施本發(fā)明，可使用提供足以在其切割位點(diǎn)進(jìn)行有效連接的"粘性"末端的 任何IIs型限制酶。對所述酶的選擇被提供在REBASE網(wǎng)頁（rebase. neb. com/cgi-bin/ asymmlist)和Szybalsky等人.（1991，Gene，100:13_26)的綜述中。具有不對稱識別位點(diǎn) 的切割位點(diǎn)在識別位點(diǎn)之外并且在切割時(shí)提供至少三個(gè)、優(yōu)選4個(gè)或更多個(gè)核苷酸殘基伸 出序列（例如BLi736I ;BpuAI、VpaK321、SfaNI等）的II型限制酶（例如，此網(wǎng)頁中示出 的那些）可用在本發(fā)明中。
[0161] 推薦識別位點(diǎn)含有至少4個(gè)、更優(yōu)選至少6個(gè)或更多個(gè)堿基對，以便將在目的序列 部分中發(fā)現(xiàn)所述位點(diǎn)的機(jī)會(huì)最小化。還可使用具有5 bp識別位點(diǎn)（例如SfaNI)的IIs型 限制核酸酶。在消化片段的端點(diǎn)產(chǎn)生4 nt單鏈伸出序列的IIs型限制核酸內(nèi)切酶在理論 上可產(chǎn)生具有256種可能的序列的末端。具有甚至更長的識別位點(diǎn)、例如包含十個(gè)或更多 個(gè)堿基對的IIs型限制酶已被工程化。天然IIs型酶中的最大識別位點(diǎn)是針對酶Sapl的， 其具有7bp識別位點(diǎn)。一個(gè)優(yōu)選解決方案是使用人工IIs型酶，其被改造以具有長的識別 位點(diǎn)（Lippow 等人，2009，Nucleic acides Res.，37 :3061-3073)。例如，預(yù)期具有 18 bp 識 別位點(diǎn)的IIs型酶僅至多切割每個(gè)真核基因組數(shù)次，并且將允許制作不必改變天然序列的 任何核苷酸的最多進(jìn)入模塊。
[0162] 水平2選項(xiàng)b (圖1):可包含具有左和右DNA側(cè)翼的另外的骨架用于在水平3回 收后的之后的在第二宿主中的整合。
[0163] 可進(jìn)行本發(fā)明的方法，其中在兩種整合序列存在下進(jìn)行重組步驟，其中一個(gè)與第 一表達(dá)盒和靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組，并且其中第二個(gè)與第二表達(dá)盒和靶位點(diǎn)的另一側(cè)的側(cè) 翼序列重組。
[0164] 或者，整合序列可由兩種骨架進(jìn)入載體來提供。因此，可進(jìn)行本發(fā)明的方法，以使 得在重組步驟中，第一表達(dá)盒包含與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組的整合序列，并且第二表達(dá)盒 包含與靶位點(diǎn)的另一側(cè)的側(cè)翼序列重組的整合序列。
[0165] 整合序列可包含用于與第二靶位點(diǎn)、任選地與第一靶位點(diǎn)種類不同的宿主細(xì)胞中 的位點(diǎn)進(jìn)行重組的另外的序列。
[0166] 整合序列將通常地允許在靶位點(diǎn)處經(jīng)由同源重組來進(jìn)行重組。也就是說，整合序 列將通常地與靶位點(diǎn)處的序列具有足夠的同源性，以使得能夠經(jīng)由同源重組在靶位點(diǎn)處整 合兩種或更多種表達(dá)盒。
[0167] 介導(dǎo)組裝的表達(dá)盒與靶位點(diǎn)之間的同源重組的序列的長度可為至少約20 bp、至 少約30 bp、至少約50 bp、至少約0.1 kb、至少約0.2 kb、至少約0.5 kb、至少約1 kb或至 少約2 kb。
[0168] 或者，整合序列可為由位點(diǎn)特異性重組酶識別的序列。也就是說，整合序列可允許 經(jīng)由位點(diǎn)特異性重組在適合重組酶存在下進(jìn)行整合。
[0169] 在本發(fā)明的方法中，可提供整合序列，其提供在一個(gè)宿主細(xì)胞種類中與第一靶位 點(diǎn)重組以及然后在第二宿主細(xì)胞種類中與靶位點(diǎn)的重組?？稍谒稣闲蛄兄g常規(guī)地提 供選擇標(biāo)記物（用于在第一宿主細(xì)胞種類中選擇）。顯然，一個(gè)必要是將所述標(biāo)記物放置在 位于表達(dá)盒一側(cè)的兩個(gè)整合位點(diǎn)之間。例如，整合位點(diǎn)可提供在表達(dá)盒的5'和3'端，其對 于第一宿主細(xì)胞種類中的靶位點(diǎn)是特異的。選擇標(biāo)記物然后可被提供成鄰近于一個(gè)整合位 點(diǎn)、位于整合位點(diǎn)與表達(dá)盒一端之間。選擇標(biāo)記物將通常地適于在第一宿主細(xì)胞種類中進(jìn) 行選擇。然后，可提供用于第二宿主細(xì)胞種類的另外的整合位點(diǎn)。這些整合位點(diǎn)中的一個(gè) 將位于選擇標(biāo)記物與表達(dá)盒的一端之間。然后另一個(gè)將定位在表達(dá)盒的另一端與整合位點(diǎn) (對于第一宿主細(xì)胞種類特異）之間。
[0170] 這種方法圖解在圖23中，其示出選擇標(biāo)記物盒的使用。在選項(xiàng)1中，可共用一個(gè) 或更多個(gè)啟動(dòng)子-開放閱讀框架-終止子（Ρ0Τ)盒，其編碼可選擇標(biāo)記物以用于在宿主1 中組裝和在宿主2中應(yīng)用，例如Ρ0Τ 2。在選項(xiàng)2中，在內(nèi)部側(cè)翼之外的一個(gè)或更多個(gè)Ρ0Τ盒 編碼可選擇標(biāo)記物，以用于在宿主1中組裝，并且另外的在內(nèi)部側(cè)翼中的一個(gè)或更多個(gè)Ρ0Τ 用于在宿主2中應(yīng)用，例如？0凡用于宿主1，并且？01~3用于宿主2。
[0171] 在本發(fā)明的方法中，可在靶位點(diǎn)處按預(yù)定順序順次（in series)組裝并且重組一 系列表達(dá)盒，例如至少約 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多 個(gè)表達(dá)盒。
[0172] 可進(jìn)行所述方法以使得至少一個(gè)表達(dá)盒能夠表達(dá)標(biāo)記物。也就是說，至少一個(gè)表 達(dá)載體可編碼可充當(dāng)標(biāo)記物的多肽。
[0173] 在本發(fā)明的方法中，可使用不根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的一個(gè)或更多個(gè)表達(dá)盒。
[0174] 在本發(fā)明的方法中，提供至少兩組元件序列。每組元件序列將通常地能夠組裝成 表達(dá)盒。在本發(fā)明的背景下，表達(dá)盒旨在指示引導(dǎo)細(xì)胞機(jī)器制作RNA和蛋白質(zhì)的核酸序列。 通常地，表達(dá)盒將包含編碼序列和控制所述編碼序列的表達(dá)的序列。通常地，表達(dá)盒可至少 包含啟動(dòng)子、開放閱讀框架以及終止子序列。
[0175] 術(shù)語"控制序列"在本文中定義為包括對于mRNA或多肽在體外或在宿主細(xì)胞內(nèi)的 產(chǎn)生必要或有利的所有成分。各控制序列對于編碼多肽的核酸序列可為天然的或外源的。 所述控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、Shine-Delgarno序列、最優(yōu)翻譯啟始序列（如Kozak, 1991，J. Biol. Chem. 266 :19867-19870所述）、聚腺苷酸化序列、肽原序列、前肽原序列、啟 動(dòng)子、信號序列以及轉(zhuǎn)錄終止信號。至少，控制序列通常地包含啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄終止信號 (終止子或終止信號）。還可通常地存在翻譯起始和停止信號。控制序列可根據(jù)其具體目 的而加以優(yōu)化。
[0176] 術(shù)語"啟動(dòng)子"在本文中定義為結(jié)合RNA聚合酶并且引導(dǎo)聚合酶至編碼生物化合 物的核酸序列的正確下游轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)從而啟始轉(zhuǎn)錄的DNA序列。RNA聚合酶有效地催化 與編碼區(qū)的適合DNA鏈互補(bǔ)的信使RNA的組裝。還應(yīng)理解，術(shù)語"啟動(dòng)子"包括用于在轉(zhuǎn)錄 成mRNA后翻譯的5'非編碼區(qū)（在啟動(dòng)子與翻譯起點(diǎn)之間）、順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件如增 強(qiáng)子，以及能夠與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的其它核苷酸序列。
[0177] 通常地進(jìn)行本發(fā)明的方法，使得表達(dá)盒的元件在骨架進(jìn)入載體中進(jìn)行組裝，這 樣使得它們處于可操作連接。術(shù)語"可操作連接（operable linkage)"或"可操作連接 (operably linked) "等在本文中定義為以下構(gòu)型，其中控制序列被適當(dāng)?shù)胤胖迷谙鄬τ?DNA序列的編碼序列的位置處，這樣使得控制序列引導(dǎo)mRNA或多肽的產(chǎn)生。
[0178] 因此，在本發(fā)明的背景下的元件為表達(dá)盒的任何組成部分。元件的組為可一起產(chǎn) 生表達(dá)盒的元件的組。本發(fā)明的方法需要提供兩組元件序列。這意味著提供足夠的元件以 使得可產(chǎn)生至少兩種不同的表達(dá)盒。這暗含必須提供至少兩種不同種類的至少一種元件。 也就是說，出于本發(fā)明的目的，一種啟動(dòng)子與兩種0RF以及兩種終止信號相組合構(gòu)成兩組 元件序列。
[0179] 在本發(fā)明的方法中，通常地元件序列組中的至少兩組包含啟動(dòng)子元件、開放閱讀 框架元件以及終止信號元件。
[0180] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，元件組中的一組或更多組可包含"部分"元件序列，如 UTR、信號肽以及分開的（split)開放閱讀框架。
[0181] 按一種形式提供每組元件序列以使得所述組可在骨架進(jìn)入載體中組裝成功能性 表達(dá)盒。因此通常地，各元件在兩側(cè)側(cè)翼為IIs型限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，之后是其識別 位點(diǎn)，所述IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)被選擇成使得所述元件序列的組可 組裝成功能性表達(dá)盒。各元件序列和側(cè)翼序列因此通常地按順序從一端到另一端包含：IIs 型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)；其切割位點(diǎn)；元件序列；IIs型限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；其 識別位點(diǎn)。
[0182] 因此，在合適載體中制備或提供的所述元件的組，其具有IIs型限制核酸內(nèi)切酶 識別位點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)化的切割位點(diǎn)（優(yōu)選4 bp)所述位點(diǎn)被選擇成使得例如使用單鍋法（如 Golden gate克?。┙M裝后，形成功能性表達(dá)盒。
[0183] 制備或提供骨架進(jìn)入載體的組。這些載體含有適于使用序列同源性進(jìn)行組裝的左 和右連接物序列，以用于在（參見圖1和圖2的水平1)組裝模塊式盒。
