專利名稱：基因已被破壞的酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在酵母中破壞(disrupte)特定染色體DNA的方法，該方法基于同源重組的原理。本發(fā)明還涉及使用所述已被破壞的(disrupted)菌株生產(chǎn)具有工業(yè)實(shí)用性的物質(zhì)。
背景技術(shù)：
基因重組技術(shù)的進(jìn)步使得利用原核或真核生物大規(guī)模生產(chǎn)具有工業(yè)實(shí)用性的物質(zhì)成為可能。在真核生物中，酵母，特別是屬于糖酵母屬(Saccharomyces)的酵母，已被長期應(yīng)用于生產(chǎn)發(fā)酵食物產(chǎn)品，包括日本米酒(sake)和其它酒精飲料，還有麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)也曾被用作含微生物蛋白的食物或飼料。這樣，就已證明了酵母本身的安全性。
酵母能夠快速生長，并且與細(xì)菌相比，酵母通常能以更高的密度培養(yǎng)。另外，與細(xì)菌相比，酵母細(xì)胞可容易地從培養(yǎng)基中分離，所以，可以進(jìn)一步簡化產(chǎn)品的提取和純化方法。鑒于這些特征，利用重組DNAs，酵母已被用作生產(chǎn)有用產(chǎn)品的宿主，并且其實(shí)用性也被證實(shí)。
在各種酵母中，假絲酵母屬的酵母不象糖酵母屬的酵母，當(dāng)在有氧條件下培養(yǎng)時(shí)，不會形成乙醇，而且乙醇也不會抑制其生長，所以，通過連續(xù)地高密度培養(yǎng)可以有效地制備細(xì)胞從而有效地制備產(chǎn)品。另外，不產(chǎn)子囊孢子的酵母——麥芽糖假絲酵母的特征在于它能夠利用并生長在C6-C40直鏈烴，脂肪和油上，如棕櫚油和椰子油，每一種都可單獨(dú)作為碳源。由于這個(gè)特點(diǎn)有益于轉(zhuǎn)換疏水性化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)有用物質(zhì)以及將該酵母作為反應(yīng)器進(jìn)行應(yīng)用，因此，都期待著能夠?qū)⒔湍笐?yīng)用于生產(chǎn)各種化合物(參見Wolf K(編)Nonconventional yeaste in Biotechnology.A Handbook，Springer-Verlag Berlin(1996)，411-580頁)。另外，該特點(diǎn)還被期待通過基因重組麥芽糖假絲酵母從而用于生產(chǎn)有用物質(zhì)，因此，已經(jīng)積極地研究發(fā)展了一些基因表達(dá)系統(tǒng)用于該目的(Japanese Kokai Publication Sho-62-74287，Japanese Kokai Publication Sho-62-74288，Japanese Kokai PublicationHei-02-72822)。最近，公開了通過基因重組麥芽糖假絲酵母，可將其用于生產(chǎn)直鏈二羧酸(WO99/04014)。
當(dāng)通過基因重組將酵母用作生產(chǎn)物質(zhì)的宿主時(shí)，有必要獲得具有選擇性標(biāo)記的突變體，如適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)缺陷特征，就象使用大腸桿菌(Escherichiacoli)等菌株那樣。這種突變已通過用誘變劑，如亞硝基胍或甲基磺酸乙酯，隨機(jī)突變而獲得。盡管這種突變方法會產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型突變株，但是，具有轉(zhuǎn)化到目的位點(diǎn)之外的一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的突變體的可能性不可避免。與大腸桿菌等相比，這妨礙了酵母宿主的發(fā)展，可以將其視為阻礙將酵母應(yīng)用為物質(zhì)生產(chǎn)場所的原因。
例如，雖然麥芽糖假絲酵母的宿主-載體系統(tǒng)已發(fā)展了很長時(shí)間，并通過誘變處理已獲得了很多營養(yǎng)缺陷型突變株，但是沒有由這些酵母重組體生產(chǎn)的新型商業(yè)可利用的化學(xué)物質(zhì)。原因是還沒有獲得任何的營養(yǎng)缺陷型菌株能夠比得上野生型的增殖潛力以及對直鏈烴鏈的應(yīng)用能力。通過對麥芽糖假絲酵母的誘變處理獲得的CHA1菌株已被確認(rèn)在ADE1基因和HIS5基因上帶有突變(Kawai S等，Agric.Biol.Chem.，5559-65(1991))，但是其增殖潛力與野生型相差甚遠(yuǎn)。認(rèn)為這是因?yàn)樵谀康奈稽c(diǎn)之外的另一位點(diǎn)或另外幾個(gè)位點(diǎn)也存在突變。
隨機(jī)突變所獲突變株的另一問題是突變位點(diǎn)的自發(fā)回復(fù)現(xiàn)象。這種情況下，回復(fù)體優(yōu)選在培養(yǎng)期間生長，因此，重組體的物質(zhì)產(chǎn)率會降低。另外，如果這個(gè)回復(fù)體泄漏到環(huán)境中，其生存和生長可能性很高，很可能引發(fā)安全標(biāo)準(zhǔn)方面的問題。因此，將通過隨機(jī)突變所獲的酵母菌株作為物質(zhì)生產(chǎn)體是不完善的。這樣，就渴望獲得一種特定營養(yǎng)缺陷基因被單獨(dú)破壞的破壞菌株。
如上所述，已經(jīng)獲得了在ADE1基因，磷酸組氨醇氨基轉(zhuǎn)移酶(HIS5基因)，乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶(URA3基因)等基因中突變產(chǎn)生的許多麥芽糖假絲酵母突變體(參見，Wolf K(編)Nonconvertional Yeast in Biotechnology411-580頁)。但是，還未獲得任何帶有單獨(dú)破壞的特定基因和營養(yǎng)缺陷型的麥芽糖假絲酵母菌株。利用酵母的特點(diǎn)，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建系統(tǒng)用于生產(chǎn)具有工業(yè)實(shí)用性的物質(zhì)，這種基因破壞的菌株是我們期望的。這種基因破壞的菌株不僅是麥芽糖假絲酵母，還可以是我們期望的其它酵母種。
另外，還期望利用麥芽糖假絲酵母的特點(diǎn)在其中生產(chǎn)具有工業(yè)實(shí)用性的物質(zhì)，所述特點(diǎn)也就是其利用并生長于直鏈烴，和脂肪/油，例如棕櫚油和椰子油的能力，每一種都可單獨(dú)作為碳源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明做了大量研究，試圖解決前面討論的問題，通過充分利用基因重組技術(shù)，在染色體DNA同源重組的原理基礎(chǔ)上，利用編碼氨基咪唑核苷酸琥珀氨甲酰合成酶(phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamidesynthase)(EC6.3.2.6)的DNA(ADE1基因)片段，獲得了ADE1基因破壞的酵母，并成功地獲得了必需腺嘌呤的酵母。該基因破壞酵母的增殖潛力和基因表達(dá)能力與誘變處理麥芽糖假絲酵母所獲的ADE1基因突變體CHA1的比較結(jié)果，證明了基因破壞的菌株兩種能力都高于CHA1菌株。這個(gè)以及其它發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)完成了本發(fā)明。
由此，本發(fā)明涉及一種酵母，其中染色體DNA中的ADE1基因已通過與ADE1 DNA片段同源重組而被破壞。本發(fā)明還涉及ADE1基因破壞的酵母轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體被含有同源或異源基因的DNA序列轉(zhuǎn)化。
另外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生基因表達(dá)產(chǎn)物的方法，其包括，培養(yǎng)ADE1基因破壞的酵母的轉(zhuǎn)化體，并從所獲的培養(yǎng)物中回收同源或異源基因表達(dá)產(chǎn)物。更具體地，本發(fā)明提供一種利用轉(zhuǎn)化菌株用于生產(chǎn)工業(yè)實(shí)用性物質(zhì)的方法，所述轉(zhuǎn)化體是通過將同源或異源基因表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到ADE1基因破壞的麥芽糖假絲酵母菌株中而獲得。這里，由3-羥丁酸(3-hydroxybutyrate)(下文簡寫為“3HB”)和3-羥己酸(3-hydroxyhexanoate)(下文簡寫為“3HH”)形成的兩組份共聚聚酯(下文簡寫為“P(3HB-co-3HH)”)用作生物可降解聚酯，聚酯聚合酶和烯?；?CoA水合酶是該聚酯合成反應(yīng)中所用的酶。本發(fā)明者利用將這些聚酯聚合酶基因和烯?；?CoA水合酶基因的轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到本發(fā)明的ADE1基因破壞的麥芽糖假絲酵母菌株中，從而成功地生產(chǎn)了P(3HB-co-3HH)，這說明應(yīng)用ADE1基因破壞的麥芽糖假絲酵母的實(shí)用性。這樣，本發(fā)明還涉及利用ADE1基因破壞的菌株的轉(zhuǎn)化株生產(chǎn)聚酯的方法，其中包括收集培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體所獲培養(yǎng)物中的聚酯。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在詳細(xì)描述本發(fā)明。
