在轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬中表達(dá)胞漿蘋果酸酶以提高脂質(zhì)產(chǎn)量的制作方法
【專利摘要】本文公開(kāi)了轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬(Yarrowia)菌種，其包含編碼胞漿蘋果酸酶的多核苷酸、所述耶氏酵母屬菌種細(xì)胞干重的至少約35重量％的脂質(zhì)含量、和經(jīng)工程化的多不飽和脂肪酸(PUFA)生物合成途徑，其中所述胞漿蘋果酸酶的過(guò)表達(dá)提高脂質(zhì)含量。
【專利說(shuō)明】在轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬中表達(dá)胞漿蘋果酸酶以提高脂質(zhì)產(chǎn)量
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年4月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/619,574的權(quán)益，其全文以 引用方式并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，本發(fā)明涉及過(guò)表達(dá)胞漿蘋果酸酶以提高脂 質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬（Yarrowia)菌種。

【背景技術(shù)】
[0003] 研究已經(jīng)涉及了解脂質(zhì)和脂肪酸（FA)生物合成途徑，并且已經(jīng)使用基因工程將 這些生物合成途徑導(dǎo)入宿主生物。例如包括植物、藻類、真菌、原生藻菌（stramenopiles) 和酵母在內(nèi)的多種不同宿主正被研究旨在用于商業(yè)化多不飽和脂肪酸（PUFA)生產(chǎn)。基因 工程已表明，一些宿主（即使那些天然限于亞麻酸（LA，18 :2?-6)或a-亞麻酸（ALA，18: 3? _3脂肪酸生產(chǎn)的宿主）可進(jìn)行實(shí)質(zhì)上的改造以產(chǎn)生對(duì)多種長(zhǎng)鏈《-3/?-6 PUFA的高水 平生產(chǎn)。
[0004] 盡管文獻(xiàn)報(bào)道了負(fù)責(zé)EPA的生產(chǎn)的《 -3/ ? -6 PUFA生物合成途徑的多個(gè)部分在 其中被引入植物和非含油酵母的許多最近的例子，主要努力已經(jīng)集中在含油酵母解脂耶氏 酵母（Yarrowia Iipolytica)(美國(guó)專利7, 238, 482 ;美國(guó)專利7, 932, 077 ;美國(guó)專利申請(qǐng)公 布2009-0093543-A1 ;美國(guó)專利申請(qǐng)公布2010-0317072-A1)。含油酵母被定義為天然地能 夠合成和積聚油的那些酵母（其中油的積聚為細(xì)胞干重的至少25% )，或經(jīng)過(guò)遺傳工程改 造，使得它們變得能夠合成和積聚油的那些酵母（其中油的積聚為細(xì)胞干重的至少25%)。
[0005] 對(duì)提高真菌中的脂質(zhì)積聚仍保持相當(dāng)大的興趣。蘋果酸酶在釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)胞楽中的表達(dá)已經(jīng)顯不提高 NADPH 產(chǎn)量（2004，dos Santos 等人，Metabol. Engineering 6:352-363)。假定NADPH的作用是作為脂肪酸合成中 的還原劑，蘋果酸酶已經(jīng)據(jù)研究是用于改變脂質(zhì)產(chǎn)量的可能因素。Zhang等人（2007， Microbiology 153 :2013_2025)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在野生型卷枝毛霉（Mucor circinelloides) 中過(guò)表達(dá)蘋果酸酶導(dǎo)致脂質(zhì)積聚增加2. 5倍。與這個(gè)發(fā)現(xiàn)一致，研究已經(jīng)表明在卷枝毛 霉（M. circinelloides)和高山被孢霉（Mortierella alpina)中表達(dá)蘋果酸酶與脂質(zhì)積 聚相關(guān)聯(lián)（1999，Wynn 等人，Microbiology 145:1911-1917 ;2002，Ratledge，Biochem. Soc. Trans. 30 :1047-1050)。另外，缺乏蘋果酸酶活性的突變型構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans)分離物顯示積聚的脂質(zhì)為具有蘋果酸酶的構(gòu)巢曲霉（A. nidulans)菌株產(chǎn)生脂 質(zhì)的一半（1997, Wynn 等人，Microbiology 143 :253_257)。
[0006] 然而，對(duì)野生型解脂耶氏酵母的研究表明蘋果酸酶可能在脂質(zhì)生產(chǎn)中不起到大的 作用。Beopoulos 等人（2011，Appl. Microbiol. Biotechnol.，90 :1193_1206)簡(jiǎn)要報(bào)道了 過(guò)表達(dá)線粒體形式的蘋果酸酶不影響解脂耶氏酵母中的脂質(zhì)積聚。