[0184] 更詳細(xì)來說，各骨架進(jìn)入載體通常地按以下這種順序包含：（i)限制酶切割位點(diǎn) 與其識別位點(diǎn)，和第一連接物序列（LF) ;(ii)包含可選擇標(biāo)記基因的載體骨架；以及（iii) 第二連接物序列（RF)，和限制酶識別位點(diǎn)與其切割序列；以及（iv)任選地，在（i)和（iii) 的識別位點(diǎn)之間的插入物，任何骨架進(jìn)入載體上的連接物序列RF和LF被選擇成使得其可 分別與相同或不同骨架進(jìn)入載體上的LF或RF連接物序列組裝。
[0185] 選擇元件序列的亞組與骨架（bbn)進(jìn)入載體。可例如使用Golden Gate克隆將它 們進(jìn)行組裝，從而產(chǎn)生包含在骨架進(jìn)入載體中的功能性表達(dá)盒。
[0186] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中，每組中的元件被限定成使得按預(yù)定順序組裝表達(dá)盒。另 夕卜，骨架進(jìn)入載體中的連接物序列還被選擇成使得表達(dá)盒可按預(yù)定順序組裝。
[0187] 用于在靶位點(diǎn)處進(jìn)行整合的左和右側(cè)翼（參見圖1和圖2的水平2)可通過骨架 進(jìn)入載體本身來提供，或可作為另外的序列來添加?？山?jīng)由PCR反應(yīng)提供整合序列，其中它 們是所用引物的一部分。
[0188] 在水平2,在適合的宿主細(xì)胞中發(fā)生功能性表達(dá)盒與整合側(cè)翼（int)和含有用于 體內(nèi)組裝的連接物（con)序列的可能的其它DNA序列的體內(nèi)組裝并且在靶位點(diǎn)處重組。
[0189] 通常地，可通過PCR反應(yīng)從由水平1得到的載體回收待組裝的所有DNA部分，以供 在水平2使用，或例如使用經(jīng)由適合的IIs限制酶以及其設(shè)計(jì)在con-載體外側(cè)的識別位點(diǎn) 切出這些片段的方法，并且切割在其間包含DNA序列的con-載體。
[0190] 圖1中的選項(xiàng)a和b均提供用于在靶位點(diǎn)處組裝模塊式盒的方案。在選項(xiàng)b中， 添加另外的左和右整合位點(diǎn)用于第二宿主。選項(xiàng)b之后可以是水平3。
[0191] 在水平3 (參見圖1和圖2)，可例如經(jīng)由PCR反應(yīng)或其它方法從2b回收模塊式盒 (或部分）。所回收的DNA用于轉(zhuǎn)化，并且隨后在第二宿主在靶位點(diǎn)處整合模塊式DNA盒。
[0192] 在本發(fā)明的方法中，連接物序列使得能夠在來自不同骨架進(jìn)入載體的表達(dá)盒之間 進(jìn)行重組。所述序列的長度可改變，這取決于待進(jìn)行的組裝的類型，即體內(nèi)或體外，和/或 其中發(fā)生重組的種類。體內(nèi)重組的連接物將通常地為約20bp至約500bp長，例如約25bp 長（例如，在酵母的情況下）。例如，待在吉布森反應(yīng)中體外重組的連接物長度可為約9bp、 10bp、llbp、12bp、13bp、14bp、15bp 或更長。
[0193] 為了促進(jìn)在所靶向的位點(diǎn)處的所靶向整合并且確保組裝，提供用于整合的連接物 序列。所述序列長度可為至少約20bp、至少約30bp、至少約50bp、至少約0. 1 kb、至少約 0. 2kb至至少約0. 5 kb、至少約1 kb、至少約2 kb，或至少約5kb。
[0194] 圖3示出水平1的組裝選項(xiàng)（但不限于這些），其中第iii項(xiàng)為在切割和連接后使 用優(yōu)選地單一 IIs型核酸內(nèi)切酶和4 bp伸出序列來組裝功能性表達(dá)盒的優(yōu)選方法。ii.示 出開放閱讀框架可分開成信號序列和開放閱讀框架的獨(dú)立部分，或i.以及多個(gè)片段形式 的開放閱讀框架，這例如是由于蛋白質(zhì)的大小或模塊式特征，例如具有獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域的酶 像PKS、NRPS、纖維素等，或僅僅由于大小或出于蛋白質(zhì)工程目的，以便產(chǎn)生orf部分的文庫 序列。第iv項(xiàng)不出分開成3片以用于orf。第v項(xiàng)不出啟動(dòng)子分開成啟動(dòng)子，其中單獨(dú)添 加基因的5'UTR部分。應(yīng)注意，這些為實(shí)例，并且基本上可設(shè)計(jì)多部分的分開DNA序列并且 使用IIs型系統(tǒng)連接，以產(chǎn)生無痕的DNA序列。在所示情況下，在蛋白質(zhì)的蛋氨酸起點(diǎn)使用 AATG。此處，啟動(dòng)子序列的最后一個(gè)核苷酸始終修飾為A。選擇TAAA來橋接終止子，其中在 TAA修飾基因的終止密碼子，并且終止子序列的第一位置用A修飾或在5'延伸A。應(yīng)注意， 為有效使用Golden Gate (或其它依賴于IIs型的克隆系統(tǒng)），優(yōu)選（使得）所有序列不含 用于切割的限制酶的識別位點(diǎn)。
[0195] 圖4針對骨架（bbn)載體變體的連接物（con)部分示出這些載體。第v項(xiàng)示出通 常地應(yīng)用來在水平1 (圖1和圖2)用指定的（但不限于）給定4 bp連接物產(chǎn)生功能性表達(dá) 盒的變體。第iv項(xiàng)和第ii項(xiàng)提供bbn載體變體，其中連接物中的一個(gè)被分別用于在革巴位 點(diǎn)處進(jìn)行整合的左和右整合側(cè)翼置換或與其組合。第ii項(xiàng)和第i項(xiàng)為變體，其中僅左或右 連接物為骨架的一部分。這些通常地為僅可用在模塊式盒的末端的，例如以與整合側(cè)翼一 起使用，并且在載體中儲(chǔ)存這些。第vi項(xiàng)示出可在用于插入元件序列的IIs型限制位點(diǎn)內(nèi) 使用逆選擇標(biāo)記物用于Golden Gate克?。ɑ蚱渌?yīng)注意，所述方法不限于使用Bsal 作為IIs型限制酶，也不限于使用IIS限制酶，只要由限制得到的側(cè)翼與待插入的單一或模 塊式元件或int/側(cè)翼序列的側(cè)翼相容即可。
[0196] 在本發(fā)明的方法中，可組裝多個(gè)表達(dá)盒，每個(gè)盒包含生物途徑成員。如本文所用， 術(shù)語"途徑"應(yīng)廣泛解釋，并且可指一系列同時(shí)、連續(xù)或單獨(dú)的化學(xué)反應(yīng)，其通過經(jīng)由一個(gè)或 更多個(gè)中間物將底物或開始元件轉(zhuǎn)化成終末化合物或期望產(chǎn)物的活性來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施 方式中，活性有時(shí)是將底物轉(zhuǎn)化為中間物或產(chǎn)物（例如，通過酶催化轉(zhuǎn)化）并且有時(shí)是結(jié)合 分子或配體。如本文所用，術(shù)語"一致途徑"是指來自相關(guān)或不相關(guān)生物體的、具有相同數(shù) 量和類型的活性并且產(chǎn)生相同的終末產(chǎn)物的途徑。如本文所用，術(shù)語"相似途徑"是指來自 相關(guān)或不相關(guān)生物體的、具有以下一項(xiàng)或多項(xiàng)的途徑：不同數(shù)量的活性、不同類型的活性、 利用相同起始或中間分子，和/或產(chǎn)生相同終末產(chǎn)物。
[0197] 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在至少一組元件中的至少一種元件 的變體被提供成使得產(chǎn)生至少一種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式表達(dá)盒的變體。
[0198] 以此方式，可例如通過利用天然存在的遺傳多樣性和/或改造的遺傳多樣性來實(shí) 現(xiàn)途徑改善和優(yōu)化?？赏ㄟ^測試來自不同生物體的多核苷酸亞組來利用天然存在的遺傳多 樣性。可通過測試?yán)缫呀?jīng)密碼子優(yōu)化或突變的多核苷酸亞組來利用改造的遺傳多樣性。 對于密碼子優(yōu)化的多樣性，氨基酸密碼子三聯(lián)體可替換為其它密碼子和/或可添加、去除 或替換某些核苷酸序列。例如天然密碼子可替換為更或更不優(yōu)選的密碼子。在某些實(shí)施方 式中，可通過將相關(guān)或相似的活性替換為來自相似但不一致的途徑的一個(gè)或多個(gè)步驟來優(yōu) 化途徑。亞組中的多核苷酸還可遺傳改變，以使得當(dāng)編碼時(shí)，實(shí)現(xiàn)不同于天然對應(yīng)物的活性 的活性，所述天然對應(yīng)物用作起始材料用于遺傳改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員改變的核酸和/或 氨基酸序列可稱為"改造的"遺傳多樣性。
[0199] 任何給定元件的所有變體可全部彼此共有至少約50%序列一致性。
[0200] 代謝途徑可視為一系列反應(yīng)步驟，這些步驟將開始底物或元件轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物。 各步驟可通過一種或更多種活性來催化。在其中底物A轉(zhuǎn)化為終末產(chǎn)物D的途徑中，中間 物B和C產(chǎn)生并且通過所述途徑中的特定活性轉(zhuǎn)化。途徑的各特定活性可視為一個(gè)種類的 活性亞組，并且編碼所述活性的多肽可視為一個(gè)種類的對應(yīng)多肽亞組。
[0201] 任何肽、多肽或蛋白質(zhì)或通過一個(gè)或更多個(gè)肽、多肽或蛋白質(zhì)催化的活性可通過 多核苷酸亞組來編碼。代表性蛋白質(zhì)包括酶（例如代謝途徑的部分或全部）、抗體、血清蛋 白（例如白蛋白）、膜結(jié)合蛋白、激素（例如生長激素、紅細(xì)胞生成素、胰島素等）、細(xì)胞因子 等，并且包括天然存在的與外源表達(dá)的多肽。代表性活性（例如，功能上相關(guān)聯(lián)以在代謝途 徑中提供活性或活性組的酶或酶的組合）包括與期望代謝途徑相關(guān)聯(lián)的任何活性。如本文 所用，術(shù)語"酶"可指充當(dāng)催化劑以誘導(dǎo)其它化合物的化學(xué)變化、進(jìn)而由一種或更多種底物 產(chǎn)生一種或更多種產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。
[0202] 應(yīng)理解，在本文所呈現(xiàn)的實(shí)施方式中描述的方法和組合物可用于（i)優(yōu)化產(chǎn)生期 望終末產(chǎn)物的任何代謝途徑；和/或（ii)優(yōu)化代謝途徑的活性亞組內(nèi)的亞結(jié)構(gòu)域。如本 文所用，術(shù)語"蛋白質(zhì)"指具有由肽鍵連接的氨基酸序列的分子。這個(gè)術(shù)語包括融合蛋白、 寡肽、肽、環(huán)狀肽、多肽以及多肽衍生物，無論是天然的還是重組的，并且還包括其片段、衍 生物、同源物以及變體。蛋白質(zhì)或多肽有時(shí)是胞內(nèi)起源（例如體內(nèi)位于宿主細(xì)胞的核內(nèi)、細(xì) 胞質(zhì)內(nèi)或間質(zhì)間隙內(nèi)）并且有時(shí)為體內(nèi)細(xì)胞膜蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中（以上所述，并 且以下在改造與改變方法中進(jìn)一步詳細(xì)描述），遺傳修飾可導(dǎo)致靶標(biāo)活性的改變（例如，增 大、基本增大、下降或基本下降）。
[0203] 在本發(fā)明的方法中，所用表達(dá)盒可構(gòu)成生物學(xué)途徑，該途徑使得能夠在宿主細(xì)胞 中產(chǎn)生目的化合物。目的化合物為初級代謝物、次級代謝物、多肽或多肽的混合物。
[0204] 因此，本發(fā)明的方法可在水平1以模塊式形式使用（參見圖5)。通過從水平0選 擇多個(gè)元件并且用在單鍋Golden Gate(或其它）克隆反應(yīng)中使用，產(chǎn)生待在水平2(圖1 或2)用作文庫的功能性表達(dá)盒的文庫，并且可與圖6的步驟2組合。
[0205] 所述方法可在水平2以模塊式形式使用（例如，在如圖1闡述的方法中）。因此， 功能性表達(dá)盒的文庫可被添加待經(jīng)由體內(nèi)組裝和重組組裝的一個(gè)或更多個(gè)模塊，從而產(chǎn)生 在靶位點(diǎn)處含有多樣的模塊式DNA盒的宿主細(xì)胞的文庫（參見圖6)。任選地，可在水平3 回收所述文庫。