通過同源重組用于ADE1基因破壞的酵母沒有特殊限制，可使用保藏在微生物保藏處(如IFO，ATCC等)的酵母，其屬于以下屬Aciculoconidium，Ambrosiozyma，Arthroascus，Arxiozyma，Ashbya，Babjevia，Bensingtonia，Botryoascus，Botryozyma，酒香酵母屬(Brettanomyces)，布氏彈孢酵母屬(Bullera)，Bulleromyces，假絲酵母屬(Candida)，固囊酵母屬(Citeromyces)，Clavispora，隱球酵母屬(Cryptococcus)，Cystofilobasidium，德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)，德克酵母屬(Dekkara)，Dipodascopsis，雙足囊菌屬(Dipodascus)，Eeniella，Endomycopsella，絲囊霉屬(Eremascus)，假囊酵母屬(Eremothecium)，Erythrobasidium，F(xiàn)ellomyces，F(xiàn)ilobasidium，Galactomyces，地霉(Geotrichum)，小季氏酵母屬(Guilliermondella)，有孢漢遜氏酵母屬(Hanseniaspora)，漢遜氏酵母屬(Hansenula)，Hasegawaea，膠珊瑚屬(Holtermannia)，Hormoascus，Hyphopichia，Issatchenkia，克勒克氏酵母屬(Kloeckera)，克勒克氏孢屬(Kloeckeraspora)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)，Kondoa，Kuraishia，Kurtzmanomyces，白冬孢酵母屬(Leucosporidium)，油脂酵母屬(Lipomyces)，洛德酵母屬(Lodderomyces)，鱗斑霉屬(Malassezia)，梅奇酵母屬(Metschnikowia)，Mrakia，Myxozyma，拿遜酵母屬(Nadsonia)，Nakazawaea，針孢酵母屬(Nematospora)， Ogataea，卵孢酵母屬(Oosporidium)，管囊酵母屬，achysolen)，Phachytichospora，Phaffia，畢赤酵母屬，(Pichia)，紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)，紅酵母屬(Rhodotorula)，糖酵母屬(Saccharomyces)，類糖酵母屬(Saccharomycodes)，復(fù)膜孢糖酵母屬(Saccharomycopsis)，Saitoella，Sakaguchia，Saturnospora，裂芽酵母屬(Schizoblastosporion)，裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)，許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)，鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)，擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，Sporopachydermia，Stephanoascus，梗孢酵母屬(Sterigmatomyces)，Sterigmatosporidium，Symbiotaphrina，Sympodiomyces，Sympodiomycopsis，有孢圓酵母屬(Torulaspora)，Trichosporiella，絲孢酵母屬(Trichosporon)，三角酵母屬(Trigonopsis)，Tsuchiyaea，Udeniomyces，Waltomyces，威克酵母屬(Wickerhamia)，擬威克酵母屬(Wickerhamiella)，Williopsis，Yamadazyma，Yarrowia，Zygoascus，接合糖酵母屬(Zygosaccharomyces)，Zygowilliopsis，和Zygozyma等。
在這些酵母中，假絲酵母屬，Yarrowia，克魯維氏酵母屬，有孢漢遜氏酵母，漢遜氏酵母屬等，鑒于其持續(xù)高密度培養(yǎng)下的高效細(xì)胞生產(chǎn)和物質(zhì)生產(chǎn)能力而優(yōu)選這些酵母。特別優(yōu)選假絲酵母屬，鑒于其宿主-載體系統(tǒng)的先進(jìn)研究，因此這種系統(tǒng)可輕松獲得，以及其利用直鏈烴，脂肪和油等等的較高能力。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的ADE1基因破壞的菌株構(gòu)建及其利用中，麥芽糖假絲酵母作為一個(gè)實(shí)例。
實(shí)施本發(fā)明所用的野生型麥芽糖假絲酵母菌株IAM12247可從theInstitute of Applied Microbiology，University of Tokyo或the American TypeCulture Colletion(Manassas，VA，USA)獲得，登記號ATCC 28140。麥芽糖假絲酵母CHA1菌株，腺嘌呤和組氨酸-需要型標(biāo)記突變體，可從上述保藏機(jī)構(gòu)獲得，登記號ATCC 90625。
本發(fā)明所獲的ADE1基因破壞的麥芽糖假絲酵母AC16菌株已根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2000年11月15日保藏在日本通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology International Patent Organism Depositary，Central6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏號FERM BP-7366。
同源重組指兩個(gè)DNA堿基序列之間在它們具有類似序列或同源序列的區(qū)域所發(fā)生的重組。
基因破壞指使基因堿基序列突變或插入其它DNA，或者缺失基因的一部分使得基因不再發(fā)揮功能。基因破壞的結(jié)果就是該基因不能被轉(zhuǎn)錄成mRNA，繼而該結(jié)構(gòu)基因不被翻譯，或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA變得不完整，因此突變或缺失發(fā)生在翻譯產(chǎn)物結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列中，使得該蛋白不能行使其原始功能。
ADE1基因指基因片段，所述基因片段含有帶有5′未翻譯區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)域，氨基咪唑核苷酸琥珀氨甲酰合成酶(EC6.3.2.6)編碼區(qū)，和帶有3′未翻譯區(qū)的終止子區(qū)。麥芽糖假絲酵母ADE1基因基因的堿基序列已公布在GenBankD00855。其DNA序列如SEQ ID NO1所示。
ADE1 DNA片段指能夠與染色體ADE1基因在微生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組從而破壞ADE1基因的DNA。
ADE1酶指氨基咪唑核苷酸琥珀氨甲酰合成酶(EC6.3.2.6)。
術(shù)語“同源基因”指在宿主酵母染色體中存在的基因，或其部分DNA。術(shù)語“異源基因，，指本來并不存在于宿主酵母染色體中的基因，或其部分DNA。
基因表達(dá)盒指環(huán)狀質(zhì)粒，其含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子DNA序列，編碼待表達(dá)基因的DNA，以及含有終止子用以終止轉(zhuǎn)錄的DNA，基因表達(dá)盒可包括能夠于染色體之外行使功能的類型，以及待整合到染色體DNA上才能行使功能的類型。
至于基因表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)基因表達(dá)的物質(zhì)(基因表達(dá)的產(chǎn)物)是目的蛋白或酶時(shí)，該物質(zhì)本身就是基因表達(dá)產(chǎn)物。與基因表達(dá)產(chǎn)物全然不同的物質(zhì)，但是也產(chǎn)生在宿主細(xì)胞中，其顯示出各種酶和輔酶不同的催化活性，也是基因表達(dá)的產(chǎn)物，這些物質(zhì)也屬于基因表達(dá)產(chǎn)物。
“PHA”是聚羥基烷羧酸酯(polyhydroxyalkanoate)的簡寫，表示由3-羥基烷羧酸(3-hydroxyalkanoic acid)共聚形成的可生物降解聚酯。
“ORF2”指根據(jù)來自豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)的聚酯聚合酶編碼基因設(shè)計(jì)的DNA(Japanese Kokai Publication Hei-10-108682)，使得其能夠在麥芽糖假絲酵母中表達(dá)。其堿基序列如SEQ ID NO6所示。
“ORF3”指根據(jù)來自豚鼠氣單胞菌的烯?；?CoA編碼基因設(shè)計(jì)的DNA(Japanese Kokai Publication Hei-10-108682)，使得其能夠在麥芽糖假絲酵母中表達(dá)。其堿基序列如SEQ ID NO7所示。
下文中，描述了構(gòu)建ADE1基因破壞的菌株的方法實(shí)例，使用該破壞的菌株生產(chǎn)聚酯的方法實(shí)例。
(1)構(gòu)建ADE1基因被破壞菌株的方法可使用任何方法用于基因被破壞菌株的構(gòu)建，只要獲得的該被破壞的菌株不能表達(dá)ADE1酶。已經(jīng)報(bào)道了各種基因被破壞的方法，優(yōu)選通過同源重組進(jìn)行的基因破壞，因?yàn)樘囟ǖ幕蚩蓡为?dú)被破壞(Nickoloff J.A.(編)Method in Molecular Biology，47291-302(1995)，Humana Press Inc.Totowa，NJ)。在同源重組技術(shù)中，優(yōu)選簡單一步基因破壞技術(shù)，該技術(shù)僅含有一個(gè)將基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中的過程，因?yàn)楸黄茐木晁@得的重組菌株在處理過程中非常安全，不帶有自發(fā)性回復(fù)。
一步基因破壞法中通常所用的ADE1 DNA片段是來自基因的DNA片段，所述基因通過部分基因內(nèi)DNA消除和剩余兩末端的重新連接而形成。這種DNA片段可通過如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法制備，或用限制性酶酶切載體，再重新連接。ADE1 DNA片段兩個(gè)末端的同源區(qū)域長度足以使其包含至少10個(gè)堿基，優(yōu)選不少于200個(gè)堿基，更優(yōu)選不少于300個(gè)堿基。兩末端中每個(gè)末端的同源性優(yōu)選不少于90％，更優(yōu)選不少于95％。
待消除的部分DNA是這樣的部分由于這種消除，ADE1基因不再表現(xiàn)有酶活性。該部分DNA的長度使得ADE1酶活性不能通過自發(fā)性回復(fù)而恢復(fù)其酶活性。這種部分DNA鏈的長度沒有特殊限制，但優(yōu)選不少于50個(gè)堿基，更優(yōu)選不少于100個(gè)堿基。
在本發(fā)明的實(shí)施中，使用通過消除555bp ADE1酶的編碼DNA片段并將630bp 5′側(cè)DNA片段和400bp 3′側(cè)DNA片段相連接而構(gòu)建被破壞的DNA(圖1)。被消除的部分相應(yīng)于ADE1酶蛋白的大約80％。5′和3′側(cè)DNA片段與原始ADE1基因具有100％的同源性。本發(fā)明實(shí)施中所用的破壞的DNA片段堿基序列如SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明實(shí)施中所用DNA片段是使用pUC119-ADE1制備(Kawai S.等，Agric.Biol.Chem.，5559-65(1991))。這樣，培養(yǎng)pUC119-ADE1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，并從中制備該質(zhì)粒。用合適的限制性酶將ADE1基因的一部分結(jié)構(gòu)基因(編碼ADE1酶蛋白的基因)從質(zhì)粒中切割出來，收集載體端并使用連接酶重新連接。這樣就得到含有被破壞的DNA的載體。
