專利名稱：用于鑒定基因功能的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效鑒定核酸序列編碼產(chǎn)物的一種或多種功能的方法及其相關(guān)組合物。該方法利用在細胞中過量和/或不足表達此產(chǎn)物的能力，以及這些結(jié)果的聯(lián)合，使得能夠鑒定該產(chǎn)物的至少一種細胞或體內(nèi)功能特性。
背景技術(shù)：
測定人類和其它生物的基因組序列所作出的巨大努力已產(chǎn)生了大量可用于額外分析的核酸和蛋白質(zhì)序列信息。許多序列信息現(xiàn)在，或者將來，將是生化和功能特征研究的主題。該序列信息還可作為“生物信息學(xué)”的原材料，其中該序列本身用于與以前已鑒定了結(jié)構(gòu)、功能、或其它特征的其他序列作比較。這些努力的主要希望和期待是鑒定遺傳序列所編碼的功能，可開發(fā)用于人類和其它生物疾病的其它治療學(xué)產(chǎn)品或療法。
鑒定遺傳序列所編碼的功能的努力，至少最初集中于編碼實際的基因產(chǎn)物的序列，或“基因”上。早期尋找克隆和編碼基因的序列的方法依據(jù)通過定位克隆法對基因作圖和克隆的策略和工具。由于人們大量的努力，定位克隆在確定各種疾病相關(guān)基因的位置上取得了成功。首先，基因作圖是依據(jù)相關(guān)個體的大家族進行的，在染色體定位水平上和厘摩的范圍內(nèi)確定疾病相關(guān)基因的位置。其次，隨著此種努力的顯著增強，這項工作成為一種對基因物理作圖的工作，因此從厘摩降低至兆堿基對，然后最終至具體的核苷酸。定位克隆成功的例子包括囊性纖維化和杭廷頓氏舞蹈病(Huntington’s disease)相關(guān)基因的鑒定。
分離基因的其它方法包括外顯子截留(Buckler等(1991)P.N.A.S.884005-4009)和直接選擇(Morgan等(1992)N.A.R.205173-5179)。這些方法可在大范圍的基因組區(qū)域內(nèi)鑒定潛在的基因，然后測定該基因的序列并用于當實際表達時證實該基因。在有些情況下，正常表達某潛在基因的細胞是未知的，因此仍然需要證實該基因的表達和鑒定基編碼產(chǎn)物的功能。
定位克隆較之上述兩種方法可獲得的主要優(yōu)越性在于它不需要知道被鑒定基因的基因產(chǎn)物的功能或生理作用，可根據(jù)隨后的表型性狀進行鑒定，之后研究具有該性狀的具體序列的遺傳分離。但是，鑒定后，在確定用于設(shè)計適當療法的基因產(chǎn)物的功能作用中仍有困難。不知道編碼產(chǎn)物的功能作用，仍難以(例如)鑒定出用作藥物的適當制劑，來適當?shù)貙⒃摶虍a(chǎn)物靶向。此外，尚不知所鑒定的基因是怎樣參與發(fā)病后的進展以及疾病后期的進展。
最近基因分離的一種方法是根據(jù)設(shè)計用來鑒定基因組中所有表達序列的大量測序成果。最近報道了在人和果蠅以及一些微生物基因組中已完成的該成果。但是隨著這種大量序列信息的產(chǎn)生，需要進一步增加用于鑒定所編碼的基因產(chǎn)物的功能的快速和有效的方法。這一需要導(dǎo)致對于鑒定基因功能的其它方法的大量的商業(yè)和工業(yè)行為活動。
一種鑒定功能的方法是通過生物信息學(xué)，它根據(jù)某新序列和其它先前已鑒定了結(jié)構(gòu)、功能、或其它特征的序列之間的相似性而尋求確定功能。生物信息學(xué)最通常使用計算機程序來進行因此被稱為發(fā)生“在硅片中”。然而，生物信息學(xué)的一個缺點是它僅提供可能驗證一個基因序列的假定功能的起點。直到在活細胞或生物體內(nèi)實際表達和特征分析了一個新序列，所提出功能仍然是特證明的假說。
驗證給定基因功能的一種方法是通過使用小動物模型。例如，用轉(zhuǎn)基因小鼠過量表達某基因序列以試圖鑒定其編碼的功能?；蛐蛄羞€用于產(chǎn)生內(nèi)源性小鼠序列不再表達的“敲除”小鼠。但是轉(zhuǎn)基因方法的時間和花費限制了它們的用途每次只能研究少數(shù)幾個序列。
已采用另一種細胞培養(yǎng)方法來過量表達感興趣的基因序列。不幸地是還沒有快速而有效的方法來可靠地產(chǎn)生內(nèi)源性細胞序列不表達或過量表達的“敲除”細胞。然而，過量表達方法受到了用于傳遞和表達基因的載體系統(tǒng)所限制。首要的問題是，已知的載體系統(tǒng)限制了受基因轉(zhuǎn)染的細胞的數(shù)量。例如，質(zhì)粒載體具有低的轉(zhuǎn)染效率并因此需要使用選擇標記以分離轉(zhuǎn)染的細胞。但是，由于感興趣基因不是細胞中唯一被過量表達的基因，因此來自質(zhì)粒載體的標記基因的表達有扭曲被測表型的傾向。不同的表述是，感興趣基因的表達不只是發(fā)生于細胞中的唯一的主要干擾。同樣，基因功能的確定可能由于標記基因的表達造成的扭曲而產(chǎn)生顯著錯誤。使用一些病毒載體，例如致癌-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(onco-retroviral vectors)看到了相同的這種選擇性標記介導(dǎo)的扭曲。
可從其它的病毒載體獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，例如莫過于腺病毒的載體，但是這些載體常常不能提供感興趣基因的穩(wěn)定表達。更重要的是，這些載體經(jīng)常表達大量的它們自身的基因或由于輔助病毒共轉(zhuǎn)染而要冒污染的風險。載體和/或輔助病毒基因的表達也會干擾細胞內(nèi)環(huán)境和扭曲受檢表型并因此影響基因功能的測定。