[0206] 所述模塊式方法水平2可在水平2以中間體外步驟來進(jìn)行（例如在如圖2所闡述 的方法中）。因此，功能性表達(dá)盒的文庫可添加待經(jīng)由體外組裝組裝的一個(gè)或更多個(gè)模塊 (參見圖7)。這個(gè)步驟可通過所得（并且可能回收的）多部分DNA序列的體內(nèi)組裝來進(jìn)行， 從而產(chǎn)生在靶位點(diǎn)處含有多樣的模塊式DNA盒的宿主細(xì)胞的文庫。任選地，可在水平3回 收所述文庫。
[0207] 在水平2 (參見圖8(A)-(E))的使用具有獨(dú)特至少25 bp連接物序列的相同骨架 (bbn)載體的多個(gè)變體可應(yīng)用來體內(nèi)產(chǎn)生敲除或整合構(gòu)建體。水平1示出水平0的不同元 件（但不限于此）可如何插入骨架載體（還參見圖4)，可組裝來產(chǎn)生側(cè)翼為用于按規(guī)定順 序在水平2進(jìn)行體內(nèi)組裝所要求的一個(gè)或兩個(gè)連接物序列的模塊式元件。這些獨(dú)特連接物 使得有可有效地再利用這些元件載體并且允許按組合方式直接或作為文庫進(jìn)行利用，以產(chǎn) 生例如涵蓋多個(gè)基因的DNA伸展序列的敲除，或在具有int-L和int-R序列的文庫中使用 (水平2C)，以產(chǎn)生在宿主細(xì)胞中具有減少的質(zhì)粒、染色體或其它DNA片的宿主細(xì)胞的文庫。 通常地，將應(yīng)用功能性標(biāo)記物盒與至少一個(gè)int-L和一個(gè)int-R序列（按所述順序處于靶 位點(diǎn)處，但不一定連接）。
[0208] 以下為數(shù)種策略（但不限于此）：(A)產(chǎn)生標(biāo)記物的插入以置換靶位點(diǎn)處的orf ; (B)產(chǎn)生標(biāo)記物的插入以置換靶位點(diǎn)處的由int-L和int-R限定的所選擇DNA部分；（C)產(chǎn) 生標(biāo)記物的插入以置換靶位點(diǎn)處的由作為文庫添加的int-L和int-R序列的組合可能性限 定的所選擇DNA部分，從而導(dǎo)致小至較大的DNA部分被置換，這取決于選擇用于至少一種染 色體、質(zhì)?；蚱渌袠?biāo)DNA的int-L與int-R序列最大距離；(D)示出部分（B)可被改變來 在靶位點(diǎn)處插入特定元件或其部分。這可應(yīng)用來以標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式方式，通過合理設(shè)計(jì)或 作為文庫方法交換蛋白質(zhì)中的信號序列、啟動(dòng)子、5'UTR或模塊式部分?？赡艿膶?shí)例為啟動(dòng) 子調(diào)諧，或另一種模塊式蛋白像NRPS、PKS、纖維素酶以及其它模塊式蛋白等的變體的產(chǎn)生； (E)示出當(dāng)使用多于一種的標(biāo)記物和第二組與第一組不相容的連接物序列時(shí)，可一次進(jìn)行 多個(gè)動(dòng)作。
[0209] 應(yīng)注意對于（D)，int-R需要與靶位點(diǎn)正確匹配，從而不擾亂原始閱讀框架。
[0210] 當(dāng)然，圖8所示的方法可與圖1或圖2所示的方法組合來使一個(gè)或更多個(gè)模塊式 DNA盒插入到一個(gè)或更多個(gè)靶位點(diǎn)，同時(shí)如圖8所述、作為一個(gè)或更多個(gè)預(yù)定序列或作為文 庫方法（圖5-7)，將標(biāo)記物插入在第二位置并去除或插入DNA序列。
[0211] 因此，本發(fā)明提供一般2步途徑構(gòu)筑法，其為快速、有效且靈活的方法，這是由于 用于golden gate克隆的標(biāo)準(zhǔn)化的遺傳元件與提供用于體內(nèi)重組的同源性的標(biāo)準(zhǔn)化的連接 物相組合。
[0212] 本發(fā)明因此提供用于在靶位點(diǎn)處整合核酸序列的方法。
[0213] 所述用于在靶位點(diǎn)處整合DNA序列的方法包括：
[0214] a.提供：（i) 一組至少約200個(gè)堿基對長的至少兩個(gè)左（int-L)和兩個(gè)右（int-R) 整合序列，用于同源重組至宿主細(xì)胞中的至少一個(gè)靶位點(diǎn)，其中：
[0215] 所述左（int-L)序列側(cè)翼為一個(gè)至少約25個(gè)堿基對的連接物序列；
[0216] 所述右（int-R)序列側(cè)翼為一個(gè)至少約25個(gè)堿基對的連接物序列；以及
[0217] (ii)至少一個(gè)表達(dá)盒，其在兩側(cè)側(cè)翼為至少約25個(gè)堿基對的連接物序列；以及
[0218] b.通過在int-L和int-R序列的同源革巴位點(diǎn)處重組來體內(nèi)組裝來自步驟（a)的至 少三個(gè)序列的組，以使得至少一個(gè)左和至少一個(gè)右整合序列按照這種順序處于所述宿主細(xì) 胞的祀位點(diǎn)處，
[0219] 其中體內(nèi)組裝后，至少一個(gè)表達(dá)盒存在于靶位點(diǎn)處，任選地所述表達(dá)盒能夠表達(dá) 功能性標(biāo)記物。
[0220] 在所述方法中，至少一個(gè)表達(dá)盒可經(jīng)由兩種或更多種核酸序列在步驟（b)中組 裝，從而產(chǎn)生例如含有標(biāo)記物多肽編碼0RF的至少一個(gè)功能性表達(dá)盒。
[0221] 所述方法可包括：
[0222] a.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式表達(dá)盒，其中
[0223] i.所述int-L和int-R序列為啟動(dòng)子、orf或終止子序列的一部分；
[0224] ii.所述RF和LF連接物序列包含至少25個(gè)堿基對的同源重組序列；以及
[0225] iii.任何骨架進(jìn)入載體上的RF和LF序列被選擇成使得其可分別與LF或RF連接 物序列、與相同或不同骨架進(jìn)入載體和/或與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列通過體內(nèi)重組進(jìn)行組裝； 以及
[0226] b.從包含LF和RF序列的所述骨架進(jìn)入載體回收表達(dá)盒；以及
[0227] c.在宿主細(xì)胞中在所述靶位點(diǎn)處將所回收的表達(dá)盒彼此體內(nèi)重組。
[0228] 用于在靶位點(diǎn)處整合DNA序列的方法可包括：選擇兩個(gè)或更多個(gè)int-L和兩個(gè)或 更多個(gè)int-R序列，用于在一個(gè)體內(nèi)組裝和重組反應(yīng)中使用，從而產(chǎn)生多個(gè)宿主細(xì)胞，所述 細(xì)胞具有通過所選擇的int-L和int-R序列祀向至少2個(gè)允許的組合的DNA組合，其中：
[0229] i.至少兩個(gè)int-L序列在所述靶標(biāo)DNA序列處在至少一個(gè)int-R序列的左側(cè)；或
[0230] ii.至少兩個(gè)int-R序列在所述靶標(biāo)DNA序列處在至少一個(gè)int-L序列的右側(cè)。
[0231] 在這些方法中，第二功能標(biāo)記物盒可整合在第二靶位點(diǎn)處。因此所述方法可用于 產(chǎn)生雙重或三重突變體，或含有4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)突變的突變體。
[0232] 所述方法可產(chǎn)生一起處于所述靶位點(diǎn)處的功能基因或功能基因組的功能性敲除 或下調(diào)。也就是說，本發(fā)明可用于在靶位點(diǎn)處進(jìn)行基因的缺失或敲除或敲低。
[0233] 在本發(fā)明的所述方法中，至少一個(gè)int-R序列可與開放閱讀框架的至少開始200 個(gè)堿基對同源，并且在左側(cè)功能性聯(lián)接至待插入在開放閱讀框架之前的DNA序列，從而使 得開放閱讀框架具有至少50個(gè)堿基對的修飾的5' UTR序列。這使得能夠插入新的啟動(dòng)子 和/或置換信號序列。
[0234] 最優(yōu)選為以下IIs型限制核酸內(nèi)切酶：Bsal、Bbsl、BsmBI、Sapl、BspMI、Aarl、 Esp31、Bpil以及Hgal。許多列舉的限制核酸內(nèi)切酶可從New England Biolabs獲得。這 些酶的來源還可見以上所述的REBASE網(wǎng)頁。
[0235] 待用于本發(fā)明的連接酶的實(shí)例包括T4 DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶、Taq DNA 連接酶，全部可從New England Biolabs商購獲得。
[0236] 適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞可包括以下特點(diǎn)中的一個(gè)或更多個(gè)：需氧菌、厭氧菌、絲 狀、非絲狀、單倍體、二倍體、營養(yǎng)缺陷型和/或非營養(yǎng)缺陷型。
[0237] 適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞可為原核微生物（例如細(xì)菌）或非原核微生物。適合的 宿主細(xì)胞可為真核微生物（例如酵母、真菌、變形蟲以及藻類）。適合的宿主細(xì)胞可來自非 微生物來源，例如哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞。
[0238] "真菌"在本文中定義為真核微生物并且包括所有真菌亞門的物種（Alexopoulos， C.J.，1962，見 introductory Mycology，John Wiley&Sons，Inc. , New York)。術(shù)語 真菌因此包括絲狀真菌和酵母。"絲狀真菌"在本文中定義為包括所有絲狀形式的真 菌亞門和卵菌門的真核微生物（如上文的Hawksworth等人，1995所定義）。絲狀真 菌的特征在于菌絲體壁由殼聚糖、纖維素、葡聚糖、甲殼質(zhì)、甘露聚糖以及其它復(fù)雜的 多糖構(gòu)成。營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長，并且碳分解代謝是強(qiáng)制好氧的。絲狀真菌菌株 包括但不限于以下菌株：枝頂孢屬（Acremonium)、曲霉屬（Aspergi 1 lus)、短梗霉屬 (Aureobasidium)、隱球菌屬（Cryptococcus)、Filibasidium、鍊抱屬（Fusarium)、腐質(zhì)霉 屬（Humicola)、稻痕菌屬（Magnaporthe)、毛霉屬（Mucor)、毀絲霉屬（Myceliophthora)、 新美鞭菌屬（Neocallimastix)、脈抱菌屬（Neurospora)、擬青霉屬（Paecilomyces)、 青霉屬（Penicillium)、梨囊鞭菌屬（Piromyces)、裂裙菌屬（Schizophyllum)、籃狀菌 屬（Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus)、草根霉屬（Thielavia)、彎頸霉屬 (Tolypocladium)以及木霉屬（Trichoderma)。
[0239] "酵母"在本文中定義為真核微生物，并且包括主要以單細(xì)胞形式生長的真菌亞門 的所有物種。酵母可通過單細(xì)胞菌體的出芽生長或可通過生物體的裂體生長。