將含有被破壞的DNA的載體轉(zhuǎn)化到足夠多的大腸桿菌菌株中，如JM109或DH5α，大量培養(yǎng)的述大腸桿菌菌株，氯化銫超速離心大規(guī)模制備高純度的質(zhì)粒(Sambrook等，(編)，Molecular cloningA Laboratory Manual，Second Edition，1.42-1.47，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。盡管該載體可直接用于基因的破壞，但期望用一步破壞法利用合適的限制性酶將含有ADE1區(qū)域的同源部分從純化的載體中切除，以用作被破壞的DNA。在本發(fā)明實(shí)施中，用限制性酶SalI切割，并無需純化，即可將DNA片段轉(zhuǎn)化到酵母中，其中ADE1基因可被同源重組而破壞。
而原生質(zhì)體方法，醋酸鋰方法(Takagi M.等，J.Bacteriol，167；551-5(1986))，和電脈沖方法(Kasuske A等，Yeast，8691-197(1992)是已知轉(zhuǎn)化麥芽糖假絲酵母的方法，本發(fā)明應(yīng)用電脈沖方法?？墒褂蒙虡I(yè)儀器用于產(chǎn)生電脈沖。本發(fā)明中使用BTX生產(chǎn)的ELECTRO CELL MANIPULATOR600(San Diego，CA，USA)。所用比色杯為BIO MEDICAL CORPORATIONCO.，LTD(Tokyo，Japan)生產(chǎn)的BM6200(2mm gap blue cap)。電脈沖后，用合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母，篩選所獲的培養(yǎng)細(xì)胞中期望的ADE1被破壞菌株。
在轉(zhuǎn)化體回收的各種方法中，可應(yīng)用所謂的制霉菌素濃縮方法(Snow R.，Nature 211206-207(1966))。該方法原本用于高效地篩選隨機(jī)突變所產(chǎn)生的突變體，但是也認(rèn)為該方法可用于基因被破壞的菌株。例如，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，電脈沖后將培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基中，例如進(jìn)行培養(yǎng)。洗滌細(xì)胞，培養(yǎng)在不含氮源的基本培養(yǎng)基中，然后再在含氮源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)較短的時(shí)期。直接向該培養(yǎng)基中加入制霉菌素，在30℃下進(jìn)行有氧培養(yǎng)1小時(shí)，其中野生型被優(yōu)先殺死。將細(xì)胞懸液涂布在適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基平板上，在30℃培養(yǎng)約2天，生成紅色菌落。
從生成的紅色菌落中，可通過PCR方法或基因組southern雜交法(Sambrook等，(編)，Molecular cloningA Laboratory Manual，Second Edition，1.42-1.47，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))簡易地證實(shí)基因被破壞的菌落。
如果使用PCR，當(dāng)使用ADE1基因的兩個(gè)末端作為引物時(shí)，可在瓊脂糖凝膠電泳中檢測到野生型菌株的正常大小DNA帶，而被破壞菌株檢測到的是由于缺失序列形成的一條較短的帶。在本發(fā)明實(shí)施中，可檢測到約1kbpDNA的帶。當(dāng)染色體DNA，例如在基因被破壞中帶有基因取代或整合時(shí)，應(yīng)該考慮到該基因可能會被插入到預(yù)期位點(diǎn)之外的一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)中，例如插入到一個(gè)未知的、高度同源的一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)中。這種情況下，PCR方法也許無法進(jìn)行證實(shí)。當(dāng)獲得了大量被破壞菌株時(shí)，PCR方法可作為選擇候選(candidate)的理想手段。
為鑒定被破壞的菌株等，必須進(jìn)行基因組southern分析。通過實(shí)施該方法，可以簡易并確定地證明僅僅在預(yù)期位點(diǎn)發(fā)生了基因重組。制備被破壞的菌株染色體DNA和作為對照的野生型菌株染色體DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈詈?，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。在本發(fā)明的實(shí)施中，使用兩種限制性酶通過三種切割方法進(jìn)行鑒定。將DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用限制性酶HpaI和NdeI切割A(yù)DE1基因后獲得264bp的DNA片段，認(rèn)為其仍然存在于被破壞的菌株的基因組中，用GeneImage標(biāo)記/檢測試劑盒(Amersham制造)對該片段進(jìn)行酶標(biāo)記，然后按照內(nèi)附手冊所述進(jìn)行操作，標(biāo)記產(chǎn)物用作souther雜交的檢測探針(SEQ ID NO5)。雜交后，洗滌尼龍膜，用內(nèi)附手冊所述的熒光激發(fā)劑檢測DNA帶。檢測出的條帶與野生型的相比較(IAM 12247)。結(jié)果顯示，三種切割方法確定了兩種菌株，ADE1基因被縮短了約有550bp的部分。
所獲的ADE1基因被破壞的菌株不能合成ADE1酶，從而不能合成腺嘌呤，而腺嘌呤正是ATP的前體。因此，這些菌株不能在不含腺嘌呤的培養(yǎng)基或不含腺嘌呤的環(huán)境中生長。
ADE1基因被破壞的菌株中的一個(gè)菌株被稱為麥芽糖假絲酵母AC16。
(2)使用ADE1基因被破壞的菌株表達(dá)異源基因聚酯的生產(chǎn)方法可使用本發(fā)明的ADE1被破壞的基因表達(dá)同源基因或異源基因。由于酵母可以向培養(yǎng)基中分泌糖鏈修飾(sugar chain-added)的蛋白，而大腸桿菌則不能，所以可利用ADE1被破壞的菌株生產(chǎn)這種蛋白。
能夠轉(zhuǎn)化的同源基因沒有特殊限制，但一個(gè)具有工業(yè)實(shí)用性產(chǎn)物生產(chǎn)的實(shí)例為二羧酸產(chǎn)物，其通過將來自麥芽糖假絲酵母的P450酶基因轉(zhuǎn)化到相同的酵母菌株中而獲得，如WO99/04014所述。異源基因沒有特殊限制，例如轉(zhuǎn)化脂酶基因，淀粉酶基因等等生產(chǎn)這類蛋白。
公知一些假絲酵母屬的酵母，如本發(fā)明所用的麥芽糖假絲酵母，其中的密碼子的翻譯不同于其它生物體從mRNA到蛋白的翻譯過程。在麥芽糖假絲酵母中，亮氨酸密碼子CTG被翻譯成絲氨酸(Ohama T等，Nucleic AcidRes.，214039-4045(1993))，因此，來自大腸桿菌的lacZ基因不會翻譯成活性-半乳糖苷酶(Sugiyama H等，Yeast，1143-52(1995))。這樣，當(dāng)期望表達(dá)異源基因時(shí)，并不總能保證該基因會在麥芽糖假絲酵母中翻譯成功能性蛋白。因此，當(dāng)麥芽糖假絲酵母作為宿主表達(dá)異源基因時(shí)，原則上必須單獨(dú)轉(zhuǎn)換亮氨酸密碼子。但是，為得到更有效的表達(dá)，也可根據(jù)麥芽糖假絲酵母密碼子的使用來修飾其它的氨基酸密碼子。例如可參照Mauersberger S等，(作者)，Candida Maltosa，in Wolf K(編)，Nonconventional Yeasts inBiotechnology.524-527頁，進(jìn)行密碼子轉(zhuǎn)換。
聚酯合成相關(guān)基因可以是與下述通式聚酯的合成相關(guān)的任何基因。下述通式代表聚酯P(3HB-co-3HH)的結(jié)構(gòu)通式，X和Y代表整數(shù)，分別表示聚酯合成中3HB和3HH單位的數(shù)目。
例如，可使用Japanese Kokai Publication Hei-10-108682所述的聚酯聚合酶基因片段。除該聚酯聚合酶基因外，其它與聚酯合成相關(guān)的任何基因都可被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。這樣的基因可以是，如(R)型特異性烯?；?CoA水合酶基因，用以將β氧化途徑中間體烯?；?CoA轉(zhuǎn)換為(R)-3-羥酰-CoA(FukuiT等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，17069-75(1999)；Japanese KokaiPublication Hei-10-108682)。這些基因可含有一個(gè)或多個(gè)突變，如在其堿基序列中的缺失，取代和插入，只要該表達(dá)產(chǎn)物具有實(shí)質(zhì)的酶活性。但如果是異源基因的話，如上所述，無法保證這些基因總會在麥芽糖假絲酵母中被翻譯成能發(fā)揮功能的蛋白，因此有必要修飾氨基酸密碼子。
在本發(fā)明實(shí)施中，使用了來自豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)的聚酯聚合酶和烯?；鵆oA水合酶(Japanese Kokai Publication Hei-10-108682；Fukui T.等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，17069-75(1999))。但是，由于這些酶基因極有可能未被正常翻譯，因此可能不顯示酶活性，要將這兩種酶的一些氨基酸密碼子修飾成在麥芽糖假絲酵母中最適的密碼子，并全部合成兩種DNA。來自麥芽糖假絲酵母聚酯聚合酶和烯?；?CoA水合酶的DNA整個(gè)合成序列分別如序列表中SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示。但是，這些序列標(biāo)示符號碼表示的堿基序列沒有任何限制性含義?？墒褂萌魏纹渌膲A基序列，只要這些酶的氨基酸序列能夠在麥芽糖假絲酵母中表達(dá)。
在酵母中使用的基因表達(dá)盒可如下構(gòu)建將啟動(dòng)子和5′上游激活序列(UAS)的DNA序列在5′上游側(cè)與目的基因連接，并將poly(A)添加信號和終止子DNA序列在3′下游側(cè)與該基因連接。這些DNA序列可以是任何序列，只要它們在目的酵母中具有功能。
啟動(dòng)子包括組成型表達(dá)類型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?？墒褂萌我活愋?，但理想的啟動(dòng)子來自與宿主相同的麥芽糖假絲酵母。在一個(gè)實(shí)施例中，使用麥芽糖假絲酵母ALK1啟動(dòng)子和ALK1終止子(Gen Bank D00481)(TakagiM等，Agric.Biol.Chem.，52217-2226(1989))。