發(fā)現(xiàn)使用載體為基礎(chǔ)的過量表達的另一種局限，是不能確定應(yīng)當或可能檢測轉(zhuǎn)染細胞中產(chǎn)生的那種表型。而且，這種方法很少使用原代細胞，而是使用由于不正常的細胞環(huán)境受鑒定的基因功能尚有懷疑的細胞系或患病細胞。
上述文獻的引用不意味著承認任何上述都是恰當?shù)膬?yōu)選技術(shù)。所有對于時間的陳述或這些文獻內(nèi)容的說明都是基于申請者可獲得的信息，并不構(gòu)成對于這些文獻的日期或內(nèi)容的正確性的任何許諾。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了能提高對未受鑒定基因序列編碼產(chǎn)物的一種或多種功能的鑒定能力或進一步鑒定或證實已知基因序列的一種或多種功能的組合物和方法。本發(fā)明通過至少兩種方法測定某給定的未受鑒定的或感興趣的已知基因序列的一種或多種功能。首先，將該基因序列，或其一個或多個部分插入一載體中并導(dǎo)入細胞中以表達編碼的基因產(chǎn)物。表達的水平當然可被削弱，但較佳地是，該序列被過量表達。表達發(fā)生后，與不具有所述載體的正常細胞比較，檢測和分析內(nèi)源性細胞因子的表達、組成、或類型的變化。這使得能夠鑒定那些細胞因子受到表達或過量表達的序列的影響。不限制本發(fā)明的范圍，對于細胞因子的實際影響可包括對其表達水平的變化(例如在蛋白質(zhì)和/或RNA水平上)、其氨基酸組成的變化(例如亞基和/或剪接變體的數(shù)量和類型)、和其翻譯后修飾的狀態(tài)(例如磷酸化和/或糖基化和/或脂類修飾)或定位(例如亞細胞定位和可溶性、膜結(jié)合、或該因子的至少一個部分插入膜的疏水部分)的變化的影響。細胞因子包括具有一種或多種已鑒定了功能的細胞因子以及其功能尚未鑒定的細胞因子。
其次，抑制或終止細胞中未受鑒定的或已知的基因序列的表達。不限制本發(fā)明的范圍，可通過利用全部或部分基因序列與所述細胞中該序列的內(nèi)源性單拷貝或多拷貝重組進行抑制來終止其表達。另外，可將該基因序列，或其一個或多個部分，以反義方向插入載體?？烧{(diào)節(jié)該序列或其部分的表達，這樣只有當希望產(chǎn)生反義核酸時它才被表達。
較佳地，將反義序列連接于協(xié)同定位序列，依據(jù)該反義序列的表達，該協(xié)同定位序列能夠用互補的內(nèi)源性細胞的、和“有義”序列協(xié)同定位該反義序列。在本發(fā)明的一些實施例中，反義序列用于靶向核酶以切割內(nèi)源性mRNA。將載體導(dǎo)入細胞中以表達反義序列，該反義序列結(jié)合于互補的內(nèi)源性細胞序列并導(dǎo)致其表達抑制。在反義序列的表達(或使用其它手段)抑制了互補的細胞序列表達后，與未處理的正常細胞相比，檢測和分析上述細胞因子的表達、組成、或類型的變化。這使得能夠鑒定哪些細胞因子受到對應(yīng)于感興趣基因的內(nèi)源性細胞序列(與所用反義序列互補的)表達的降低或抑制的影響。
較佳地，上述感興趣基因序列的過量或不足表達可通過使用能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)而不引起內(nèi)源性載體基因序列明顯表達或輔助病毒污染的病毒載體來進行。這種載體的例子包括描述于2000年9月22日提交的題名為“改良的條件性復(fù)制載體，它們的產(chǎn)生和使用方法”(Improved Conditionally Replicating Vector，Methods forTheir Production and Use)待批美國專利申請09/667,893中的哪些載體，該文獻全部引用作為參考。甚至更佳的是本發(fā)明的實施例，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞是原代細胞。
任選地，作為轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的一部分，將上述用于過量和不足表達的載體整合進入細胞的基因組中。
在本發(fā)明的一個較佳形式中，檢測細胞因子表達的變化。另外，可聯(lián)合并比較兩種方法中檢測到的細胞因子表達的變化，以提供研究的未鑒定的或已知基因序列的一種或多種功能的其他信息。將檢測到的細胞因子表達的變化聯(lián)合，類似于用于研究細胞因子的差別表達對細胞狀態(tài)的擾亂，例如在溫度改變前或改變后或加入生長因子時的，“減法”技術(shù)。
詳細的分析過量表達、不足表達以及二者的結(jié)果，使得能夠鑒定感興趣序列的一種或多種功能，根據(jù)主要是由于過量或不足表達感興趣基因序列造成的變化受到干擾的可靠的細胞內(nèi)環(huán)境。因此，根據(jù)對受所述序列表達變化影響的一個或多個細胞因子的鑒定或影響，可鑒定出所述感興趣基因序列的功能?？赡艿墓δ艿姆窍拗菩岳影ㄕ{(diào)節(jié)所述一個或多個因子的表達和影響所述一個或多個因子的活性。
該分析還使得能夠鑒定與感興趣序列在功能上相關(guān)的一個或多個細胞因子。一組這樣的細胞因子將對感興趣序列的過量表達顯示表達增加，以及對感興趣序列的表達抑制顯示表達減少。另一組細胞因子將與上述相反，對感興趣序列的過量表達顯示表達減少，對感興趣序列的表達抑制顯示表達增加。