[0240] 根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選為真菌宿主細(xì)胞，其中真菌在本文中定義如上。優(yōu) 選的真菌宿主細(xì)胞為如下所述用于工業(yè)發(fā)酵過程以供生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的真菌。很多種類 的絲狀真菌以及酵母用于所述過程中。優(yōu)選的絲狀真菌宿主細(xì)胞可選自以下屬：曲霉 屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬、枝頂孢屬、錸孢屬、根霉屬（Rhizopus)、被孢霉屬（Mortierella)、 青霉屬、毀絲霉屬（Myceliophthora)、金孢子菌屬（Chrysosporium)、毛霉屬、類殼屬 (Sordaria)、脈孢菌屬、糞殼菌屬（Podospora)、紅曲霉屬（Monascus)、傘菌屬（Agaricus)、 密孔菌屬（Pycnoporus)、裂槽菌屬（Schizophylum)、栓菌屬（Trametes)以及黃孢原毛平 革菌屬（Phanerochaete)。可用作宿主細(xì)胞、例如參考宿主細(xì)胞以便比較轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化 細(xì)胞的發(fā)酵特征的優(yōu)選真菌菌株包括例如黑曲霉（Aspergillus niger)CBS120. 49、CBS 513. 88,米曲霉（Aspergillus oryzae)ATCC16868、ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、 ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892,煙曲菌（Aspergillus fumigatus) AF293(CBS101355)，黃青霉 CBS 455. 95、橘青霉（Penicillium citrinum)ATCC 38065、 黃青霉 P2，頂頭抱霉（Acremonium chrysogenum)ATCC 36225、ATCC 48272，里氏木霉 (Trichoderma reesei)ATCC 26921、ATCC 56765、ATCC 26921，醬油曲霉（Aspergillus sojae)ATCC 11906，Chrysosporium lucknowense ATCC44006 以及所有這些菌株的衍生物。 特別優(yōu)選作為絲狀真菌宿主細(xì)胞的是黑曲霉CBS 513.88以及其衍生物。
[0241] 任何適合的酵母可選擇作為宿主細(xì)胞。優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞可選自以下屬：酵母 屬（Saccharomyces)(例如釀酒酵母、貝酵母（S.bayanus)、巴氏酵母（S.pastorianus)、卡 氏酵母（S.carlsbergensis))、克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces)、假絲酵母屬（Candida) (例如C. revkaufi、鐵紅假絲酵母（C. pulcherrima)、熱帶假絲酵母（C. tropicalis)、產(chǎn)朊 假絲酵母（C. utilis))、畢赤酵母屬（Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母（P. pastoris))、裂殖 酵母屬（Schizosaccharomyces)、漢森酵母屬（Hansenula)、克勒克酵母屬（Kloeckera)、 許旺酵母屬（Schwanniomyces)以及耶羅威亞酵母屬（Yarrowia)(例如解脂耶羅威亞酵母 (Y.lipolytica)(先前歸類為解脂假絲酵母菌（Candida lipolytica))。
[0242] 任何適合的原核生物可選擇作為宿主細(xì)胞?？蛇x擇革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì) 菌。細(xì)菌的實(shí)例包括但不限于桿狀細(xì)菌（例如枯草芽孢桿菌（B.subtilis)、禾谷巨大芽 抱桿菌（B.megaterium))、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter bacteria)、諾卡氏菌（Norcardia baceteria)、黃色桿菌（Xanthobacter bacteria)、弗氏埃希菌（Escherichia bacteria) (例如大腸桿菌（例如菌株 DH 1 0B、Stbl2、DH5- α、DB3、DB3. 1)、DB4, DB5、JDP682 以及 ccdA-over (例如美國申請No. 09/518, 188)))、鏈霉菌、歐文氏菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌 (例如粘質(zhì)沙雷氏菌（S.marcessans))、假單胞菌（例如銅綠假單胞菌（P. aeruginosa))、 沙門氏菌（例如鼠沙門氏傷寒桿菌（S.typhimurium)、傷寒桿菌（S.typhi))。細(xì)菌還包 括但不限于光合細(xì)菌（例如綠色非硫細(xì)菌（例如綠彎菌（例如C. aurantiacus)、綠絲 菌（例如C. gigateum))，綠色硫菌（例如綠硫細(xì)菌（例如C. limicola)、突柄綠菌（例如 P. luteolum))，紫色硫菌（例如紫硫細(xì)菌（例如傲氏著色菌（C. okenii)))以及紫色非硫菌 (例如紅螺菌（例如深紅紅螺菌（R. rubrum))、紅細(xì)菌（例如類球紅細(xì)菌（R. sphaeroides)、 莢膜紅細(xì)菌（R. capsulatus))以及紅微菌（例如R. vanellii))。
[0243] 來自非細(xì)菌生物的細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞。所述細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于昆蟲細(xì)胞 (例如果蠅（例如黑腹果蠅（D.melanogaster))、灰夜蛾（例如草地貪夜蛾（S. frugiperda) Sf9或Sf21細(xì)胞）以及粉斑蛾（例如High-Five細(xì)胞）；線蟲細(xì)胞（例如秀麗隱桿線蟲 (C. elegans)細(xì)胞）；禽類細(xì)胞；兩棲動(dòng)物細(xì)胞（例如非洲爪蟾（Xenopus laevis)細(xì)胞）；爬 蟲類動(dòng)物細(xì)胞；以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞（例如NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、 Bowes黑色素瘤以及HeLa細(xì)胞）。
[0244] 在本發(fā)明中適用作宿主細(xì)胞的微生物或細(xì)胞可商購獲得。
[0245] 真核細(xì)胞具有至少兩個(gè)獨(dú)立的途徑（一個(gè)經(jīng)由同源重組（HR)，并且一個(gè)經(jīng)由非同 源重組（NHR))，通過這兩個(gè)途徑核酸（特別是DNA)可整合到宿主基因組中。釀酒酵母為優(yōu) 先同源重組（HR)的生物體。此生物體的非同源與同源重組的比率（NHR/HR)可在約0.07 至0.007之間變化。
[0246] W0 02/052026公開釀酒酵母的突變體，其具有改善的DNA序列靶向到其基因組的 效率。所述突變體株缺乏NHR中涉及的基因（KU70)。
[0247] 與釀酒酵母不同，最高等的真核生物如絲狀真菌細(xì)胞至哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)先NHR。在 絲狀真菌中，NHR/HR比率在1與大于100之間的范圍內(nèi)。在所述生物體中，靶向的整合頻 率相當(dāng)?shù)汀?br> [0248] 這樣，為改善多核苷酸在靶位點(diǎn)組裝的效率，優(yōu)選在根據(jù)本發(fā)明的方法中提高宿 主細(xì)胞中同源重組（HR)的效率。
[0249] 因此，優(yōu)選地在根據(jù)本發(fā)明的方法中，宿主細(xì)胞的同源重組（HR)的效率被優(yōu)選地 誘導(dǎo)型地增大。
[0250] 因?yàn)镹HR與HR途徑互相關(guān)聯(lián)，因此HR的效率可通過調(diào)節(jié)一個(gè)或兩個(gè)途徑來增大。 增大HR部件的表達(dá)將增大HR的效率，并且降低NHR/HR的比率。降低NHR部件的表達(dá)也將 降低NHR/HR的比率。根據(jù)本發(fā)明的載體-宿主系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中HR效率的增大優(yōu)選描述 為NHR/HR比率的降低，并且優(yōu)選相對于親本宿主細(xì)胞來進(jìn)行計(jì)算，在所述親本細(xì)胞中HR和 /或NHR途徑未經(jīng)過調(diào)節(jié)。HR與NHR的效率可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可用的不同方法來 測量。優(yōu)選方法包括測定單一載體構(gòu)建體在親本與經(jīng)過調(diào)節(jié)的宿主細(xì)胞中的靶向整合和異 位整合的效率。然后可針對兩種細(xì)胞類型技術(shù)NHR/HR的比率。隨后，可計(jì)算NHR/HR比率 的下降。在W02005/095624中，全面描述了這種優(yōu)選方法。
[0251] 與親本細(xì)胞相比，具有降低的NHR/HR比的宿主細(xì)胞可通過增大HR途徑的效率和 /或通過增大NHR途徑的效率來修飾基本真核細(xì)胞來獲得。優(yōu)選地，NHR/HR比率因而降低 至少兩倍、優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選至少10倍。優(yōu)選地，與親本宿主細(xì)胞相比，在根據(jù)本發(fā)明 的載體-宿主系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中NHR/HR比率降低至少5%、更優(yōu)選至少10%、甚至更優(yōu)選 至少20 %、甚至更優(yōu)選至少30 %、甚至更優(yōu)選至少40 %、甚至更優(yōu)選至少50 %、甚至更優(yōu)選 至少60%、甚至更優(yōu)選至少70%、甚至更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%并且最優(yōu)選 至少100%。
[0252] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，通過增大HR部件的表達(dá)水平降低NHR/HR的比率。HR部件為 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。HR部件在本文中定義為在控制多核苷酸靶向整合到宿主的 基因組中涉及的所有基因和元件，所述多核苷酸與宿主基因組的某預(yù)定位點(diǎn)具有一定同源 性，其中整合是靶向的。
[0253] 可通過降低NHR部件的表達(dá)水平來降低NHR/HR的比率。NHR部件在本文中定義 為在控制多核苷酸整合到宿主的基因組中涉及的所有基因和元件，而不考慮所述多核苷酸 與宿主的基因組序列的同源性程度。NHR部件為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。優(yōu)選的NHR 部件為選自以下的部件：在NHR途徑中涉及的酵母基因的根據(jù)本發(fā)明的載體-宿主系統(tǒng)的 宿主細(xì)胞的同源物或直向同源物：KU70、KU80、RAD50、MRE11、XRS2、LIG4、LIF1、NEJ1以及 SIR4 (van den Bosch 等人，2002, Biol. Chem. 383 :873-892 ;以及 Allen 等人，2003，]?〇1· Cancer Res. 1 :913-920)。最優(yōu)選為以下中的一個(gè)：KU70、KU80 和 LIG4,以及 KU70 與 KU80 二者?？墒褂萌绫疚乃龅挠糜讷@得必要基因的缺乏的方法實(shí)現(xiàn)NHR部件的表達(dá)水平的降 低。