本發(fā)明中用于轉(zhuǎn)化的基因表達(dá)盒可按如下構(gòu)建用于構(gòu)建的載體可以是任何能夠在大腸桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒。還可以具有能夠在酵母中自主復(fù)制的區(qū)域。已知能夠在酵母中自主復(fù)制的載體仍保留在酵母細(xì)胞中。還可以將基因表達(dá)盒整合到染色體中。例如，可使用能在麥芽糖假絲酵母中自主復(fù)制的pUTU1(M.Ohkuma等，J.Biol.Chem.273卷，3948-3953(1998))。
在本發(fā)明實(shí)施中，麥芽糖假絲酵母ALK1基因啟動(dòng)子ALK1p(SEQ IDNO8)與ORF2和ORF3中之一在其5′上游側(cè)連接，而終止子ALK1t(SEQ IDNO9)則在3′下游側(cè)與其連接。
連接啟動(dòng)子、終止子和結(jié)構(gòu)基因的限制性酶切位點(diǎn)可使用PCR方法制備。適用于PCR的引物序列如SEQ ID NO10到SEQ ID NO13所示?？稍谌魏螚l件下實(shí)施PCR，只要目的基因片段可以擴(kuò)增即可。
至于啟動(dòng)子部分，具有5′-末端PvuII位點(diǎn)和3′末端EcoRI位點(diǎn)的ALK1p可使用SEQ ID NO8所示模板和SEQ ID NO10和SEQ ID NO11所示引物構(gòu)建。而終止子部分，具有5′-末端HindIII位點(diǎn)和3′末端EcoRV位點(diǎn)的ALK1t可使用SEQ ID NO9所示模板和SEQ ID NO12及SEQ ID NO13所示引物構(gòu)建。通過將標(biāo)記基因尿嘧啶改為腺嘌呤，可使用衍生自pUTU1和麥芽糖假絲酵母Ade1基因的載體pUTA1作為載體。當(dāng)ALK1p與PUCNT(WO94/03613所述)在其PvuII-EcoRI位點(diǎn)連接并且ALK1t在HindIII-SspI位點(diǎn)與PUCNT連接時(shí)，即可構(gòu)建pUAL1。然后，將ORF2與PUAL1在其NdeI-PstI位點(diǎn)連接，構(gòu)建得到pUAL-ORF2。另外，ORF3與構(gòu)建pUAL1過程中構(gòu)建的pUCNT-ALK1t在NdeI-HindIII位點(diǎn)連接，再進(jìn)一步連接ALK1p，這樣構(gòu)建得到pUAL-ORF3。
然后，使用EcoT22I將ORF2和上游啟動(dòng)子及下游終止子從pUAL-ORF2質(zhì)粒中切除，并與pUTA1在PstI位點(diǎn)連接，構(gòu)建得到pUTA-ORF2。另外，使用SalI將ORF3和上游啟動(dòng)子及下游終止子從PUAL-ORF3切除，并與PUTA-ORF2在SalI位點(diǎn)連接，構(gòu)建得到PUTA-ORF23(上圖2)。通過這種方式，可構(gòu)建在麥芽糖假絲酵母中生產(chǎn)聚酯的基因表達(dá)盒。
使用上述的轉(zhuǎn)化方法用該基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化本發(fā)明的酵母菌株，就產(chǎn)生了具有pUTA-ORF23的麥芽糖假絲酵母AC16(ORF23)菌株。
培養(yǎng)用參與聚酯合成的基因表達(dá)盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母，可以下述方式生產(chǎn)聚酯。培養(yǎng)中所用碳源可以是任何酵母可利用的碳源。當(dāng)啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型時(shí)，可適時(shí)地加入誘導(dǎo)劑。有些情況下，有些誘導(dǎo)劑可作為主要的碳源。至于除了碳源的其它營養(yǎng)源，可使用進(jìn)一步含有氮源的培養(yǎng)基，無機(jī)鹽和其它有機(jī)營養(yǎng)源。培養(yǎng)溫度可以是任何酵母能夠生長的溫度。但是優(yōu)選20-40℃。培養(yǎng)時(shí)間沒有特殊限制但是約為1-7天。此后，可從所獲細(xì)胞或培養(yǎng)物中收集聚酯。
碳源包括碳水化合物，脂肪和油，脂肪酸等。碳水化合物包括葡萄糖，蔗糖，甘油，n-烷等，脂肪和油包括，如油菜籽油，椰子油，棕櫚油，棕櫚仁油等。脂肪酸包括飽和及不飽和脂肪酸，如己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，油酸，棕櫚酸，亞油酸，亞麻酸和豆蔻酸，以及脂肪酸衍生物，如酯和這種脂肪酸的鹽。在實(shí)施例中，可使用脂肪或油作為碳源來培養(yǎng)麥芽糖假絲酵母。當(dāng)使用不能被利用的或利用效率極低的脂肪和油時(shí)，可向培養(yǎng)基中加入脂肪酶改進(jìn)利用能力。還可通過轉(zhuǎn)化脂肪酶基因提供帶有可利用脂肪和油能力的酵母。
至于氮源，可使用氨，銨鹽，如氯化銨，硫酸銨和磷酸銨，還可使用蛋白棟，肉汁提取物，酵母提取物等。
無機(jī)鹽包括磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，磷酸鎂，硫酸鎂，氯化鈉等。
其它有機(jī)營養(yǎng)源可以是，例如氨基酸，如甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，脯氨酸等，以及維生素，如維生素B1，維生素B12，生物素，煙酰胺，泛酸，維生素C等。
誘導(dǎo)劑可以是，例如與脂肪酸代謝相關(guān)的、并且可被脂肪和油或者其降解產(chǎn)物(即脂肪酸)誘導(dǎo)的酶(Alk1，Alk2，Alk3，Alk4，Alk5等)(Ohkuma M等，J.Biol.Chem.，2733948-3953(1998))。
已經(jīng)報(bào)道了許多方法從酵母細(xì)胞中收集聚酯。在本發(fā)明中，可使用下述的方法。培養(yǎng)完畢后，通過離心培養(yǎng)基等方法分離并收集細(xì)胞，再例如用蒸餾水和甲醇洗滌細(xì)胞，干燥。利用有機(jī)溶劑如氯仿，從干燥的細(xì)胞中提取聚酯。為去除細(xì)胞組份，過濾或其它方法處理含有聚酯的有機(jī)溶劑溶液，再向過濾液中加入不良溶劑，如甲醇或己烷，使聚酯沉淀。過濾或離心去除上清，再干燥收集到的聚酯沉淀。這樣可收集聚酯。
可通過例如氣相層析法，核磁共振光譜測定法等分析所獲的聚酯。


圖1顯示pUC119-ADE1以及構(gòu)建ADE1被破壞的DNA方法的圖。
圖2顯示來自豚鼠氣單胞菌的聚酯聚合酶和烯?；鵆oA水合酶表達(dá)盒，pUTA-ORF23(圖2，上)，以及不含這兩種酶表達(dá)基因的對照盒pUTA1(圖2，下)。
圖3顯示PCR方法初次篩選ADE1基因被破壞的菌株的結(jié)果。認(rèn)為C16和C17是被破壞的菌株。
圖4顯示基因組southern雜交法證實(shí)ADE1基因被破壞。在C16和C17中，發(fā)現(xiàn)該基因被正常破壞。
圖5顯示在ADE1基因破壞的麥芽糖假絲酵母染色體中破壞的ADE1基因臨近區(qū)域的限制性酶切圖譜，按照southern雜交所示。
圖6顯示ADE1基因破壞的菌株AC16在YPD培養(yǎng)基中的生長曲線。
圖7顯示分別利用棕櫚油，椰子油和十四烷作為碳源，所獲的ADE1基因破壞的菌株AC16生長曲線。
圖8顯示AC16(ORF23)菌株所產(chǎn)生的聚酯P(3HB-co-3HH)的400MHz質(zhì)子圖表。聚酯每個(gè)質(zhì)子的分配都用數(shù)字表示。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。但是這些實(shí)施例并不意味著對本發(fā)明范圍的限制。
除非另有說明，培養(yǎng)酵母所用試劑都是購自Wako Pure ChemicalIndusties的商品。
(培養(yǎng)基組份)LB培養(yǎng)基10g/L胰蛋白棟，5g/L酵母提取物，5g/L氯化鈉。如果是LB平板，還需要加入16g/L的瓊脂。
YPD培養(yǎng)基10g/L酵母提取物，20g/L聚蛋白棟，20g/L葡萄糖。如果是YPD平板，還要加入20g/L瓊脂，如果是含腺嘌呤的YPD培養(yǎng)基，還需要加入0.1g/L的腺嘌呤。
YM培養(yǎng)基3g/L酵母提取物，3g/L麥芽提取物，5g/L Bacto-蛋白棟，10g/L葡萄糖。
SD培養(yǎng)基6.7g/L不含氨基酸的酵母含氮堿基(YNB)，20g/L葡萄糖。如是含腺嘌呤的培養(yǎng)基，還需加入24mg/L腺嘌呤。如果是SD平板，還需加入20g/L瓊脂。
M培養(yǎng)基0.5g/L硫酸鎂，0.1g/L氯化鈉，0.4mg/L硫胺素，0.4mg/L吡哆醇，0.4mg/L泛酸鈣，2mg/L肌醇，0.002mg/L生物素，0.05mg/L氯化鐵，0.07mg/L硫酸鋅，0.01mg/L硼酸，0.01mg/L硫酸銅，0.01mg碘化鉀，87.5mg/L磷酸二氫鉀，12.5mg/L磷酸氫二鉀，0.1g/L氯化鈣，20g/L葡萄糖。如果是含硫酸銨的M培養(yǎng)基，還需要加入1g/L硫酸銨。如果是含硫酸銨和腺嘌呤的M培養(yǎng)基，還需要向M培養(yǎng)基中加入1g/L硫酸銨和24mg/L腺嘌呤。
聚酯生產(chǎn)培養(yǎng)基6.7g/L YNB，10g/L酪蛋白氨基酸，用20g/L n-鏈烷或脂肪/油補(bǔ)充，作為碳源。
使用50ml的檢測試管，500ml Sakaguchi燒瓶或2L Sakaguchi燒瓶進(jìn)行酵母細(xì)胞的液體培養(yǎng)。如果使用50ml試管培養(yǎng)，則以300rpm進(jìn)行搖床培養(yǎng)，如果是500ml Sakaguchi燒瓶(flask)，則以100-110rpm進(jìn)行，2L Sakaguchi燒瓶為90-100rpm。在液體培養(yǎng)和平板培養(yǎng)中溫度均為30℃。
(限制性酶處理)在操作手冊推薦的條件下，或根據(jù)Sambrook等(編)Molecular CloningA Laboratory Manual，second Editoin，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)所述方法的條件，進(jìn)行限制性酶處理。
在本發(fā)明中，使用了許多商品試劑盒，除非另有說明，操作都按照內(nèi)附手冊所述進(jìn)行。
(實(shí)施例1)構(gòu)建被破壞的DNA用MunI和HpaI，切割大腸桿菌中所用的、含ADE1基因的載體pUC119-ADE1(4.64kbp)(Kawai S等，Agric.Biol.Chem.，5559-65(1991))，然后使用TAKARA平頭(Bluting)試劑盒(Takara Shuzo制品)進(jìn)行平頭處理。處理后將DNA在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，將含有載體及ADE1兩側(cè)的片段(4.19kbp)與MunI/HpaI切割片段(約550bp)彼此分離。使用EASYTRAP(Takara Shuzo制品)，從瓊脂糖凝膠中收集帶有ADE1兩個(gè)端點(diǎn)片段的載體，再用TAKARA連接試劑盒Ver2(Takara Shuzo制品)，連接ADE1的兩個(gè)端點(diǎn)。將反應(yīng)混合物以不高于5％的溶液比率加入到100μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，從而轉(zhuǎn)化大腸桿菌。加入足量的LB培養(yǎng)基，經(jīng)過1小時(shí)的搖床培養(yǎng)后，用細(xì)胞懸液涂布LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取形成的幾個(gè)菌落，并以常規(guī)方式培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA。用限制性酶SalI酶切質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)了1.03kbp的條帶。這樣，獲得了用于被破壞的目的載體。在LB培養(yǎng)基中大規(guī)模生產(chǎn)這種轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，根據(jù)Molecular cloningA Laboratory Manual，Second Edition，1.42-1.47，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，通過氯化銫超速離心大量制備該載體。使用SalI酶切用于被破壞的ADE1 DNA，以進(jìn)行一步破壞法。將DNA的總量控制在5mg/ml水溶液，酶切的DNA無需純化，即可用于基因破壞。