這樣鑒定到的n組細胞因子在可被視為對感興趣序列表達的干擾起“協(xié)同反應(yīng)”的一部分。該“協(xié)同反應(yīng)”可能是細胞的一種調(diào)節(jié)性、生化或代謝途徑或其它功能。它還提供了鑒定細胞因子和感興趣基因序列產(chǎn)物之間的功能關(guān)系的手段。
通過觀察感興趣序列的過量或不足表達的影響鑒定“協(xié)同反應(yīng)”細胞因子的能力，提供了減少或消除花費在評價或考慮細胞因子上的時間的一種便利方法，該細胞因子顯示了僅僅由于感興趣序列的過量表達或者不足表達而致的表達變化。這種“協(xié)同反應(yīng)”細胞因子可容易地分類為不同的組用于分別的研究、考慮和/或分析。本發(fā)明改進了快速和有效鑒定感興趣基因序列的功能的能力，因為本發(fā)明降低了時間的耗費以及花費在與干擾感興趣序列的表達同時相關(guān)的所有影響上的經(jīng)費。本發(fā)明提供的方法僅集中在與感興趣基因序列的過量和不足表達相關(guān)的那些影響。
本發(fā)明可通過檢測在已發(fā)現(xiàn)感興趣基因序列被表達的細胞或細胞型中的一個或多個細胞因子的變化來進行。這種感興趣基因序列的非限制性例子，是在某些細胞類型中或在某些疾病條件下發(fā)現(xiàn)被表達的一種開放閱讀框。另外，本發(fā)明可通過檢測細胞或細胞類型的變化進行，在該細胞或細胞類型中沒有檢測到感興趣的基因序列表達。較佳地，該細胞或細胞類型是人的細胞，盡管也可使用任何動物、植物或微生物的細胞。下面討論將感興趣基因序列導(dǎo)入細胞的方法。
這樣，本發(fā)明提供含有用于鑒定感興趣基因序列的一種或多種功能的兩個或更多載體的分析方法、組合物和系統(tǒng)。任選地，至少可使用經(jīng)三個載體來過量或不足表達另一種基因序列，以提供關(guān)于感興趣基因序列的一種或多種功能的進一步信息。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種高產(chǎn)量、和任選地計算機化的或機器人操縱的鑒定基因功能的系統(tǒng)。在這樣的實施例中，本發(fā)明提供了載體文庫和排列多重區(qū)室中的轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。對于載體，該文庫包含具有用于感興趣基因過量表達的載體或用于感興趣的基因不足表達的載體的區(qū)室。這種載體文庫可非常有效地用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞以在多重區(qū)室中產(chǎn)生細胞文庫，每個區(qū)室含有用一個載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。在它們用于細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)前此載體文庫可任選地在包裝細胞中增殖。
通過使用本領(lǐng)域已知的機械操縱的顯微陣列和宏觀陣列技術(shù)，可分析轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的文庫中過量或不足表達感興趣基因序列的影響。其一個例子是“基因芯片”技術(shù)，借此技術(shù)大量序列的基因表達可通過用于自細胞分離的mRNA或相應(yīng)的cDNA的雜交的一張“芯片”來測定。本發(fā)明包括一種組合物，該組合物是用于實施所公開方法的一種陣列，任選地與來自過量和/或不足表達一個或多個感興趣基因序列的細胞的物質(zhì)接觸(例如，與RNA、蛋白質(zhì)、其它細胞物質(zhì)、或這種細胞的細胞外物質(zhì)接觸)。
在分析對細胞因子的影響前，可將轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞文庫作進一步處理或改變條件。因此，也可即時地分析細胞對細胞因子的影響。也可將該細胞移植到體內(nèi)以進一步測定基因功能。
可使用各種方法檢測細胞因子的變化。這些方法包括測定信使RNA水平、蛋白質(zhì)表達水平、蛋白質(zhì)活性水平、對蛋白質(zhì)磷酸化的影響、對蛋白質(zhì)或核酸加工的影響、對RNA穩(wěn)定性的影響、對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或第二信使的影響等等。
本發(fā)明還提供通過過量表達、或抑制表達經(jīng)上述方法其功能已被鑒定的基因序列，改變細胞中的一個或多個細胞因子的表達、組成、或形式的方法。這些方法還可用于改變所述細胞的表型。
本發(fā)明提供了超過鑒定尚不知其活性的編碼的基因產(chǎn)物的一種或多種功能的能力的許多優(yōu)越性。這些優(yōu)越性包括對有些活性信息已知的基因產(chǎn)物的功能提供其他的信息的能力；一種無功能基因產(chǎn)物的過量或不足表達對另一種無功能的基因產(chǎn)物表達的影響提供信息的能力；在表達不同內(nèi)源性序列的不同細胞類型上進行相同的分析的能力。
本發(fā)明還提供了提高已知基因產(chǎn)物的表達的方法。一旦發(fā)現(xiàn)感興趣基因序列所提高所需和已知的細胞基因產(chǎn)物的表達，則至少可使用該感興趣基因序列來提高此產(chǎn)物的表達用于隨后的分離或純化。