[0254] 由于降低NHR中涉及的部件的表達(dá)有可導(dǎo)致不利表型作用，因此優(yōu)選在根據(jù)本發(fā) 明的載體-宿主系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中，同源重組效率的增大是可誘導(dǎo)的。這可通過所屬領(lǐng)域 的技術(shù)人員已知的方法來實(shí)現(xiàn)，例如通過使用針對NHR部件的可誘導(dǎo)過程（例如，通過將 NHR部件放置在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子之后）或通過使用NHR部件的瞬時(shí)破壞，或通過將編碼NHR部 件的基因放回到基因組中。
[0255] 在本發(fā)明中，可使用標(biāo)記物基因（或選擇標(biāo)記物或標(biāo)記物等）?？墒褂萌魏芜m合的 標(biāo)記物基因，并且熟知所述基因是用來確定核酸是否包含在細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明制備的組 裝的多核苷酸可包含兩種或更多種標(biāo)記物基因，其中在一種標(biāo)記物基因在一種生物體中有 效地起作用，并且另一種標(biāo)記物基因在另一生物體中有效地起作用。
[0256] 標(biāo)記物基因的實(shí)例包括但不限于（1)編碼提供針對否則有毒的化合物的抗性的 產(chǎn)物（例如抗生素）的核酸片段；(2)編碼否則在受體細(xì)胞中缺少的產(chǎn)物（例如必要產(chǎn) 物、tRNA基因、營養(yǎng)缺陷標(biāo)記物）的核酸片段；（3)編碼抑制基因產(chǎn)物的活性的產(chǎn)物的核酸 片段；(4)編碼可易于鑒別的產(chǎn)物（例如表型標(biāo)記物，如抗生素抗性標(biāo)記物（例如β -內(nèi) 酰胺酶）、β_半乳糖苷酶、熒光或其它有色標(biāo)記物，如綠色熒光蛋白（GFP)、黃色熒光蛋白 (YFP)、紅色熒光蛋白（RFP)和青色熒光蛋白（CFP)，以及細(xì)胞表面蛋白）的核酸片段；（5) 結(jié)合否則對細(xì)胞存活和/或功能有害的產(chǎn)物的核酸片段；(6)以其它方式抑制的如以上1-5 中所述的任何核酸片段的活性的核酸片段（例如反義寡核苷酸）；（7)結(jié)合修飾底物的產(chǎn)物 (例如限制內(nèi)切酶）的核酸片段；(8)可用于分離或鑒別期望分子（例如特定蛋白結(jié)合位 點(diǎn)）的核酸片段；(9)編碼否則可為非功能性的特定核苷酸序列（例如，分子亞群的PCR擴(kuò) 增）的核酸片段；（10)當(dāng)不存在時(shí)直接或間接賦予對具體化合物的抗性或敏感性的核酸片 段；（11)編碼在受體細(xì)胞中的有毒或?qū)⑾鄬o毒性的化合物轉(zhuǎn)化為毒性化合物的產(chǎn)物（例 如單純皰疹-胸腺激酶、胞嘧啶脫氨酶）的核酸片段；（12)抑制含有其的核酸分子的復(fù)制、 分割或遺傳力的核酸片段；（13)編碼條件性復(fù)制功能的核酸片段，例如在某些宿主或宿主 細(xì)胞株中或在某些環(huán)境條件下（例如溫度、營養(yǎng)條件等）進(jìn)行復(fù)制；和/或優(yōu)選為以下的必 要基因：尚未示出非必要性的基因，更優(yōu)選地，缺乏致使宿主細(xì)胞不能生存的基因。更優(yōu)選 地，必要基因?yàn)槿狈χ率顾拗骷?xì)胞在所有條件下并且在任何培養(yǎng)基、特別是復(fù)雜（未定義） 培養(yǎng)基上均不能生存的基因。在本發(fā)明的背景下必要基因可為當(dāng)已使得另一（非必要）基 因缺乏時(shí)使得宿主細(xì)胞不能生存的基因。
[0257] 當(dāng)顯示出某一水平的相似性時(shí)，認(rèn)為氨基酸或核苷酸序列是同源的。兩個(gè)序列同 源指示共同進(jìn)化起源。兩個(gè)同源序列是緊密相關(guān)還是更遠(yuǎn)地相關(guān)由分別為高或低的"同 一性百分比"或"相似性百分比"來指示。雖然有爭議，但應(yīng)指出頻繁地可互換地使用"同 一性百分比"或"相似性百分比"、"同源程度"或"同源百分比"。出于本發(fā)明的目的，可使 用數(shù)學(xué)算法完成兩個(gè)序列之間的序列比較和同一性百分比的確定。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 應(yīng)意識到以下事實(shí)：數(shù)種不同的計(jì)算機(jī)程序可用于比對兩個(gè)序列并且測定兩個(gè)序列之間 的同源性（Kruskal，J.B. (1983) An overview of sequence comparison，見 D.Sankoff 和 J. B. Kruskal,(編），Time warps, string edits and macromolecules ：the theory and practice of sequence comparison,第 1-44 頁 Addison Wesley)〇
[0258] 可使用比對兩個(gè)序列的Needleman和ffunsch算法測定兩個(gè)核酸或氨基酸序列之 間的同一性百分比（Needleman，S.B.和 Wunsch，C.D· (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)。 所述算法比對氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已經(jīng)在計(jì)算機(jī)程序 NEEDLE中執(zhí)行。出于本發(fā)明的目的，使用來自EMBOSS包的NEEDLE算法（2. 8. 0版或更高版， EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite) (2000)Rice，P.Longden，I.和 Bleasby，A. Trends in Genetics 16，（6)第 276-277 頁，http ://emboss. bioinformatics· nl/)。對于蛋白質(zhì)序列，EBL0SUM62 可用于取代矩陣。 對于核苷酸序列，可使用EDNAFULL?？芍付ㄆ渌仃?。用于比對氨基酸序列的任選參數(shù)為 空位開放罰分10和空位擴(kuò)展罰分0. 5。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解所有這些不同參數(shù)將得 到略微不同的結(jié)果，但當(dāng)使用不同算法時(shí)兩個(gè)序列的總同一性百分比不會(huì)顯著改變。
[0259] 同源性或同一性為兩個(gè)完整序列之間的在包括任何空位或擴(kuò)展的總比對區(qū)上的 一致匹配的百分比。兩個(gè)比對序列之間的同源性或同一性可計(jì)算如下：比對中在兩個(gè)序列 中示出一致氨基酸或核酸殘基的對應(yīng)位置的數(shù)量除以包括空位的比對的總長度。如本文所 定義的同一性可由NEEDLE獲得并且在程序的輸出中標(biāo)記為"同一性（IDENTITY) "。
[0260] 兩個(gè)比對序列之間的同源性或同一性可計(jì)算如下：比對中在兩個(gè)序列中示出一致 氨基酸或核酸殘基的對應(yīng)位置的數(shù)量除以減去排列中的總空位數(shù)量后排列的總長度。如本 文所定義的一致性可使用N0BRIEF選項(xiàng)由NEEDLE獲得并且在程序的輸出中標(biāo)記為"最長同 一性（longest-identity)，'。
[0261] 序列同一性還可通過在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行的雜交測定來確定。如本文所用，術(shù)語"嚴(yán) 謹(jǐn)條件"是指雜交和洗滌條件。雜交條件為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知，并且可見Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y·，6. 3. 1-6. 3. 6 (1989)。在所述 文獻(xiàn)中描述了水性和非水性方法，并且可使用任一種。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的實(shí)例為在6X氯化鈉 /檸檬酸鈉（SSC)中在約45°C下雜交，接著在0. 2X SSC、0. 1% SDS在50°C下洗滌一次或多 次。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的另一實(shí)例為在6X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中在約45°C下雜交，接著 在0. 2X SSC、0. 1%SDS在55°C下洗滌一次或多次。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的另一實(shí)例為在6X氯 化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中在約45°C下雜交，接著在0.2X SSC、0.1%SDS在60°C下洗滌一 次或多次。通常，嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件為在6X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中在約45°C下雜交，接著 在0. 2X SSC、0. 1%SDS在65°C下洗滌一次或多次。更通常，嚴(yán)謹(jǐn)條件為0. 5 Μ磷酸鈉、7% 305、651：，接著在0.2乂35(：、0.1%305在651：下洗滌一次或多次。
[0262] 本文中對專利文獻(xiàn)或作為現(xiàn)有技術(shù)給出的其它事物的引用不應(yīng)視為承認(rèn)文獻(xiàn)或 事物為已知的或其所含的信息為任一權(quán)利要求的 優(yōu)先權(quán)日:時(shí)的一般常識的一部分。
[0263] 本文闡述的各參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容是以引用的方式全部整合本文中。
[0264] 通過以下實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。 實(shí)施例
[0265] 概沭
[0266] 標(biāo)準(zhǔn)遺傳技術(shù)如酶在宿主細(xì)胞中的過度表達(dá)以及宿主細(xì)胞的另外遺傳修飾 在所屬領(lǐng)域中是已知的方法，如在Sambrook和Russel (2001)" Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第三版），Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press ;或 F. Ausubel 等人編，"Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)中所述。
[0267] 從酵母分離染色體DNA
[0268] 使酵母細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)振蕩器中在含2%葡萄糖的YEP培養(yǎng)基中生長（過夜、在30°C 和280 rpm)。將1.5 ml這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至埃彭道夫離心管（eppendorf tube)并且在 最大速度下離心1分鐘。傾倒出上清液并且使沉淀再懸浮在200 μ 1 YCPS(含0.1 % SB3-14(Sigma Aldrich，荷蘭）的 10 mM Tris.HCl pH 7.5、1 mM EDTA)以及 Ιμ? 核糖核 酸酶（20 mg/ml核糖核酸酶Α，來自牛胰腺，Sigma，荷蘭）中。將細(xì)胞懸浮液在65°C下孵育 10分鐘。將懸浮液在埃彭道夫離心機(jī)中在7000 rpm下離心1分鐘。丟棄上清液。將沉淀 小心溶解在200μ 1 CLS(25mM EDTA、2% SDS)以及1 μ 1核糖核酸酶A中。在65°C下孵育 10分鐘后，將懸浮液在冰上冷卻。添加70 μ 1 PPS (10 Μ乙酸銨）之后，將溶液在旋渦混合 器上徹底混合。離心（在埃彭道夫離心機(jī)中在最大速度下5分鐘）后，將上清液與200 μ 1 冰冷異丙醇混合。DNA容易地沉積并且通過離心（5分鐘，最大速度）來?；?。用400 μ 1冰 冷的70%乙醇洗滌沉淀。在室溫下干燥沉淀并且溶解在50μ1 TE(10 mM Tris.HCl ρΗ7. 5， ImM EDTA)中。