(實(shí)施例2)基因破壞實(shí)驗(yàn)將麥芽糖假絲酵母菌株IAM 12247接種在10ml YM培養(yǎng)基中，過夜預(yù)培養(yǎng)。然后將1ml預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基接種在100ml YM培養(yǎng)基中(500-mlSakaguchi燒瓶)，經(jīng)過6小時(shí)培養(yǎng)后，離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在500ìl 1M山梨醇中，加入100μg被破壞的DNA，并輕輕攪拌混合物。
利用電脈沖方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。所用基因轉(zhuǎn)化儀為BTX′s ELECTRO CELLMANIPULATOR 600。所用比色皿為BIO MEDICAL CORPORATION CO.LTD.生產(chǎn)的BM 6200。取100μl制備好的感受態(tài)細(xì)胞/DNA懸液，加入每個(gè)比色皿，將比色皿置于脈沖儀中。然后按下述條件應(yīng)用電脈沖靜電容量40μF，阻力系數(shù)(resistance value)246ohm，電壓1.9kV。脈沖后，向每個(gè)比色皿中加入1ml1M山梨醇，輕輕混合后，室溫下放置1小時(shí)。然后，將混合物轉(zhuǎn)移到100ml YM培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。
(實(shí)施例3)篩選被破壞菌株然后，將培養(yǎng)在YM培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種到50ml不含硫酸銨的M培養(yǎng)基中(500-ml Sakaguchi燒瓶)，過夜培養(yǎng)。再將細(xì)胞懸浮在100ml含有硫酸銨的M培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)6小時(shí)。向該培養(yǎng)基中加入3mg/ml的制霉菌素在乙醇中的溶液(Sigma制品)，使終濃度為10μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)混合物1小時(shí)。用無菌水洗滌制霉菌素處理的細(xì)胞兩次，再次懸浮在50ml無菌水中。用該細(xì)胞懸液涂布YPD平板。30℃下培養(yǎng)該平板2天，這樣形成了24個(gè)紅色的菌落。證實(shí)了這些菌株在SD培養(yǎng)基上均不能生長。
(實(shí)施例4)PCR分析使用PCR方法，從大量紅色菌落中初次篩選被破壞的菌株。將獲得的紅色菌落培養(yǎng)在YPD培養(yǎng)基中。使用染色體提取試劑盒Gentle-Kun(TakaraShuzo制品)，從每個(gè)培養(yǎng)物中提取染色體DNA。使用該染色體DNA和兩個(gè)ADE1基因末端引物(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)，進(jìn)行PCR。使用Perkin Elmer Amplitaq試劑盒進(jìn)行PCR。用Biometra′s TRIO-ThermoblockTM影響基因擴(kuò)增。進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94℃1分鐘，50℃1分鐘，70℃3分鐘。用野生型菌株擴(kuò)增1.56kbp DNA，而用基因被破壞的菌株擴(kuò)增縮短的1.0kbp DNA。將PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，以檢測1.0kbpDNA片段。結(jié)果顯示，在24個(gè)菌株中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌株的ADE1基因被縮短，因此認(rèn)為該基因被破壞。三種菌株中兩種的PCR模式(C16，C17)如圖3所示。
(實(shí)施例5)染色體組southern雜交分析。
使用染色體提取試劑盒Gentle-Kun(Takara Shuzo制品)，提取染色體DNA。用三種方法，即，用DraI，DraI+NdeI，或NdeI對5μg所獲的每個(gè)染色體DNA進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)Molecular cloningA Laboratory Manual，Second Edition，9.31-9.57，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)，將電泳條帶轉(zhuǎn)移到Hybond N+過濾膜(Amersham制品)上，過夜。southem雜交中所用的檢測探針為HpaI-NdeI片段(264 bp)，該片段是ADE1基因內(nèi)的序列，其使用GeneImage標(biāo)記/檢測試劑盒(Amersham制品)酶標(biāo)記(SEQ ID NO5)。雜交后，洗滌濾器，使用同一試劑盒內(nèi)所附的熒光激發(fā)劑進(jìn)行DNA條帶檢測。根據(jù)與野生型菌株IAM 12247所檢測到的條帶相對比，已證實(shí)，在兩種菌株中(C16，C17)，ADE1基因中確實(shí)縮短了約550bp(圖4)，即，染色體中ADE1基因已經(jīng)被破壞。在圖5中，顯示southern雜交所揭示的ADE1基因破壞的麥芽糖假絲酵母染色體中，破壞的ADE1基因臨近區(qū)域的限制性圖譜?！?55 bp”指MunI和HpaI位點(diǎn)之間缺失的部分。“探針”指southern雜交中所用的部分DNA。當(dāng)使用該探針時(shí)，證實(shí)了染色體DNA以下的堿基長度，如圖4所示。在野生型IAM12247中，證實(shí)了向這些值中加上約550bp所獲得的值。
這樣獲得的一個(gè)ADE1基因被破壞菌株被命名為麥芽糖假絲酵母AC16。
(實(shí)施例6)ADE1基因被破壞菌株的增殖能力實(shí)驗(yàn)與野生型菌株IAM 12247和CHA1菌株比較基因被破壞菌株AC16在完全培養(yǎng)基(含腺嘌呤(100mg/L)和組氨酸(100mg/L)的YPD培養(yǎng)基)上的增殖能力。將每種酵母接種在10ml YPD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，以1％的接種量，將該培養(yǎng)物接種在10ml相同的培養(yǎng)基中。一定時(shí)間間隔內(nèi)測定660nm下的OD值。結(jié)果顯示，AC16菌株和野生型菌株的生長在15個(gè)小時(shí)內(nèi)達(dá)到最終階段，而AC16菌株的生長僅為野生型菌株的83％。另一方面，CHA1菌株的生長與AC16菌株的濃度類似；但是AC16菌株提前6小時(shí)達(dá)到該濃度(圖6)。這樣就說明AC16菌株在完全培養(yǎng)基中的增殖能力高于CHA1菌株。
(實(shí)施例7)ADE1基因被破壞菌株的脂肪/油利用能力實(shí)驗(yàn)在基因被破壞菌株中，對比AC16菌株與野生型IAM 12247和CHA1菌株的油/脂肪利用能力。使用的脂肪/油為棕櫚油，椰子油和十四烷，該烷是含有14個(gè)碳原子的n-烷。將每種酵母接種在50ml添加有2％油的YNB培養(yǎng)基中(500-ml Sakaguchi燒瓶)，過夜培養(yǎng)后，以10％的接種量，接種到相同體積的培養(yǎng)基中，一定時(shí)間間隔內(nèi)測定660nm下的OD值。結(jié)果顯示，該時(shí)間獲得的AC16菌株比野生型菌株在棕櫚油和椰子油中的增殖能力約低15％，而比CHA1菌株的油/脂肪利用能力約高4倍(32小時(shí)后6倍)。當(dāng)利用十四烷時(shí)，CHA1顯示出高于脂肪/油(棕櫚油和椰子油)的利用能力，但其能力僅為野生型的55％，AC16菌株的80％。通過這種方式可見，ADE1被破壞菌株對油/脂肪和烷的利用能力高于CHA1菌株。碳源中的生長曲線分別如圖7所示。
(實(shí)施例8)聚酯合成相關(guān)基因的合成根據(jù)豚鼠氣單胞菌的PHA聚合酶和(R)形特異性烯酰基-CoA水合酶的氨基酸序列設(shè)計(jì)聚酯合成相關(guān)的酶基因，所述水合酶能夠?qū)⑾；?CoA轉(zhuǎn)換為單體(R)-3-羥酰-CoA(Fukui T等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，第170卷，69-75頁(1999))，其中的烯?；?CoA是β氧化途徑中的中間體。
在堿基序列的設(shè)計(jì)中，CTG不為亮氨酸密碼子，因?yàn)辂溠刻羌俳z酵母中CTG并不被翻譯成亮氨酸而是絲氨酸。這些麥芽糖假絲酵母偏愛(mostfrequency used)的密碼子優(yōu)選作為每個(gè)相應(yīng)氨基酸的相應(yīng)密碼子。密碼子頻率的可參照Mauersberger S等(著)，Candida maltosa，in Wolf K(編)，Novconventional Yeasts in Biotechnology，524-527頁。這樣設(shè)計(jì)的序列ORF2和ORF3分別如SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示。DNA的合成完全是根據(jù)這些堿基序列進(jìn)行。