本發(fā)明的另一個優(yōu)越性是不需要知道或推測感興趣基因的功能。在了解關(guān)于感興趣基因的功能的本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明有利地提供了鑒定可能以前未知的一種或多種其它功能性的方法，和/或證實可能以前已知的或懷疑有的一種或多種其它功能性的方法。后者對于與疾病相關(guān)的感興趣基因序列有特殊關(guān)聯(lián)，它可與本發(fā)明聯(lián)合使用以鑒定或證實此序列的一種或多種其它功能性。例如，不限制本發(fā)明，可鑒定到某疾病相關(guān)基因序列編碼產(chǎn)物的水平下降視作對此疾病的有效藥理學(xué)治療。但該序列表達水平的下降可懷疑引起另一種細胞因子的補償性增加，這將降低此治療的效果。在本發(fā)明中使用的疾病相關(guān)基因序列提供了一種測定這種補償性增加發(fā)生以及鑒定補償性細胞因子的有利手段。該因子是可以被同時減少以改進此病治療的第二個靶標。
本發(fā)明另一個優(yōu)越性是可確定基于基因功能的關(guān)系并用此關(guān)系產(chǎn)生功能關(guān)系圖譜。
附圖的簡要說明

圖1顯示了當感興趣的各個序列，“Seq”1-4，過量或不足表達時樣品的結(jié)果。與以任意相對單位表示為“100”的對照細胞中的表達水平一起，說明了對各個細胞基因序列表達的影響。在該圖中，“Seq”1-4可代表未鑒定的、推測已鑒定的和/或已知的序列。根據(jù)包含的更多的用于評估的細胞基因序列(增加更多的行)或更多的感興趣的序列過量或不足表達(增加更多的列)，該結(jié)果可隨意地增加。
進行本發(fā)明的方式本發(fā)明提供了鑒定某給定序列基因產(chǎn)物的一種或多種功能的方法和組合物。較佳地，該序列是人的序列，但一個或多個非人序列也可與本發(fā)明聯(lián)合使用以鑒定它們對人細胞中細胞因子的影響。優(yōu)選地，不需要事先知道編碼的功能。然而，如果該功能是已知的，本發(fā)明則允許證實所述功能以及可能鑒定事先未知的或未認可的功能。
在一個較佳的實施例中，本發(fā)明提供了一個過量表達細胞中某給定的未鑒定的或已知的基因序列的載體。這種表達較佳地在嚴格的和/或可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)控制下。認為“未鑒定的”序列還沒有證實具有細胞或生化功能。認為“已知”序列已被證實具有一種或多種細胞或生化功能。較佳地，發(fā)生了而不同時表達其它載體負載的序列過量表達，例如，但不限于，選擇性標記。因此，細胞內(nèi)環(huán)境僅受到感興趣序列的過量表達的影響，并且所述過量表達的影響更確切地反映了所述序列的一種或多種功能。
分析本發(fā)明這一實施例轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的細胞因子，本文定義為細胞基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)或RNA)或其代謝產(chǎn)物(例如糖和脂類分子)，它們受到所述基因序列過量表達的影響。過量表達的影響與沒有過量表達所述序列的正常細胞進行比較。較佳地，正常細胞用此載體模擬轉(zhuǎn)染但并不表達所述基因序列。通過實施例，并不限制本發(fā)明，某給定基因序列(例如編碼細胞分化的誘導(dǎo)劑)的過量表達與正常細胞相比將提高編碼一種或多種細胞因子(例如參與分化或分化狀態(tài)的基因編碼的那些細胞因子)的RNA的表達。另外，一些基因序列(例如轉(zhuǎn)錄阻遏物)的過量表達將導(dǎo)致一種或多種細胞因子表達的下降。最后，一些細胞因子不受一些基因序列過量表達的影響。本發(fā)明包括鑒定感興趣基因序列的一種或多種功能的能力，該基因序列通過與編碼或調(diào)節(jié)所述細胞因子表達的核酸相結(jié)合而編碼一種或多種細胞因子的調(diào)節(jié)劑。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供了用于抑制或換句話說降低細胞中未鑒定的或已知的基因序列的表達的載體。這又是優(yōu)選發(fā)生在缺乏其它載體負載序列，但不限于選擇性標記的表達時。因此，細胞內(nèi)環(huán)境又是僅緩到所述序列的完全或部分不足表達的影響，這種影響更精確地反映了所述序列的一種或多種功能。雖然基因序列的此種不足表達似乎需要細胞正常表達內(nèi)源性序列，本發(fā)明仍可用不表達該序列的細胞來進行，因為在用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)來影響不足表達的細胞和模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞之間簡直沒有明顯的差異。另外，正常表達內(nèi)源性序列并因此能夠不足地表達該序列的細胞，可先用本領(lǐng)域熟知的標準方法鑒定，例如使用該序列的全部或部分作為探針的Northern印跡法。為了快速地鑒定這種細胞，可使用“組織印染法”，其中制備各種細胞類型的RNA并同時進行Northern印跡法。