[0007] 盡管存在前述公開(kāi)，令人驚訝地是，已發(fā)現(xiàn)包含經(jīng)工程化的多不飽和脂肪酸生物 合成途徑并具有耶氏酵母屬菌種細(xì)胞干重的至少約35重量％脂質(zhì)含量的轉(zhuǎn)基因耶氏酵母 屬菌種的脂質(zhì)含量可通過(guò)過(guò)表達(dá)胞漿蘋果酸酶得到提高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬菌種，其包含（i)編碼胞漿 蘋果酸酶的多核苷酸，（ii)耶氏酵母屬菌種細(xì)胞干重的至少約35重量％的脂質(zhì)含量，和 (iii)經(jīng)工程化的多不飽和脂肪酸（PUFA)生物合成途徑，其中胞漿蘋果酸酶的過(guò)表達(dá)提高 脂質(zhì)含量。
[0009] 在第二實(shí)施例中，由多核苷酸編碼的胞漿蘋果酸酶包含功能障礙的線粒體靶向序 列。在第三實(shí)施例中，胞漿蘋果酸酶缺乏線粒體靶向序列。
[0010] 在第四實(shí)施例中，由多核苷酸編碼的胞漿蘋果酸酶包含與SEQ ID NO :5具有至少 約90%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述胞漿蘋果酸酶具有蘋果酸酶活性。
[0011] 在第五實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬菌種具有耶氏酵母屬菌種細(xì)胞干重的至少約 50重量％的脂質(zhì)含量。
[0012] 在第六實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬菌種包含的經(jīng)工程化的PUFA生物合成途徑 產(chǎn)生至少一種PUFA，諸如亞油酸、a -亞麻酸、Y _亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二 高-Y-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯 酸、（0-3二十二碳五烯酸、《-6二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。優(yōu)選地，經(jīng)工程化的 PUFA生物合成途徑產(chǎn)生二十碳五烯酸。
[0013] 在第七實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬菌種是解脂耶氏酵母。
[0014] 在第八實(shí)施例中，本發(fā)明涉及用于提高轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬菌種的脂質(zhì)含量的方 法，所述方法包括：
[0015] a)培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬菌種，其中產(chǎn)生包含至少一種PUFA的微生物 油，以及
[0016] b)任選地，回收步驟（a)的微生物油。
[0017] 關(guān)于該方法，胞漿蘋果酸酶可包含功能障礙的線粒體靶向序列或者胞漿蘋果酸酶 并不包含線粒體靶向序列。此外，所述胞漿蘋果酸酶可包含與SEQ ID NO :5具有至少約 90 %的序列同一性的氨基酸序列，并且所述胞漿蘋果酸酶具有蘋果酸酶活性。
[0018] 在該方法的另一方面，耶氏酵母屬菌種的脂質(zhì)含量為耶氏酵母屬菌種細(xì)胞干重的 至少約50重量％。
[0019] 在該方法的又一方面，經(jīng)工程化的PUFA生物合成途徑產(chǎn)生至少一種選自下列的 PUFA :亞油酸、a -亞麻酸、Y _亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二高_(dá) Y _亞麻酸、花 生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯酸、《-3二十二碳五 烯酸、《 -6二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。優(yōu)選地，所產(chǎn)生的至少一種PUFA是二十碳 五烯酸。
[0020] 附圖和序列簡(jiǎn)沭
[0021] 圖1:不出由釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (ScME)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe) (SpME)和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica) (YlME)表 達(dá)的ME氨基酸序列的比對(duì)。在示出的HME序列中用下劃線標(biāo)示的氨基酸表示預(yù)測(cè)的線粒 體靶向序列（MTS)。
[0022] 圖2 :示出用于解脂耶氏酵母ME異位表達(dá)的質(zhì)粒。構(gòu)建體pME(A)包含用于過(guò)表達(dá) 全長(zhǎng)（天然的）解脂耶氏酵母ME (YlME)的盒（FBAIN : :HME : :PEX20)，而構(gòu)建體pMET2 (B) 包含用于過(guò)表達(dá)截短（胞漿）解脂耶氏酵母ME(Y1ME-T2)的盒（FBAIN : A1ME-T2 : :PEX20)。 構(gòu)建體pBlue-YURA3 (C)用于對(duì)照目的。
[0023] 圖3:示出YlME和HME-T2的氨基酸序列比對(duì)。這種型式的HME與圖1所示的 解脂耶氏酵母中天然表達(dá)的ME相比有一個(gè)殘基（第二個(gè)氨基酸）不同。
[0024] 圖4:示出耶氏酵母屬中用于產(chǎn)生《-3和《-6脂肪酸的生物合成途徑。