(實(shí)施例9)構(gòu)建用于聚酯合成的重組質(zhì)粒為使上面的ORF2和ORF3能夠在麥芽糖假絲酵母中表達(dá)，決定將麥芽糖假絲酵母Alk1基因的啟動(dòng)子ALK1p(SEQ ID NO8)連接到ORF2和ORF3之一的5′上游，并將麥芽糖假絲酵母Alk1基因的終止子ALK1t(SEQID NO9)連接到3′下游。為制備啟動(dòng)子和終止子與結(jié)構(gòu)基因相連接的限制性酶切位點(diǎn)，使用PCR方法。PCR的條件為，94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃ 3分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，使目的基因片段擴(kuò)增。所用的聚合酶時(shí)TakaraShuzo′s ExTaq。至于啟動(dòng)子部分，使用SEQ ID NO8的序列作為模板，以及進(jìn)一步使用SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的序列，構(gòu)建ALK1p，使其具有5′末端的PvuII位點(diǎn)和3′末端的EcoRI位點(diǎn)。使用SEQ ID NO9的序列作為模板，以及進(jìn)一步使用SEQ ID NO12和SEQ ID NO13的序列，構(gòu)建ALK1t的終止子部分，使其具有5′末端的HindIII位點(diǎn)和3′末端的EcoRV位點(diǎn)。最終與ORF2和ORF3連接用的載體為pUTA1載體(圖2下)，其衍生自pUTU1(M.Ohkuma等，J.Biol.Chem.，第273卷，3948-3953頁(1998))和麥芽糖假絲酵母的ADE1基因，以便將標(biāo)記基因由尿嘧啶轉(zhuǎn)換為腺嘌呤，所述pUTU1是通過將麥芽糖假絲酵母自主復(fù)制的序列(ARS)(Gen Bank D29758)和URA3基因(Gen Bank D12720)與pUC19相連而形成。pUTA1載體是使用XhoI，從pUTU1中去除URA3基因，再將其與SalI酶切的ADE1基因片段相連而形成。
將ALK1p與pUCNT(WO 94/03613所述)在PvuII-EcoRI位點(diǎn)相連，將ALK1t與pUCNT在HindIII-SspI位點(diǎn)相連，構(gòu)建pUAL1。然后，將ORF2與pUAL1在NdeI-PstI位點(diǎn)相連，構(gòu)建質(zhì)粒pUAL-ORF2。另外，將ORF3與pUAL1構(gòu)建過程中構(gòu)建的pUCNT-ALK1t在NdeI-HindIII位點(diǎn)連接，構(gòu)建pUAL-ORF3，再進(jìn)一步連接ALK1p。
然后，使用EcoT22I將ORF2和上游啟動(dòng)子及下游終止子從質(zhì)粒pUAL-ORF2中酶切除去，并與pUTA1在PstI位點(diǎn)連接，構(gòu)建pUTA-ORF2。另外，使用SalI將ORF3和上游啟動(dòng)子及下游終止子從質(zhì)粒pUAL-ORF3中酶切除去，并與pUTA-ORF2在SalI位點(diǎn)連接，構(gòu)建質(zhì)粒pUTA-ORF23(圖2，上)。以上述方式，構(gòu)建得到聚酯生產(chǎn)所用的麥芽糖假絲酵母基因表達(dá)盒。
(實(shí)施例10)轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)聚酯為轉(zhuǎn)化AC16菌株和CHA1菌株，將每種酵母都培養(yǎng)在YM培養(yǎng)基中，直到660nm下OD值達(dá)到0.8-1.0，離心收集細(xì)胞，將上述表達(dá)載體(pUTA-ORF23)轉(zhuǎn)化到這些細(xì)胞中。在基因轉(zhuǎn)化中，從感受態(tài)細(xì)胞的制備到基因轉(zhuǎn)化均使用GENO TECH′S FastTrackTM-Yeast TransformationSM試劑盒進(jìn)行。基因轉(zhuǎn)化后用這些細(xì)胞涂布M培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。由于ADE1基因已經(jīng)被插入到pUTA-ORF23中，可以合成腺嘌呤。所以，在不含腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長的細(xì)胞是轉(zhuǎn)化體。收集在不含腺嘌呤培養(yǎng)基上生長的細(xì)胞以得到轉(zhuǎn)化株，AC16(ORF23)。以同樣的方法，將pUTA-ORF23轉(zhuǎn)化到CHA1菌株中獲得轉(zhuǎn)化株CHA1(ORF23)。另外，以同樣的方法，使用不含聚酯合成酶的對照載體pUTA1轉(zhuǎn)化AC16菌株和CHA1菌株，獲得轉(zhuǎn)化株AC16(CT)和CHA1(ORFCT)。
(實(shí)施例11)聚酯生產(chǎn)培養(yǎng)所有的聚酯生產(chǎn)培養(yǎng)均使用2-L Sakaguchi燒瓶。首先，將100ìl含有各種重組菌株的甘油貯藏液接種到10ml SD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。再將1ml這樣培養(yǎng)的酵母接種到50ml含硫酸銨的M培養(yǎng)基(含100g/L硫酸銨)中，進(jìn)行葡萄糖饑餓(starvation)。利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)2天使得培養(yǎng)基中的葡萄糖完全耗盡。然后將10ml酵母接種到50ml聚酯生產(chǎn)培養(yǎng)基(500ml Sakaguchi燒瓶)中，培養(yǎng)8小時(shí)，然后將整個(gè)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到500ml相同的聚酯培養(yǎng)基中，進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)120個(gè)小時(shí)。滅菌培養(yǎng)基，離心收集細(xì)胞，甲醇洗滌，然后冷凍干燥。研磨干燥的細(xì)胞，加入100ml氯仿，過夜攪拌該混合物，以提取聚酯。過濾回收氯仿溶液，并使用蒸發(fā)器濃縮到1-2ml，向濃縮物中加入10ml己烷，使不溶于己烷的物質(zhì)沉淀。AC16(ORF23)菌株產(chǎn)生沉淀，而CHA1(ORF23)僅有痕量沉淀。AC16(CT)菌株沒有任何沉淀。干燥AC16(ORF23)所獲的己烷中的沉淀，然后進(jìn)行400MHz質(zhì)子NMR分析(JEOL，JNM-EX400)。NMR圖表結(jié)果如圖8所示。相應(yīng)于聚酯P(3HB-co-3HH)每個(gè)質(zhì)子的每個(gè)峰均由數(shù)字表示。分析顯示3HH級分是9.7％，聚酯的產(chǎn)量是酵母干重的0.1％，在CHA1(ORF23)菌株中也可鑒定聚酯而產(chǎn)量至多0.05％。由此表明可使用本發(fā)明的ADE1基因被破壞的麥芽糖假絲酵母菌株生產(chǎn)聚酯P(3HB-co-3HH)。另外，還說明該被破壞菌株轉(zhuǎn)化株的聚酯產(chǎn)率高于隨機(jī)誘變獲得的ADE1基因突變酵母CHA1。這樣，就證實(shí)了本發(fā)明ADE1基因被破壞的酵母的應(yīng)用。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明已說明ADE1基因被破壞的酵母菌株的應(yīng)用。ADE1基因被破壞的麥芽糖假絲酵母菌株可預(yù)期在基因表達(dá)或基因表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)中用作基因重組的宿主酵母?？梢允蛊溥M(jìn)一步具有不同的營養(yǎng)缺陷型，這會發(fā)展得到作為重組體可安全使用的酵母。
序列表<110>鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會社(KANEKA CORPORATION)<120>基因已被破壞的酵母<130>T648.PBT-3<150>JP2001-011191<151>2001-01-19<160>13<210>1<211>1820<212>DNA<213>麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)<220>
<221>CDS<222>538..1413<223>Ade1<400>1gatccccttc ttcaaacctt taaatgacat tgtttcgttt ctctatgttt ggtatcggtt 60cttcttcttc ttcaaaaaaa aggggggcac tattcaaaaa aaaatattat aacagtatga 120tttttttccc tctcccgtcg attgaggttt tttttttctc tttcgtcttg gtcttttgct 180tttcactcca aaaatggaaa cacgcgcggc tcaactcgaa atccgtgatc aaaaaaataa 240
aggctgtgag tttcgagcca ataattatga attagtggta ttttttttaa agataaataa 300tcaagaatcg cattagggag acgaatatgc gttattcaaa taaaaagaca attcttttag 360ggtagcattt cccttcaagt tcatcccaca tgtacattaa tgtcaatgat gtcgcagaag 420ttaaattagc agaagaaaaa aaaaatgtga attactccga gtcaactctt ctttctcttc 480ttctttttct tctttatcac cataatcacc accaccacca ccaccaccag ctcccagatg 540acttcaacta acttagaagg aactttccca ttgattgcca aaggtaaagt cagagatatt 600taccaagttg acgacaacac tcttttattc gttgctactg atagaatttc cgcatacgat 660gtgattatgt ctaatggtat cccaaataaa ggtaaaatct taaccaaatt gtctgaattc 720tggtttgatt tcttgccaat tgaaaaccat ttaatcaaag gagacatttt ccaaaaatat 780cctcaactag aaccatatag aaaccaattg gaaggcagat ccttacttgt tagaaaattg 840aaattgatcc ctcttgaagt tattgttaga ggttacatca ccggttccgg ctggaaagaa 900taccaaaaat ctaaaaccgt ccacggtatt cctattggtg atgtggttga atcacaacaa 960atcactccta tcttcacccc atccactaaa gcagaacaag gtgaacatga tgaaaatatc 1020accaaagaac aagctgacaa gattgttgga aaagaattat gtgatagaat tgaaaaaatt 1080gctattgatt tgtacaccaa agccagagat tacgctgcca ctaaaggaat tattatcgct 1140gatactaaat ttgaatttgg tttagatggt gacaacatcg ttcttgttga cgaagtttta 1200actccagatt cttccagatt ctggaatgct gctaaatacg aagttggtaa atctcaagac 1260tcttacgata aacaattttt gagagattgg ttaacttcta atggtgttgc tggtaaagat 1320ggtgttgcta tgcctgaaga cattgtcact gaaaccaaga gcaaatacgt tgaagcttac 1380gaaaatttaa ctggtgacaa atggcaagaa taaattaagg atatctatta ttaaagcttt 1440ctatttatcc caaactttcg tagtattttc tgacatgttc agatgttttt actttatctt 1500tcctgaaatt tttgatttct aaccgactct tgcatgtagc tcttgataat gcaacatatg 1560cttgaccatt agcaaaactt ctacctaaat ctattttgac tctgtccaaa gtttgacctt 1620gagctttgtg gatcgacatc gcccacgaca agatcatttg gtttgttttt atggtgggtt 1680attggcactt ggtgcaactg atggtttaac tttggaagag gctaagaaat tgaagacttg 1740gaatgaagaa cgtgcatctg atttcaaatt gggtgaagaa ttgacttata cttgttataa 1800aatgtatcat gatgttgatc 1820