為了不足表達未鑒定或已知的基因序列，但不限制本發(fā)明，可將該序列以反義方向插入一載體以在細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達。這種表達優(yōu)選在嚴密的和/或可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)控制下。當然不需要將整個序列以反義方向插入，可使用未鑒定的或已知序列的一個或多個部分。較佳地，將反義序列操作性連接于協(xié)同定位序列，其與反義序列一起表達，將待追蹤的反義序列協(xié)同定位到與互補的內(nèi)源性細胞或“有義”序列相同的細胞位置。雖然可直接使用反義序列以導(dǎo)致內(nèi)源性mRNA不表達，但反義序列還可以是靶向序列的一部分以指導(dǎo)核酶切割該內(nèi)源RNA。在這樣的實施例中，當然要設(shè)計能夠表達反義序列作為編碼的核酶的有效部分以靶向此內(nèi)源序列的載體。然后將該載體導(dǎo)進入細胞來表達反義序列，反義序列結(jié)合該互補內(nèi)源性細胞序列并導(dǎo)致其表達的抑制。
可先用衍生自待抑制基因序列的各個部分的多種反義序列來測定哪一種最適合于降低細胞序列的表達。在本發(fā)明的一個實施例中，為了最完全抑制內(nèi)源性細胞表達，如果細胞是待抑制基因序列的雜合性細胞，反義序列應(yīng)針對內(nèi)源表達序列的保守部分。另外，可用感興趣基因序列來制備載體，該載體將與感興趣基因序列的內(nèi)源性拷貝重組以抑制它們的表達。
雖然各種協(xié)同定位序列可用于將反義分子協(xié)同定位到內(nèi)源性RNA上，但優(yōu)選的序列是U1、U2、U3、U4、U5或U6 snRNA，所有這些序列可操作性連接于述反義或核酶序列。更優(yōu)選，所用的協(xié)同定位序列是U1 snRNA/啟動子盒，如Dirtz(USP58,814,500中所述)，該文獻全文引入作為參考。
雖然對于許多基因序列而言，完全抑制其表達的能力提供了對于其不足表達的結(jié)果的最清楚的信息，應(yīng)注意部分或完全抑制序列表達的能力只是本發(fā)明的一個方面。當某基因序列編碼對細胞活力具有關(guān)鍵性作用的產(chǎn)物時，部分抑制該基因表達具有特別的優(yōu)越性?？赡芡ㄟ^對細胞表達的完全或幾乎完全抑制的致死作用，不難鑒定出這種基因序列。怎樣獲得部分抑制的非限制性的例子是在對所述序列為雜合性的細胞中靶向唯一的內(nèi)源性性表達的序列。
分析本發(fā)明這一實施例的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞受所述基因序列的不足表達所影響的細胞因子，與表達所述序列的正常細胞相比較。較佳地，正常細胞還是用該載體模擬轉(zhuǎn)染，但不引起所述基因序列的不足表達。通過實施例，并不限制本發(fā)明，與正常細胞相比，某給定基因序列(例如編碼轉(zhuǎn)錄阻遏物)的不足表達將提高編碼一種或多種細胞因子(例如由所述阻遏物抑制的基因編碼的那些細胞因子)的RNA的表達。另外，一些基因序列(例如轉(zhuǎn)錄活化劑)的不足表達將導(dǎo)致一種或多種細胞因子表達的下降。最后，一些細胞因子不受某些基因序列不足表達的影響。
雖然對于實施本發(fā)明不是絕對必需的，但是本發(fā)明用于過量或不足表達序列的載體，優(yōu)選能夠高效和穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞高達100％的效率。另外，盡管用低拷貝數(shù)的游離構(gòu)建物也可實施本發(fā)明，但優(yōu)選它們保持游離形式、高拷貝數(shù)。可通過用適當?shù)呐潴w激活待轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，隨后在標準條件下培養(yǎng)這些細胞來提高穩(wěn)定的整合(見于2000年8月31日提交的待批美國申請序列號09/653,088，題為“用病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的方法”(METHODS FOR STABLE TRANSDUCTION OF CELLS WITHVIRAL VECTORS)，該文獻全文引入作為參考。較佳地，還設(shè)計了種載體不論以有義或反義方向，除感興趣的基因外，只少量表達或不表達載體負載的序列。在本發(fā)明的一些實施例中，此載體進一步含有足以允許此載體整合進入細胞基因組的序列。這種重組可基于同源重組或基于整合酶介導(dǎo)能使存在于載體上的序列整合的重組。作為一個非限制性例子，當使用慢病毒衍生載體時，正常的慢病毒整合序列可促進穩(wěn)定整合進入宿主細胞基因組中。
待過量或不足表達的給定的未鑒定或已知的基因序列可取自任何來源甚至可被部分鑒定。未鑒定的或部分鑒定的序列的非限制性例子包括從EST(表達的序列標記物)序列的分離和特征鑒定得到的那些序列，以及認為可能編碼基因產(chǎn)物的任何核酸序列，或是RNA或蛋白質(zhì)形式。這種序列包括通過EST序列的裝配而鑒定的那些序列或其它測定編碼基因產(chǎn)物的序列。這些序列包括那些進行生物信息學(xué)分析并因此與其它已知或未特征鑒定的序列具有同源性的序列。通過實施例，并不限制本發(fā)明，可將可排布的沒有功能的編碼開放閱讀框的序列，用于本發(fā)明以鑒定其在細胞中的一種或多種功能。相似地，編碼與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)具有同源性的開放閱讀框的序列(例如基于生物信息學(xué)分析)可用于本發(fā)明以證實其作為轉(zhuǎn)錄因子的推定的功能。