[0269] 用于 Rasamsonia emersonii 的一般方法
[0270] 菌株
[0271] Rasamsonia (Talaromyces) emersonii 菌株 TEC-142 于 2009 年 7 月 1 日保藏 在CENTRAALBUREAUV00RSCHIMMELCULTURES，Uppsalalaan8，郵箱85167，NL-3508 AD Utrecht，The Netherlands，保藏登記號為 CBS 124902。TEC-142S 為 TEC-142 的單一分離 物。
[0272] 其它適合的菌株如以上所述的菌株可同等地用在本發(fā)明的實(shí)施例中，以便示出 本發(fā)明的作用和優(yōu)勢。例如TEC-101、TEC-142、TEC-192、TEC-201或TEC-210為適合的 Rasamsonia 菌株，其描述于 W02011/000949 中。
[0273] 培養(yǎng)基和溶液
[0274] 馬鈐薯右旋糖掠脂，PDA(Fluka,目錄號70139):毎升：馬鈐薯提取物4g ;右旋糖 2〇g ;細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂15g ;ρΗ5· 4 ;在120°C下滅菌20分鐘。
[0275] Rasamsonia掠脂培養(yǎng)基：每升：鹽部分編號3 15g ;纖維素30g ;細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白 胨 7. 5g ;谷粉 15g ;KH2P04 5g ;CaC12. 2aq lg ;細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂 20g ;ρΗ6· 0 ;在 120°C下滅 菌20分鐘。
[0276] 鹽部分纟目成："鹽部分編號3"符合W098/37179表1的公開內(nèi)容。與此表的組成的 偏差為 CaC12.2aq 1.0g/l、KCl 1.8g/L、檸檬酸 laq 0.45g/L(螯合劑）。
[0277] 用于Rasamsonia的搖瓶培養(yǎng)基
[0278] Rasamsonia 培養(yǎng)基 1 :每升：葡萄糖 20g ;酵母提取物（Difco) 20g ;Clerol FBA3107(AF)4 滴；MES 30g ;ρΗ6· 0 ;在 120°C下滅菌 20 分鐘。
[0279] Rasamsonia 培養(yǎng)某 2 :毎升：鹽部分編號 3 10g ;葡萄糖 10g ;KH2P04 5g ;NaH2P04 2g ; (NH4) 2S04 5g ;MES 30g ;ρΗ5· 4 ;在 120°C下滅菌 20 分鐘。
[0280] Rasamsonia 培養(yǎng)某 3 :毎升：鹽部分編號 3 10g ;纖維素 20g ;KH2P04 5g ;NaH2P04 2g ; (NH4) 2S04 5g ;MES 30g ;ρΗ5· 4 ;在 120°C下滅菌 20 分鐘。
[0281] Rasamsonia培養(yǎng)基4 :每升：鹽部分編號3 10q ;纖維素15g ;葡萄糖5g ;KH2P04 5g ;NaH2P04 2g ; (NH4)2S04 5g ;MES 30g ;ρΗ5· 4 ;在 120°C下滅菌 20 分鐘。
[0282] Rasamsonia的孢子分批制劑
[0283] 使菌株在直徑10cm的培養(yǎng)皿中在40°C下自Rasamsonia瓊脂培養(yǎng)基上從吧備物生 長5-7天。對于MTP發(fā)酵，使菌株在含有Rasamsonia瓊脂培養(yǎng)基的96孔板中生長。將菌 株貯備物在_80°C下儲(chǔ)存在10%甘油中。
[0284] 染色體DNA分離
[0285] 使菌株在￥66培養(yǎng)基（每升：881((：1、168葡萄糖.!120,2〇111110%酵母提取物、 10ml lOOx pen/strep、6.66g YNB+氛基酸、1.5g朽1 樣酸以及6g K2HP04)中在42°C、250rpm 下生長16小時(shí)，并且使用DNeasy植物小型試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany)分離染色體 DNA。
[0286] Rasamsonia的搖瓶生長方案
[0287] 將孢子接種在含有20 ml Rasamsonia培養(yǎng)基1的100 ml搖瓶中，并且在45°C、 250 rpm下在孵育振蕩器中孵育1天（預(yù)培養(yǎng)物1)，將1或2 ml的生物質(zhì)從預(yù)培養(yǎng)物1轉(zhuǎn) 移至含有20 ml Rasamsonia培養(yǎng)基2的100 ml搖瓶中，并且在如以上所述的條件下生長1 天（預(yù)培養(yǎng)物2)。隨后，將1或2 ml的生物質(zhì)從預(yù)培養(yǎng)物2轉(zhuǎn)移至含有20 ml Rasamsonia 培養(yǎng)基3或4的100 ml搖瓶中，并且在如以上所述的條件下生長3天。
[0288] 蛋白質(zhì)分析
[0289] 在還原條件下在 NuPAGE 4-12 % Bis-Tris 凝膠（Invitrogen，Breda，荷蘭） 上制備蛋白質(zhì)樣品并且染色。將凝膠用InstantBlue(Expedeon，Cambridge, United Kingdom)、 SimplyBlue safestain(Invitrogen, Breda, The Netherlands)或 Sypro Ruby(Invitrogen，Breda, The Netherlands)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行染色。
[0290] 總蛋白含量
[0291] 根據(jù)布拉德福（Bradford)法測定所回收上清液的蛋白含量。用布拉德福蛋白測 定使用考馬斯（Coomassie)蛋白試劑測定酶樣品中的蛋白量。將25 μ 1適當(dāng)稀釋的酶樣品 與1. 2 ml考馬斯試劑混合。在室溫下10分鐘后，使用分光光度計(jì)（Uvikon XL)測定混合 物在595 nm下的吸光度。與BSA標(biāo)準(zhǔn)相比較來計(jì)算蛋白含量。
[0292] 玉米秸桿測定
[0293] 為了測量纖維素酶活性，進(jìn)行玉米秸桿活性測定。在空菌株和轉(zhuǎn)化株的上清液中 (其中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液的液體部分）測量纖維素酶活性。
[0294] 制各預(yù)處理的玉米秸軒底物
[0295] 如 Schell，D. J.，Applied Biochemistry and Biotechnology (2003)，第 105-108 卷，第69-85頁所述獲得稀酸預(yù)處理的玉米秸桿。使用在190°C、1分鐘停留時(shí)間以及在液 相中1.45% (w/w)有效H2S04酸濃度的穩(wěn)態(tài)條件下操作的試驗(yàn)性規(guī)模的預(yù)處理反應(yīng)器。
[0296] 在2%未洗滌的酸預(yù)處理的玉米秸軒h測量纖維素酶活件
[0297] 由于纖維素酶的葡萄糖釋放不是組合物中酶的量的線性函數(shù)，換句話說，在固定 的時(shí)間點(diǎn)兩倍的酶量不會(huì)自動(dòng)產(chǎn)生兩倍的葡萄糖量。因此，在基于劑量應(yīng)答的測定中評價(jià) 了纖維素酶混合物的活性，其中劑量是基于每單位所測試?yán)w維素混合物相等量的蛋白。
[0298] 用未洗滌的酸預(yù)處理的玉米秸桿作為底物測量混合物的總纖維素酶活性。將冷凍 的酶樣品解凍，在pH 4. 5的50 mM檸檬酸鹽緩沖液中逐步按兩倍進(jìn)行范圍從未稀釋至高達(dá) 32倍的一系列6個(gè)稀釋。
[0299] 將200 μ 1樣品轉(zhuǎn)移至含有800 μ L于50 mM檸檬酸鹽緩沖液（緩沖在pH4. 5)中酸 預(yù)處理玉米秸桿的2. 5% (w/w)干物質(zhì)的小瓶中。將另外200 μ 1樣品轉(zhuǎn)移至含有800 μ 1 的50 mM檸檬酸鹽緩沖液（緩沖在pH 4. 5)的稱為空白的小瓶中。另外，通過用200 μ 1的 50 mM檸檬酸鹽緩沖液孵育800 μ 1的在50 mM檸檬酸鹽緩沖液（緩沖在pH 4. 5)中酸預(yù)處 理玉米秸桿的2.5% (w/w)干物質(zhì)來測定玉米秸桿的糖背景值。所有小瓶均在65°C下孵育 72 h〇
[0300] 孵育后，將100 μ 1內(nèi)標(biāo)溶液（20 g/L馬來酸，于D20中40 g/L EDTA)添加至小瓶。 將含有預(yù)處理的玉米秸桿的所有小瓶在5300 g下離心30分鐘，并且隨后將600 μ 1上清液 轉(zhuǎn)移至含有400μ1 H20/D20 9 : 1的新小瓶。
[0301] 使用具有水抑制的脈沖程序，在27°C的溫度下，在于500 MHz的質(zhì)子頻率下操作 的Avance III Bruker上記錄ID 1H-NMR光譜。相對于與6.30ppm的內(nèi)標(biāo)信號有關(guān)的4， 4-二甲基-4-硅雜戊烷磺酸，基于5. 20 ppm的信號進(jìn)行葡萄糖量化（任意單位）。通過酶 溶液中存在的殘余糖（由空白測量）和酸預(yù)處理的玉米秸桿中存在的殘余糖來校準(zhǔn)在樣品 中測量的葡萄糖，來計(jì)算相對葡萄糖釋放（AGlc)。
[0302] 由于樣品的蛋白質(zhì)濃度是已知的，因此糖釋放可描述為所測試的稀釋樣品的蛋白 質(zhì)mg/ml與在時(shí)間點(diǎn)72小時(shí)的相對葡萄糖釋放的函數(shù)。
[0303] 實(shí)施例1 :酵母的標(biāo)準(zhǔn)化的涂徑構(gòu)筑系統(tǒng)
[0304] 1. 1酵母的標(biāo)準(zhǔn)化的涂徑構(gòu)筑系統(tǒng)的一般介紹
[0305] 此方法使得能夠以大的靈活性將基因/途徑快速引入酵母（釀酒酵母）基因組 中。水平一（參見圖9)聚焦于使用稱為"Golden Gate克隆"的方法（Engler C.等人（2008) PLoS ONE 3(11) :e3647 以及Engler C.等人（2009)PL〇S ONE 4(5) :e5553)，將所謂的標(biāo)準(zhǔn) 化的遺傳元件、啟動(dòng)子、開放閱讀框架（〇RF)以及終止子克隆到側(cè)翼為標(biāo)準(zhǔn)化的50 bp連接 物的功能性表達(dá)盒中。
[0306] 標(biāo)準(zhǔn)化的50 bp連接物為骨架進(jìn)入載體的一部分并且在水平二使用（參見圖9)， 其中標(biāo)準(zhǔn)化的50 bp連接物提供多個(gè)表達(dá)盒之間的必要同源性，使得其經(jīng)由體內(nèi)同源重組 作為途徑構(gòu)筑并整合到酵母基因組中。
[0307] 期望的遺傳元件（例如啟動(dòng)子、開放閱讀框架（0RF)以及終止子）的設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn) 化與標(biāo)準(zhǔn)化的連接物的使用相結(jié)合在克隆和轉(zhuǎn)化過程中實(shí)現(xiàn)最大速度和靈活性。
[0308] 圖9為標(biāo)準(zhǔn)化的途徑構(gòu)筑方法的示意性圖示。在本文所述的實(shí)施例中，使用所述 方法來測定一組啟動(dòng)子和終止子對五種所選報(bào)道基因的表達(dá)的影響。
[0309] 1. 2 it.i十遺.傳元件啟動(dòng)子、0RF以及終ih子