[0025] 圖5:示出破壞基因組中的ME基因座的一般方案。簡(jiǎn)而言之，已經(jīng)靶向ME缺失 構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體選擇Ura +表型，然后通過(guò)5-氟乳清酸（5-F0A)選擇Ura^表型。隨后篩選 Ura-克隆，其中ME基因已經(jīng)與URA3基因一起重組出基因組。
[0026] 圖6:示出的是用于敲除解脂耶氏酵母中的ME基因的質(zhì)粒pME-KO。
[0027]表.1:某因矛口蛋白質(zhì)序歹y號(hào)y匸點(diǎn)、
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬（Yarrowia)菌種，包含： (i) 編碼胞漿蘋果酸酶的多核苷酸； (ii) 所述耶氏酵母屬菌種細(xì)胞干重的至少約35重量％的脂質(zhì)含量；和 (iii) 經(jīng)工程化的多不飽和脂肪酸（PUFA)生物合成途徑， 其中所述胞漿蘋果酸酶的過(guò)表達(dá)提高脂質(zhì)含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬菌種，其中所述胞漿蘋果酸酶包含功能障礙的線 粒體靶向序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬菌種，其中所述胞漿蘋果酸酶并不包含線粒體靶 向序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬菌種，其中所述胞漿蘋果酸酶包含與SEQ ID NO: 5具有至少約90%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述胞漿蘋果酸酶具有蘋果酸酶活 性。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬菌種，其中所述脂質(zhì)含量為所述耶氏酵母屬菌種 細(xì)胞干重的至少約50重量％。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬菌種，其中所述經(jīng)工程化的PUFA生物合成途徑產(chǎn) 生至少一種選自下列的PUFA:亞油酸、α-亞麻酸、Y-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯 酸、二高- Υ -亞麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳 四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、ω-6二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的耶氏酵母屬菌種，其中所述經(jīng)工程化的PUFA生物合成途徑產(chǎn) 生二十碳五烯酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耶氏酵母屬菌種，所述耶氏酵母屬菌種的菌種是解脂耶氏酵 母（Yarrowia Iipolytica)〇
9. 一種用于提高轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬菌種的脂質(zhì)含量的方法，所述方法包括： a) 培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因耶氏酵母屬菌種，其中產(chǎn)生包含至少一種PUFA的微生 物油，以及 b) 任選地，回收步驟（a)的微生物油。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述胞漿蘋果酸酶包含功能障礙的線粒體靶向 序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述胞漿蘋果酸酶并不包含線粒體靶向序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述胞漿蘋果酸酶包含與SEQ ID NO :5具有至 少約90%的序列同一性的氨基酸序列，并且所述胞漿蘋果酸酶具有蘋果酸酶活性。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述脂質(zhì)含量為所述耶氏酵母屬菌種細(xì)胞干重 的至少約50重量％。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述經(jīng)工程化的PUFA生物合成途徑產(chǎn)生至少 一種選自下列的PUFA:亞油酸、α-亞麻酸、 Y-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、二 高-Y -亞麻酸、花生四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳四烯 酸、ω-3二十二碳五烯酸、ω-6二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述經(jīng)工程化的PUFA生物合成途徑產(chǎn)生二十碳 五烯酸。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK104321424SQ201380017157
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月3日
【發(fā)明者】D.J.馬庫(kù)爾, Q.Q.朱, Z.薛 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司