已知序列的非限制性例子可取自任何來源并包括已指定了一種或多種功能性的那些序列。這種序列包括在公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫中的序列以及編碼已特征鑒定的基因產(chǎn)物的任何序列。這種序列可用于本發(fā)明來證實已知的功能和/或鑒定其他的功能。通過實施例，并不限制本發(fā)明，可發(fā)現(xiàn)編碼僅鑒定為使胞漿蛋白磷酸化的激酶的序列，引起由于該激酶的過量表達而提高了核轉(zhuǎn)錄因子的表達。不受理論的束縛，該激酶可通過其激酶活性直接或間接地導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子增加表達。一種可能性是該激酶磷酸化轉(zhuǎn)錄因子而使之失活，借此通過反饋環(huán)提高了其表達。如本文所述對細胞因子的其它影響也可通過一個或多個反饋環(huán)產(chǎn)生。
另外，人工序列，例如重組性融合或其它嵌合性構(gòu)建物以及上述序列的突變型也可用于本發(fā)明以鑒定它們的功能。本發(fā)明的這一方面在證實作為能夠替代野生型蛋白質(zhì)功能的具體的人工蛋白或誘變蛋白中可能具有特別的優(yōu)越性。例如，并不限制本發(fā)明，能夠自身形成多聚體，但不具有p53的顯性失活突變體形式的p53蛋白質(zhì)的合成性突變體，可用于本發(fā)明以證實其替代野生型功能p53的能力。通過這種證實，該合成性突變體可用于治療含有顯性失活p53突變的細胞的療法中。
對于實施本發(fā)明可通過任何手段將未鑒定的或已知序列導(dǎo)入載體。較佳地，通過高效的方法進行，該方法以平行方式進行并可將對于多重克隆步驟的需要和證實克隆步驟的需要減到最小。更佳地，序列插入載體通過自動化技術(shù)進行。作為一個非限制性例子，可將感興趣基因序列先克隆入最初的載體，該載體能夠使的序列隨后導(dǎo)入本發(fā)明過量或不足表達的載體中。這可通過使用重組介導(dǎo)的插入系統(tǒng)，例如Life Technologies的GatewayTM克隆系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用質(zhì)粒中的att位點使得序列可在載體之間高效轉(zhuǎn)移。這樣，在本發(fā)明的一個實施例中，用于過量或不足表達某基因序列的載體可包含適當?shù)腶tt位點以允許基因序列的有效插入。
在一個自動化的實施例中，基因序列的插入可基于含有基因序列文庫的陣列的使用。這種含有序列的陣列可用于產(chǎn)生多個另外的陣列，這些陣列基于含有該基因序列的經(jīng)一個文庫而組成。這種多個陣列可依次包括一個或多個如下陣列含有用適當?shù)慕宇^修飾的該基因序列的陣列；含有用于擴增的修飾的基因序列的陣列含有導(dǎo)入用于增殖或進一步克隆的最初載體的修飾的序列的陣列；從最初的載體轉(zhuǎn)移入本發(fā)明的一個或多個載體的序列的陣列；以及在用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞前適當?shù)匕b的這種載體的陣列。
使用這種陣列所提供的一個優(yōu)越性，是當本發(fā)明基因序列文庫過量和不足表達時能夠繼續(xù)使用存在于這種陣列中的組織結(jié)構(gòu)。例如，含有包裝載體文庫的陣列排布可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)一細胞陣列，然后可部分或全部收獲該細胞陣列，以分析該陣列的基因序列過量和不足表達對細胞因子的影響。
用于本發(fā)明的細胞可以是任何種類的細胞。但對于功能的最佳測定，當該基因序列被過量或不足表達時細胞應(yīng)來自相同的生物。不過序列可與細胞異源，在該細胞中序列被表達以確定它們在細胞中的功能。較佳地，該細胞是人的細胞，研究感興趣基因序列至少最初是在發(fā)現(xiàn)該序列被表達的細胞中。通過非限制性例子，可在哺乳動物細胞中表達真菌序列以測定它在那里的功能。如果已知與真菌序列相對應(yīng)的哺乳動物序列，本發(fā)明的這一方面具有特殊的優(yōu)越性。這得以比較不足表達哺乳動物序列的影響以證實真菌序列能夠作為哺乳動物序列的替代物而行使功能。如果這樣，該真菌序列可編碼一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以是哺乳動物序列編碼的產(chǎn)物的治療性替代物。
用于實施本發(fā)明的較佳的細胞類型是真核細胞，更佳的是原代真核細胞，最佳的是原代哺乳動物細胞和人類細胞。較佳的細胞是人組織細胞，包括但不限于，神經(jīng)元細胞、腦細胞、上皮細胞、結(jié)締組織細胞(例如成纖維細胞、成骨細胞和脂肪細胞)、血細胞(例如白細胞、淋巴細胞、單核細胞和嗜中性白細胞)、感覺細胞、肌肉細胞、感覺細胞(例如視覺細胞和毛發(fā)細胞)、肺細胞、心臟細胞、肝細胞、皮膚細胞、胰細胞、乳房細胞、腎細胞、小腸細胞、胃細胞、結(jié)腸細胞、前列腺細胞、卵巢細胞、和精細胞。還可使用包括衍生自上述任何一種細胞的培養(yǎng)的細胞系。然而，在本發(fā)明的另一個方面，如果需要還可采用部分或完全分化的細胞。通過非限制性的例子，如果待不足表達的基因序列僅在所述分化的細胞中正常地表達，那么采用分化細胞是優(yōu)選的。對于不同細胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)，載體可通過采用本領(lǐng)域已知的假型和兩性包裝系統(tǒng)適當?shù)匕b。