<210>2<211>1032<212>DNA<213>麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)<400>2attataacag tatgattttt ttccctctcc cgtcgattga ggtttttttt ttctctttcg 60tcttggtctt ttgcttttca ctccaaaaat ggaaacacgc gcggctcaac tcgaaatccg 120tgatcaaaaa aataaaggct gtgagtttcg agccaataat tatgaattag tggtattttt 180tttaaagata aataatcaag aatcgcatta gggagacgaa tatgcgttat tcaaataaaa 240agacaattct tttagggtag catttccctt caagttcatc ccacatgtac attaatgtca 300atgatgtcgc agaagttaaa ttagcagaag aaaaaaaaaa tgtgaattac tccgagtcaa 360ctcttctttc tcttcttctt tttcttcttt atcaccataa tcaccaccac caccaccacc 420accagctccc agatgacttc aactaactta gaaggaactt tcccattgat tgccaaaggt 480aaagtcagag atatttacca agttgacgac aacactcttt tattcgttgc tactgataga 540atttccgcat acgatgtgat tatgtctaat ggtatcccaa ataaaggtaa aatcttaacc 600aaattgtctg aattctggtt tgatttcttg ccaattaact tctaatggtg ttgctggtaa 660agatggtgtt gctatgcctg aagacattgt cactgaaacc aagagcaaat acgttgaagc 720ttacgaaaat ttaactggtg acaaatggca agaataaatt aaggatatct attattaaag 780ctttctattt atcccaaact ttcgtagtat tttctgacat gttcagatgt ttttacttta 840tctttcctga aatttttgat ttctaaccga ctcttgcatg tagctcttga taatgcaaca 900tatgcttgac cattagcaaa acttctacct aaatctattt tgactctgtc caaagtttga 960ccttgagctt tgtggatcga catcgcccac gacaagatca tttggtttgt ttttatggtg 1020ggttattggc ac 1032<210>3<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3taacagtatg atttttttcc ctct 24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4aacaaaccaa atgatcttgt cgtg 24<210>5<211>264<212>DNA<213>麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)<220>
<221>CDS<223>探針
<400>5aacttctaat ggtgttgctg gtaaagatgg tgttgctatg cctgaagaca ttgtcactga 60aaccaagagc aaatacgttg aagcttacga aaatttaact ggtgacaaat ggcaagaata 120aattaaggat atctattatt aaagctttct atttatccca aactttcgta gtattttctg 180acatgttcag atgtttttac tttatctttc ctgaaatttt tgatttctaa ccgactcttg 240catgtagctc ttgataatgc aaca 264<210>6<211>1785<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>1..1785<223>ORF2<400>6atg tct caa cca tct tat ggt cca ttg ttc gaa gct ttg gct cat tac 48aat gat aaa ttg ttg gct atg gct aaa gct caa acc gaa aga act gct 96caa gcc ttg ttg caa act aac ttg gat gat ttg ggt caa gtt ttg gaa 144caa ggt tct caa caa cca tgg caa ttg att caa gct caa atg aat tgg 192tgg caa gat caa tta aaa ttg atg caa cac act ttg tta aaa tct gct 240ggt caa cca tct gaa cca gtt att act cca gaa aga tct gat aga aga 288ttt aaa gct gaa gct tgg tct gaa caa cca att tat gat tac tta aaa 336caa tcc tat ttg tta act gct aga cat ttg ttg gct tct gtt gat gct 384ttg gaa ggt gtc cca caa aaa tct aga gaa aga ttg aga ttc ttt act 432aga caa tac gtc aac gct atg gct cca tct aat ttc ttg gct act aac 480
cca gaa ttg tta aaa ttg act ttg gaa tcc gat ggt caa aat ttg gtt 528aga ggt ttg gct tta ttg gct gaa gat ttg gaa aga tct gct gat caa 576tta aac att aga ttg act gat gaa tcc gct ttt gaa tta ggt aga gat 624ttg gct ttg act cca ggt aga gtt gtt caa aga act gaa tta tat gaa 672tta att caa tac tct cca act act gaa acc gtt ggt aaa acc cca gtt 720ttg atc gtt cca cca ttc att aat aaa tat tac att atg gat atg aga 768cca caa aac tcc ttg gtc gct tgg ttg gtc gct caa ggt caa acc gtt 816ttc atg att tcc tgg aga aac cca ggt gtt gct caa gct caa att gat 864tta gat gat tat gtt gtt gat ggt gtc att gct gct ttg gat ggt gtt 912gaa gcc gct act ggt gaa aga gaa gtt cac ggt att ggt tac tgt att 960ggt ggt acc gct ttg tct tta gct atg ggt tgg ttg gcc gcc aga aga 1008caa aaa caa aga gtt aga act gct act ttg ttt act act ttg ttg gat 1056ttc tcc caa cca ggt gaa ttg ggt att ttt att cat gaa cca att atc 1104gcc gcc tta gaa gcc caa aat gaa gct aaa ggt att atg gat ggt aga 1152caa ttg gcc gtc tcc ttc tct ttg ttg aga gaa aac tct tta tat tgg 1200aat tac tat att gat tct tac tta aaa ggt caa tct cca gtt gct ttt 1248gat ttg ttg cac tgg aac tct gat tct act aat gtt gcc ggt aaa act 1296cat aac tct ttg ttg aga aga tta tat ttg gaa aat caa ttg gtt aaa 1344ggt gaa tta aaa att aga aac act aga att gat tta ggt aaa gtt aaa 1392act cca gtt ttg ttg gtt tct gcc gtt gat gat cac att gct tta tgg 1440caa ggt acc tgg caa ggt atg aaa ttg ttc ggt ggt gaa caa aga ttt 1488tta ttg gcc gaa tcc ggt cat att gct ggt att att aat cca cca gct 1536gct aac aaa tac ggt ttc tgg cac aat ggt gct gaa gct gaa tct cca 1584gaa tct tgg ttg gct ggt gcc acc cat caa ggt ggt tcc tgg tgg cca 1632gaa atg atg ggt ttt att caa aac aga gat gaa ggt tct gaa cca gtc 1680cca gcc aga gtc cca gaa gaa ggt ttg gct cca gct cca ggt cac tat 1728gtc aaa gtt aga tta aac cca gtt ttc gct tgt cca acc gaa gaa gat 1776gct gct taa 1785