[0310] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)各遺傳元件，使得可以用IIs型限制酶Bsal將元件克隆到載體中， 因而產(chǎn)生包含啟動(dòng)子、0RF以及終止子的功能性表達(dá)盒。
[0311] 首先，通過引入點(diǎn)突變，使所有元件的內(nèi)部Bsal位點(diǎn)去除。對于0RF，避免氨基酸 序列變化。對于啟動(dòng)子和終止子，選擇點(diǎn)突變以不影響（就我們所知）元件的功能性。各元 件在兩側(cè)提供有4nt橋與Bsal識別位點(diǎn)的組合。Bsal識別位點(diǎn)放置成使得用IIs型限制 酶切割產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化的4核苷酸伸出序列，其稱為"橋"。以此方式，設(shè)計(jì)了 30個(gè)啟動(dòng)子（SEQ ID N0 :1 至 30)、5 個(gè) 0RF(報(bào)道基因 ；SEQ ID N0 :31 至 35)以及 14 個(gè)終止子（SEQ ID N0 : 36至49)的組。下文更詳細(xì)地描述針對各元件的具體規(guī)則，以針對啟動(dòng)子的規(guī)則開始，接著 是0RF和終止子。
[0312] 啟動(dòng)子的具體設(shè)計(jì)規(guī)則
[0313] -如以上所述，從啟動(dòng)子序列去除所有Bsal位點(diǎn)
[0314] -對于大部分啟動(dòng)子,標(biāo)準(zhǔn)化的大小設(shè)定為600個(gè)堿基對；例外為先前已示出更大 或更短啟動(dòng)子為較佳選擇或歷史上已設(shè)定為某一長度的情況。
[0315] -序列
[0316] 5 ' GGTCTCGGTGC+ (啟動(dòng)子序列-最后 bp) +AATGGGAGACC 3 '
[0317] -在啟動(dòng)子的5'部分的GTGC(加下劃線）為至骨架進(jìn)入載體的4核苷酸序列橋 (1.3中進(jìn)行討論）
[0318] -在啟動(dòng)子的3'部分的AATG(加下劃線）為至0RF的4核苷酸序列橋，其中ATG 為0RF的起始密碼子并且AATG的第一個(gè)A為啟動(dòng)子序列的標(biāo)準(zhǔn)化的最后堿基對A
[0319] 0RF的具體設(shè)計(jì)規(guī)則
[0320] -從0RF序列去除所有Bsal位點(diǎn)
[0321] -序列
[0322] 5，GGTCTCGAATG+ (0RF 序列）+TAAAGGAGACC 3 '
[0323] 0RF序列沒有終止和起始密碼子（包括在4 nt橋中）
[0324] -在0RF的5'部分的AATG(加下劃線）為至啟動(dòng)子序列的4核苷酸橋
[0325] -在0RF的3'部分的TAAA(加下劃線）為至終止子序列的4核苷酸橋
[0326] 終止子的具體設(shè)計(jì)規(guī)則
[0327] -從終止子序列去除所有Bsal位點(diǎn)
[0328] -序列
[0329] 5 ' GGTCTCGTAAA+ (終止子序列）+CCTCGGAGACC
[0330] -在終止子的5'部分的TAAA(加下劃線）為至0RF序列的4核苷酸橋
[0331] -在終止子的3'部分的CCTC(加下劃線）為至骨架進(jìn)入載體的4核苷酸橋（在 1. 3中討論）
[0332] 通過DNA2. 0 (Menlo Park，CA USA)在具有大腸桿菌氨比西林抗性標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)載 體中合成并克隆所有遺傳元件（啟動(dòng)子、0RF以及終止子）。DNA2. 0使用的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌 克隆載體在SEQ ID N0 :50中闡述。
[0333] 1. 3設(shè)計(jì)骨架講入載體
[0334] 骨架進(jìn)入載體構(gòu)建成具有兩個(gè)Bsal位點(diǎn)，其在切割后產(chǎn)生克隆至表達(dá)載體中（即 組裝的啟動(dòng)子、0RF以及終止子組合）的4核苷酸橋/粘性端。為改善Golden Gate克隆 反應(yīng)的效率，將用于在大腸桿菌中逆選擇的ccdB基因定位在Bsal位點(diǎn)之間。這防止選擇 原始骨架載體。此外，骨架進(jìn)入載體具有用于骨架質(zhì)粒在大腸桿菌中的增殖的卡那霉素選 擇標(biāo)記物，這與用于含有輸入元件（啟動(dòng)子、ORF以及終止子）的載體的氨比西林標(biāo)記物不 同。因此，使用對卡那霉素的選擇來防止對元件載體的不需要的選擇。
[0335] 骨架進(jìn)入載體的另一重要特征為標(biāo)準(zhǔn)化的50bp序列，其稱作"連接物"。連接物 提供用于在標(biāo)準(zhǔn)化的途徑構(gòu)筑方法的水平2進(jìn)行重組所必要的同源性。連接物側(cè)翼為4nt 橋，其方式使得在載體中克隆啟動(dòng)子、0RF以及終止子后，所產(chǎn)生的表達(dá)盒左和右側(cè)翼為連 接物。
[0336] 稱為連接物5、連接物A至連接物K以及連接物3 (SEQ ID N0 :51至63)的十三個(gè) 獨(dú)特50 bp連接物設(shè)計(jì)成對酵母基因組不含任何同源性的隨機(jī)序列。這些連接物序列用來 設(shè)計(jì)表1中所列的22個(gè)骨架載體。
[0337] 表1 :具有連接物的所有骨架講入載體和對應(yīng)SEQ ID識別符
[0338] 骨架進(jìn)入載體 迮接物 SEQIDNO Sc Sa.bbn 左連接物5 +心連接物a SEQ ID NO: 64 Scab.bbn 左連接物a 右連接物b SE〇 ID NO: 65 Scbc.bbn 左連接物b 右連接物c SEQ ID NO: 66 Sccd.bbn 左連接物e 右連接物d SEQ ID NO: 67 Scde.bbn 左連接物d 右連接物e SEQ ID NO: 68 Sc ef'bbn 左連接物e 右連接物f SEQ ID NO: 69 Sc fg.bbn 左連接物f 右連接物g SEQ ID NO: 70 Sc gh.bbn 左連接物g 右連接物h SEQ ID NO: 71 Sc hi.bbn 左連接物h +右連接物i SEQ ID NO: 72 Sc ij.bbn 左連接物? 右連接物j SEQ ID NO: 73 Scjk.bbn 左連接物j 右連接物k SEQ ID NO: 74 Sc a3.bbn 左連接物a 右連接物3 SEQ ID NO: 75
[0339] Sc b3.bbn 左連接物b 右連接物3 SEQ ID NO: 76 Sc c3.bbn +/r:連接物 c 心連接物 3 SEQ ID NO: 77 Sc d3.bbn +/!':連接物 d 心連接物 3 SEQ ID NO: 78 Sc e3.bbn +/n連接物 e -心'連接物 3 SEQ ID NO: 79 ScO.bbn 左連接物f +心連接物3 SEQ ID NO: 80 Scg3.bbn 左連接物g 右連接物3 SEQ ID NO: 81 Sc h3.bbn 左連接物h 右連接物3 SEQ ID NO: 82 Sc i3.bbn 左連接物i 右連接物3 SEQ ID NO: 83 Scj3.bbn 左連接物j 右連接物3 SEQ ID NO: 84 Sc k3.bbn 左連接物k 右連接物3 SEQ D NO: 85
[0340] SEQ ID NO :64至85中所列的序列為通過DNA2.0合成并且克隆到標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌 載體中以產(chǎn)生骨架載體的具體序列。用于克隆SEQ ID N0 :64至85的大腸桿菌載體含有卡 那霉素標(biāo)記物，且其序列示于SEQ ID N0:86。
[0341] 骨架載體實(shí)現(xiàn)兩個(gè)重要的供能。一，其含有至啟動(dòng)子和終止子的橋，從而使得有可 以在Golden Gate反應(yīng)中使環(huán)閉合。二，其用連接物修飾表達(dá)盒，以用于體內(nèi)重組步驟（稱 為水平2)。例如，在Sc 5A.bbn中用Golden Gate反應(yīng)克隆表達(dá)盒將在表達(dá)盒的左部分裝 備連接物5并且在右部分裝備連接物A。表1中所列的具有所設(shè)計(jì)連接物的骨架進(jìn)入載體 的組在DNA2.0 (Menlo Park，CA USA)定制并合成。在下文總結(jié)骨架進(jìn)入載體的所有特征。
[0342] 總結(jié)骨架的具體設(shè)計(jì)
[0343] -大腸桿菌載體序列具有卡那霉素標(biāo)記物（SEQ ID NO :86)
[0344] -兩個(gè)Bsal位點(diǎn)，其在切割后產(chǎn)生與啟動(dòng)子的5'和終止子的3'上的橋相容的4 nt橋
[0345] -用定位在Bsal位點(diǎn)之間的ccdB序列逆選擇
[0346] -連接物序列在橋左和右
[0347] -通過DNA2. 0在載體中定制并克隆的實(shí)際序列的設(shè)計(jì)：5' L con-GTGCGGAGACC-ccdB 序列-GGTCTCGCCTC-R con 3，
[0348] 〇 GTGC(加下劃線）至啟動(dòng)子的5'部分的橋
[0349] 〇 CCTC(加下劃線）至終止子3'部分的橋
[0350] 〇 "L con"和"R con"分別為左連接物序列和右連接物序列
[0351] 1. 4用Golden Gate克降組裝表汰念
[0352] 按照 Golden Gate 克隆的出版物（Engler C.等人（2008) PLoS ONE 3(11) :e3647 以及Engler C.等人（2009)PL〇S ONE 4(5) :e5553)中所描述的進(jìn)行組裝。在單鍋反應(yīng)中， 與三元件輸入載體以及骨架進(jìn)入載體組合添加 Bsal和連接酶。最優(yōu)選的反應(yīng)條件為37°C 下2分鐘并且16°C下5分鐘的50個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。通常地，通過對完整插入物測序來檢查2 個(gè)克隆。當(dāng)示出兩個(gè)克隆均不正確時(shí)，用測序來檢查其它克隆。所有組裝的表達(dá)盒的列表 可見表2。

【權(quán)利要求】
1. 一種用于制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的方法，所述方法包括： a. 提供兩組或更多組元件序列， 每組元件序列一起構(gòu)成至少一種功能性表達(dá)盒， 各元件序列的兩側(cè)側(cè)翼為IIs型限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，之后是其識別位點(diǎn)， 所述IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)被選擇成使得元件序列的組可組裝 成功能性表達(dá)盒； b. 提供至少兩種骨架進(jìn)入載體， 各骨架進(jìn)入載體按以下這種順序包含：（i)限制酶切割位點(diǎn)與其識別位點(diǎn)，和第一連 接物序列（LF) ;(ii)包含可選擇標(biāo)記基因的載體骨架；以及（iii)第二連接物序列（RF)， 和限制酶識別位點(diǎn)與其切割序列；以及（iv)任選地，在（i)和（iii)的所述識別位點(diǎn)之間 的插入物， 任何骨架進(jìn)入載體上的所述連接物序列RF和LF被選擇成使得其可分別與相同或不同 骨架進(jìn)入載體上的LF或RF連接物序列進(jìn)行組裝；以及 c. 使用基于使用限制酶消化和經(jīng)由切割位點(diǎn)連接的方法，在至少兩個(gè)骨架進(jìn)入載體中 組裝所述兩組或更多組元件序列作為功能性表達(dá)盒； 從而制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒。