轉(zhuǎn)導(dǎo)各種細胞類型的能力提供了本發(fā)明的另一個優(yōu)越性，其中在各種(異源的)細胞類型中某基因序列的過量和不足表達可用于提供更多的信息并因此提高了基因功能的排布。這種提高部分是由于內(nèi)源性基因在不同的細胞類型中表達的差異。因此，一個基因序列的整個功能范圍可通過評估其在各種細胞類型中過量和不足表達要更好地闡明。
根據(jù)如本發(fā)明所鑒定的一種或多種功能，感興趣基因序列在異源細胞中的表達還提供了一種改變所述細胞表型的方法。作為一個非限制性例子，某基因序列的過度表達可導(dǎo)致在正常表達該序列的細胞中細胞表面標記表達的提高。在正常情況下不表達該序列的異源細胞中，該序列的表達可導(dǎo)致異源細胞表面上的細胞標記的表達，因此提供了一種鑒定和/或靶向那些異源細胞的新方法。
在本發(fā)明一個較佳的實施例中，將上述用于過量和不足表達某基因序列的載體整合入細胞的基因組國作為轉(zhuǎn)導(dǎo)加工的一部分。
本發(fā)明的另一個方面，可比較由于其序列的過量和不足表達而檢測到的細胞因子的表達變化，以提供對所研究的基因序列的功能的另外信息。在圖1中，例如，未鑒定的序列2(“Seq 2”)的過量表達(O)顯示為提高了“結(jié)構(gòu)蛋白1”的表達。但與對照細胞(Con)比較，Seq 2的不足表達(U)顯示為對“結(jié)構(gòu)蛋白1”的表達具有非常小的影響。象這樣，Seq 2和結(jié)構(gòu)蛋白1之間的關(guān)系可能是其中Seq 2行施功能活化或誘導(dǎo)了結(jié)構(gòu)蛋白1的表達，而Seq 2的不足表達對結(jié)構(gòu)蛋白1的背景表達具有極小的影響。
相似地，可通過觀察哪些細胞因子受到類似地影響來分析某序列編碼產(chǎn)物的功能作用。例如，在圖1中，序列1(“Seq 1”)的過量和不足表達同樣地影響了“轉(zhuǎn)錄阻遏物1”和“轉(zhuǎn)錄阻遏物2”的表達。因此，Seq 1的表達產(chǎn)物以同樣的方式行使調(diào)節(jié)這兩種阻遏物的功能。另一方面，Seq 1的過量和不足表達對“轉(zhuǎn)錄因子2”的表達具有相反的影響。這表明Seq 1的功能是同時調(diào)節(jié)這兩種阻遏物和“轉(zhuǎn)錄因子2”的細胞表達。
而且，本發(fā)明提供了鑒定未鑒定的序列之間的功能關(guān)系的方法。例如，在圖1中，“Seq 3”和“Seq 4”對“氧化還原酶1”的表達具有相同的影響。這將表明Seq 3和Seq 4的表達產(chǎn)物至少在二者調(diào)節(jié)“氧化還原酶1”表達的程度上彼此功能相關(guān)。此外，圖1中“Seq 2”的過量表達顯示為增加了“Seq 3”的表達(見對于Seq 3行的Seq 2的O、U和C列)。
圖1中的結(jié)果還顯示了某基因序列的其它功能性。例如，當分析“Seq 4”自身的表達水平時，顯示“Seq 4”自動調(diào)節(jié)其自身的表達。當Seq 1、2或3過量表達時，相比之下(對于相同的Seq列比較Seq 1、2、3和4四行)Seq 4的過量表達沒有導(dǎo)致同樣多的Seq 4 RNA表達)。這將例證Seq 4的過量表達導(dǎo)致內(nèi)源性Seq4表達的反饋抑制的情況。相似地，由于內(nèi)源性Seq 4表達的反饋性激活。Seq 4的不足表達沒有消除Seq 4的表達。
還可將細胞因子表達中檢測到的變化聯(lián)合起來以提供關(guān)于功能關(guān)系的其他信息。作為非限制性的例子，可采用減數(shù)雜交定量地測定過量表達和不足表達某基因序列的細胞之間表達RNA的差異。例如，可采用過量表達某基因序列的第一組細胞表達的總RNA來產(chǎn)生cDNA，用于進行針對從不足表達該基因序列的第二組細胞表達的總RNA的減數(shù)雜交。如果第一組細胞中特異性RNA的量比第二組細胞中的高，雜交后將會有作為單鏈分子的對應(yīng)于剩余的特異性RNA的過量的cDNA。然后可分離和檢測該cDNA。較佳地，減數(shù)雜交還使用不足表達某基因序列的細胞作為第一組和過量表達該序列的細胞作為第二組來進行。這樣減數(shù)雜交的結(jié)果顯示于圖1中，其中(如果可應(yīng)用)在“C”列下對于每個未鑒定的序列“Seq”有兩個數(shù)字。第一個數(shù)字是指用過量表達組(O)的cDNA進行的減數(shù)雜交，而第二個數(shù)字是指用不足表達組的cDNA進行的減數(shù)雜交。
另外，減數(shù)雜交還可用于比較對照細胞和過量或不足表達某具體基因序列的細胞之間表達的RNA。這樣可從過量或不足表達某基因序列的細胞所表達的RNA中“減去”，對照細胞中表達的RNA以提供關(guān)于所述基因序列功能的其他信息。該方法對于克隆在正常細胞和過量或不足表達某具體基因序列的細胞之間差別性表達的RNA也是優(yōu)選的。
圖1中的結(jié)果還可通過將細胞放置在不同的培養(yǎng)條件下進行修飾。通過非限制性的例子，在RNA制備前，可將細胞放置在活躍生長和/或增殖的條件下、靜止條件下、溫度改變的條件下、和配體存在的條件下。這些條件的使用提供了測定感興趣基因序列的一種或多種功能性的更多信息。