<210>7<211>405<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>1..404<223>ORF3<400>7atg tct gct caa tcc ttg gaa gtt ggt caa aaa gct aga tta tct aaa 48aga ttc ggt gcc gcc gaa gtt gct gct ttt gct gcc tta tct gaa gat 96ttc aac cca ttg cac ttg gat cca gct ttt gct gct act acc gcc ttc 144gaa aga cca atc gtc cat ggt atg ttg tta gct tct tta ttt tcc ggt 192ttg ttg ggt caa caa ttg cca ggt aaa ggt tct att tat ttg ggt caa 240tct tta tct ttc aaa ttg cca gtc ttt gtc ggt gat gaa gtt acc gct 288gaa gtt gaa gtt act gct ttg aga gaa gat aaa cca att gct act ttg 336act act aga att ttc act caa ggt ggt gct tta gct gtt acc ggt gaa 384gct gtt gtc aaa ttg cca taa 405<210>8<211>1017<212>DNA<213>麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)<220>
<223>啟動(dòng)子ALK1p<400>8atgcatgaac aggatttaat cccaagaaaa aagtctattt tctattttca caaggaaact 60ggaaaaacct ttttgtgttt tgaagtagct ccgtaataac ctgtaaaaaa ataaattttg 120aagatttgac ttgctgatga aaatgctatc agtgtagctc tagacttgat actagactat 180gatggcaaca catggtggtc aacgtgcaag acatcaccca atgagaagac tgctaaccag 240aaaaaaaagg ggacaaaaga aaaactcgag agaaaaagtc aaattggtgt aaaattggct 300atttttggta ctttcctaat ggggaaatta attgtttaaa attccagttt ttccagagtt 360aagatttcga ccaattattt ttaatccata tgatcttcat cattatcaac ttgtgaaaaa 420taataatcga ggtacgttta atacgagata ttagtctacg gctatgaatg ttggatatac 480ttcattgacg atcagaagct tgattggtta ttcaggtgca tgtgtggata taaacccaac 540aaattatcta gcaactgtgc cttccccaca ttggtcaaag aaaccctaaa gcaaattaaa 600atctggataa ataaatcatt catttcacat tttccggtta gtataaggtt ttttaaattt 660ttttttacag tttagccctt tcaattacca aatacggtaa caatgtgctt tgtaacatgc 720aggggatttt ctccgttgct gttttctcca catgctttta atgtgtaata aattaaaaaa 780attacaaaga aaaaccggca tataagcatc ggagtttaca ttgttaacta actgcaaaat 840ggcgatgttt caaatcaaca aaatttaaaa aaaccccaaa aaaaaagtat catataaatt 900aaactcaaaa tccttttgat tgcataaaat ttttaaatct cttctttttt ttctttttta 960ctttcttatc tattctattc tttttttata tatctaattc atttataaca tctggtc 1017<210>9<211>218<212>DNA<213>麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)<220>
<223>終止子ALK1t
<400>9atagatggat ttttcttttt tatgtgtatt tccggttaat aaatgtttaa attttttttt 60taataaaaat atttgtagtt atttatatgc aaaaaaaaaa aatattcaaa gcaatcttcc 120tttctttctt tatctttccc ccatgctaag gtctaaaaca ccacaactta aaacccaact 180taaccgtata atactaagat caatctccaa agatgcat 218<210>10<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10tttttcagct ggagctcgtc gacatgcatg aacaggattt aatccc 46<210>11<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ccggaattcc atatgcagat gttataaatg aattagata 39
<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12cggaagctta tagatggatt tttctttttt at 32<210>13<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13tttttgatatc gagctcgtcg acatgcatct ttggagattg atctt 4權(quán)利要求
1.一種酵母，其中染色體DNA中的ADE1基因已通過與ADE1 DNA片段進(jìn)行的同源重組而破壞。
2.權(quán)利要求1所述的ADE1基因已被破壞的酵母，其可屬于下述的任何屬Aciculoconidium，Ambrosiozyma，Arthroascus，Arxiozyma，Ashbya，Babjevia，Bensingtonia，Botryoascus，Botryozyma，酒香酵母屬，布氏彈孢酵母屬，Bulleromyces，假絲酵母屬，固囊酵母屬，Clavispora，隱球酵母屬，Cystofilobasidium，德巴利氏酵母屬，德克酵母屬，Dipodascopsis，雙足囊菌屬，Eeniella，Endomycopsella，絲囊霉屬，假囊酵母屬，Erythrobasidium，F(xiàn)ellomyces，F(xiàn)ilobasidium，Galactomyces，地霉屬，小季氏酵母屬，有孢漢遜氏酵母屬，漢遜氏酵母屬，Hasegawaea，膠珊瑚屬，Hormoascus，Hyphopichia，Issatchenkia，克勒克氏酵母屬，克勒克氏孢屬，克魯維氏酵母屬，Kondoa，Kuraishia，Kurtzmanomyces，白冬孢酵母屬，油脂酵母屬，洛德酵母屬，鱗斑霉屬，梅奇酵母屬，Mrakia，Myxozyma，拿遜氏酵母屬，Nakazawaea，針孢酵母屬，Ogataea，卵孢酵母屬，管囊酵母屬，Phachytichospora，Phaffia，畢赤氏酵母屬，紅冬孢酵母屬，紅酵母屬，糖酵母屬，類糖酵母屬，復(fù)膜孢糖酵母屬，Saitoella，Sakaguchia，Saturnospora，裂芽酵母屬，裂殖糖酵母屬，許旺氏酵母屬，鎖擲酵母屬，擲孢酵母屬，Sporopachydermia，Stephanoascus，梗孢酵母屬，Sterigmatosporidium，Symbiotaphrina，Sympodiomyces，Sympodiomycopsis，有孢圓酵母屬，Trichosporiella，絲孢酵母屬，三角酵母屬，Tsuchiyaea，Udeniomyces，Waltomyces，威克酵母屬，擬威克酵母屬，Williopsis，Yamadazyma，Yarrowia，Zygoascus，接合糖酵母屬，Zygowilliopsis，和Zygozyma。
3.權(quán)利要求1所述的ADE1基因已被破壞的酵母，其可屬于以下任何屬假絲酵母屬，Yarrowia，克魯維氏酵母屬，有孢漢遜氏酵母屬。
4.權(quán)利要求1所述的ADE1基因已被破壞的酵母，其屬于假絲酵母屬。
5.權(quán)利要求4所述的ADE1基因已被破壞的酵母，其為麥芽糖假絲酵母。
6.權(quán)利要求5所述的ADE1基因已被破壞的酵母，其為麥芽糖假絲酵母AC16(FERM BP-7366)。
7.權(quán)利要求1-6任一的ADE1基因已被破壞的酵母轉(zhuǎn)化體，其被含有同源或異源基因的DNA序列轉(zhuǎn)化。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)化體，其中ADE1基因已被破壞的酵母屬于假絲酵母屬。
9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化體，其中ADE1基因已被破壞的酵母是麥芽糖假絲酵母。
10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化體，其中ADE1基因已被破壞的酵母是麥芽糖假絲酵母AC16(FERM BP-7366)。
11.一種生產(chǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求7-10的任一轉(zhuǎn)化體，并從所獲的培養(yǎng)物中收集同源或異源基因表達(dá)產(chǎn)物。
12.權(quán)利要求11的生產(chǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的方法，其中基因表達(dá)產(chǎn)物是聚酯。
全文摘要
本發(fā)明提供一種酵母，其中特定的基因被單獨(dú)破壞，并使其具有營養(yǎng)缺陷型，以通過基因重組，利用酵母的特點(diǎn)，構(gòu)建生產(chǎn)具有工業(yè)實(shí)用性物質(zhì)的體系。在本發(fā)明實(shí)施中，使用編碼麥芽糖假絲酵母氨基咪唑核苷酸琥珀氨甲酰合成酶(EC6.3.2.6)的ADE1基因片段，與染色體DNA同源重組，構(gòu)建ADE1基因被破壞的酵母菌株。在本發(fā)明實(shí)施中，將該破壞的菌株用含有可生物降解聚酯合成酶基因的基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)所獲的轉(zhuǎn)化體，從而生產(chǎn)可生物降解的聚酯。
文檔編號C12R1/72GK1498270SQ0280687
公開日2004年5月19日 申請日期2002年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者福地健, 橫溝聰, 小坂田史雄, 松本圭司, 高木正道, 太田明德, 史雄, 司, 德, 道 申請人:鐘淵化學(xué)工業(yè)株式會社