2. -種用于在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處體內(nèi)重組兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的方法， 所述方法包括： a. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒，其中： i. RF和LF連接物序列包含同源重組序列；以及 ii. 任何骨架進(jìn)入載體上的RF和LF連接物序列被選擇成使得其可通過體內(nèi)重組分別 與LF或RF連接物序列、與相同或不同骨架進(jìn)入載體和/或與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行組裝； 以及 b. 從包含所述LF和RF序列的骨架進(jìn)入載體回收表達(dá)盒；以及 c. 在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將所回收的表達(dá)盒彼此體內(nèi)重組。
3. -種用于在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒體內(nèi)重組的方 法，所述方法包括： a. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式表達(dá)盒，其中： i. RF和LF連接物序列包含至少約9個(gè)堿基對的同源序列；以及 ii. 任何骨架進(jìn)入載體上的RF和LF連接物序列被選擇成使得其可使用這些序列通過 體外方法分別與LF或RF連接物序列、與相同或不同骨架進(jìn)入載體和/或與靶位點(diǎn)的側(cè)翼 序列進(jìn)行組裝；以及 b. 從骨架進(jìn)入載體回收表達(dá)盒，并且通過LF和RF序列的體外連接對其進(jìn)行組裝；以 及 c. 在宿主細(xì)胞中在靶位點(diǎn)處將所組裝和回收的表達(dá)盒體內(nèi)重組。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少兩個(gè)骨架進(jìn)入載體按以下這種順 序包含：（i) II型限制酶識別位點(diǎn)，之后是其切割位點(diǎn)，和至少25個(gè)堿基對的第一連接物序 列（LF) ;(ii)包含可選擇標(biāo)記基因的載體骨架；以及（iii)至少25個(gè)堿基對的第二連接物 序列（RF)，和II型限制酶的另一切割位點(diǎn)，之后是所述切割位點(diǎn)的識別位點(diǎn)；以及（iv)任 選地，在（i)和（iii)的所述識別位點(diǎn)之間的插入物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中在兩個(gè)整合序列存在下進(jìn)行所述重 組步驟，其中一個(gè)與第一表達(dá)盒和靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組，并且其中第二個(gè)與第二表達(dá)盒 和靶位點(diǎn)的另一側(cè)側(cè)翼序列重組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述重組步驟中，第一表達(dá)盒包 含與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組的整合序列，并且第二表達(dá)盒包含與靶位點(diǎn)的另一側(cè)側(cè)翼序列 重組的整合序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2或6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述整合序列包含與用于第二靶位 點(diǎn)、任選地不同于所述第一靶位點(diǎn)的種類的宿主細(xì)胞中的位點(diǎn)重組的另外的序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述整合序列介導(dǎo)經(jīng)由同源重組或 位點(diǎn)特異性重組的整合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述整合序列、連接物或其它元件序列包含用 于與所述第二靶位點(diǎn)重組的位點(diǎn)特異性重組序列，所述序列位于所組裝的表達(dá)盒之外并且 允許使用位點(diǎn)特異性重組在所述第二靶位點(diǎn)處、任選地在不同于所述第一靶位點(diǎn)的宿主細(xì) 胞種類的宿主細(xì)胞種類中的靶位點(diǎn)處進(jìn)行重組。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述靶位點(diǎn)處按預(yù)定順序順次組 裝并重組兩種或更多種表達(dá)盒。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一種表達(dá)盒為標(biāo)記物表達(dá)盒。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述標(biāo)記物表達(dá)盒的側(cè)翼為至少兩個(gè)位點(diǎn)特異 性重組位點(diǎn)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用不根據(jù)權(quán)利要求1所述的方 法制備的表達(dá)盒。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少兩個(gè)元件序列組包含啟動(dòng)子元 件、開放閱讀框架元件以及終止子元件。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中將每組元件在至少兩個(gè)骨架進(jìn)入載 體中組裝成為功能性表達(dá)盒在單鍋反應(yīng)中進(jìn)行。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中限定每組中的元件以使得按預(yù)定順 序組裝所述表達(dá)盒。
17. -種用于在祀位點(diǎn)處整合DNA序列的方法，其包括： a. 提供：（i)至少約200個(gè)堿基對長的至少兩個(gè)左（int-L)和兩個(gè)右（int-R)整合序 列的組，用于同源重組至宿主細(xì)胞中的至少一個(gè)靶位點(diǎn)，其中： 所述左（int-L)序列側(cè)翼為一個(gè)至少約25個(gè)堿基對的連接物序列； 所述右（int-R)序列側(cè)翼為一個(gè)至少約25個(gè)堿基對的連接物序列；以及 (ii)至少一個(gè)表達(dá)盒，其兩側(cè)側(cè)翼為至少約25個(gè)堿基對的連接物序列；以及 b. 通過在所述int-L和int-R序列的同源靶位點(diǎn)處重組來體內(nèi)組裝來自步驟（a)的至 少三個(gè)序列的組，以使得至少一個(gè)左和至少一個(gè)右整合序列按照這種順序處于所述宿主細(xì) 胞的祀位點(diǎn)處， 其中體內(nèi)組裝后，至少一個(gè)表達(dá)盒存在于靶位點(diǎn)處，任選地所述表達(dá)盒能夠表達(dá)功能 性標(biāo)記物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，所述方法包括： a. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的模塊式表達(dá)盒，其中 i. int-L和int-R序列為啟動(dòng)子、orf或終止子序列的一部分； ii. RF和LF連接物序列包含至少約25個(gè)堿基對的同源重組序列；以及 iii. 任何骨架進(jìn)入載體上的RF和LF序列被選擇成使得其可通過分別與LF或RF連接 物序列、與相同或不同骨架進(jìn)入載體和/或與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行體內(nèi)重組來組裝； b. 從包含LF和RF序列的所述骨架進(jìn)入載體回收表達(dá)盒；以及 c. 在宿主細(xì)胞中在所述靶位點(diǎn)處將所回收的表達(dá)盒彼此體內(nèi)重組。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，所述方法包括選擇兩個(gè)或更多個(gè)int-L和兩個(gè) 或更多個(gè)int-R序列，用于在一組體內(nèi)組裝和重組反應(yīng)中使用，從而產(chǎn)生多個(gè)宿主細(xì)胞，所 述細(xì)胞具有通過所選擇的int-L和int-R序列祀向至少兩個(gè)允許的組合的組合，其中 a. 至少兩個(gè)int_L序列在靶位點(diǎn)處在至少一個(gè)int-R序列的左側(cè)；或 b. 至少兩個(gè)int_R序列在靶位點(diǎn)處在至少一個(gè)int-L序列的右側(cè)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中第二功能性標(biāo)記物盒形成在第二 革巴位點(diǎn)處。
21. 根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中在靶位點(diǎn)處的重組導(dǎo)致在所述靶 位點(diǎn)處一個(gè)或更多個(gè)基因的功能性敲除或下調(diào)。
22. 根據(jù)權(quán)利要求2至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為原核或真核細(xì)胞。
23. -種用于制備兩種或更多種標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)盒的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括： a. 兩組或更多組元件序列； 每組元件序列一起構(gòu)成至少一種功能性表達(dá)盒， 各元件序列的兩側(cè)側(cè)翼為IIs型限制核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，之后是其識別位點(diǎn)， 所述IIs型限制核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)被選擇成使得元件序列的組可組裝 成功能性表達(dá)盒； b. 至少兩種骨架進(jìn)入載體， 各骨架進(jìn)入載體按以下這種順序包含：（i)限制酶與其識別位點(diǎn)，和第一連接物序列 (LF) ;(ii)包含可選擇標(biāo)記基因的載體骨架；以及（iii)第二連接物序列（RF)，和限制酶 識別位點(diǎn)與其切割序列；以及（iv)任選地，在（i)和（iii)的所述識別位點(diǎn)之間的插入物， 任何骨架進(jìn)入載體上的連接物序列RF和LF被選擇成使得其可分別與相同或不同骨架 進(jìn)入載體上的LF或RF連接物序列進(jìn)行組裝。
24. -種用于產(chǎn)生整合在靶位點(diǎn)處的目的核酸構(gòu)建體的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含： a. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的系統(tǒng)；以及 b. 至少兩個(gè)整合序列，其中一個(gè)與第一表達(dá)盒和靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組，并且其中第 二個(gè)與第二表達(dá)盒和靶位點(diǎn)另一側(cè)的側(cè)翼序列重組。
【文檔編號】C12N15/66GK104204205SQ201380017487
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月27日
【發(fā)明者】約翰尼斯·安德列什·勞博斯, 赫爾曼·揚(yáng)·佩爾, 伯納德·邁瑞克 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司