在本發(fā)明的另一個方面，一個或多個添加的基因序列的過量或不足表達與第一個感興趣基因的過量或不足表達聯(lián)合同時進行。作為非限制性的例子，并基于圖1，用過量表達Seq 1的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞可分別代替用同時過量或不足表達另一個序列(例如“Seq 5”)的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。相似地，用不足表達Seq 1的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞可分別代替用同時過量或不足表達Seq 5的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。這種同時過量或不足表達技術(shù)提供了鑒定或證實任何基因序列的功能及功能關(guān)系的更多信息。
在這種同時方法的另一個實施例中，至少可采用第三個載體來同時過量或不足表達一個或多個添加的基因序列。當然該載體應(yīng)是一種與用于過量或不足表達第一個基因序列的載體相容的載體。在這種同時方法的另一個實施例中，第一個基因序列可能與同時過量或不足表達的一個或多個添加的基因序列密切相關(guān)。作為一個非限制性的例子，第一個基因序列可以是野生型序列，所用的細胞對于該序列的錯誤機能突變體可以是純合性細胞，并且待表達的添加基因序列是編碼該錯誤機能突變體內(nèi)源序列的反義型。通過使用添加的基因序列同時表達野生型序列和不足表達錯誤機能突變體序列，可將第一基因序列的野生型活性保存在細胞中。
在這種同時方法的另一個實施例中，該添加基因序列可編碼致癌基因或腫瘤抑制基因。
本發(fā)明的另一個方面是實施本發(fā)明高產(chǎn)量的系統(tǒng)的應(yīng)用。在這一方面的一個實施例中，該系統(tǒng)可任選地計算機化或用機器人操縱，并還可包括上述陣列的應(yīng)用。在本方法的一個實施例中，本發(fā)明提供基因序列文庫，含有它們的過量和不足表達的載體，用所述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，以及通過分析所述細胞明確對細胞因子的影響。較佳地，該基因序列文庫存在于多個區(qū)室中，各個區(qū)室含有一個基因序列。在一個特別優(yōu)選地的形式中，這些區(qū)室存在于一個多孔的容器中，例如但不限制本發(fā)明，一個多孔平板中。這樣一種多孔容器可被認為是含有全部或部分基因序列文庫的陣列，并且存在于這種陣列中的序列的組織結(jié)構(gòu)可在實施本發(fā)明的整個過程中被保持，直到和包括分析對細胞因子的影響。實施本發(fā)明的具體的優(yōu)越性是使用僅含有一種基因序列的載體來中轉(zhuǎn)導(dǎo)各個區(qū)室的細胞。
在本發(fā)明的另一個方面，分離的陣列可用于過量和不足表達感興趣的基因序列。但較佳的是將對于包含在這種分離陣列中的細胞因子的影響聯(lián)合起來以提供更容易的分析。作為一個非限制性的例子，一旦確定了某基因序列的過量和不足表達對文庫的每個序列的影響，可聯(lián)合該信息然后進一步分析結(jié)果。例如，圖1顯示文庫序列1-4(見頂端行)的過量(見列“O”)和不足(見列“U”)表達對許多細胞因子(見左邊的列)的聯(lián)合影響。也可通過例如上文討論的“減數(shù)雜交“方法聯(lián)合，對細胞功能的實際影響然后用過量和不足表達數(shù)據(jù)同時分析(例如見圖1中的列“C”)。
在實施本發(fā)明的另一個方法中，過量和不足表達對細胞因子的作用在能夠機械操縱的是微或宏觀陣列上進行。這種機械優(yōu)選能夠部分或完全自動化收集過量或不足表達某基因序列的細胞以測定對細胞因子的影響。在一個用于分析對基因表達的影響的非限制性例子中，含有編碼細胞因子的序列的“基因芯片”用于測定這些因子中哪一種受到過量或不足表達某具體基因序列的影響。這樣，RNA或與之相對應(yīng)的cDNA可從細胞分離、標記和與所述芯碎片上的序列雜交。可將這樣雜交的結(jié)果可與用對照細胞雜交見到的結(jié)果相比較，以測定對存在于芯片上的各種細胞因子編碼序列的影響。當然，可采用多樣性芯片以得以分析已知的許多細胞因子，以及得以針對其它未鑒定的序列分析每個未鑒定的序列。另外，相同芯片的復(fù)制品用于分析過量或不足表達某具體基因序列的細胞。
分析前，可對過量和不足表達各種序列的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞文庫作進一步處理或改變條件。除本文描述的添加的序列同時過量或不足表達外，可將該細胞置于各種因子存在的條件下或在各種生長條件下培養(yǎng)。作為一個非限制性的例子，可使該細胞接觸一個或多個配體以誘導(dǎo)各種效應(yīng)。另外，可隨時間分析該細胞或?qū)⑺浦踩塍w內(nèi)以使得能夠鑒定對細胞因子的其它影響。
在本發(fā)明的另一個實施例中，對細胞因子影響的分析可通過采用任何試驗進行。如下是提供作為實施本發(fā)明的附加的非限制性的例子。當然這些例子可通過部分或完全自動化手段進行。
在第一個非限制性的例子中，可分析細胞過量或不足表達某基因序列對細胞因子的蛋白質(zhì)水平的影響。如此，一個細胞的樣品可用于采用對各種細胞因子具有特異性的抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。另外，該分析可通過其它手段，例如定量免疫試驗進行。這種分析可與本文描述的基因表達分析結(jié)合進行以提供對細胞因子影響的更完全描繪，因為RNA表達水平的變化可能不總是與所述RNA編碼的蛋白質(zhì)水平的變化密切相關(guān)。而且，該方法可通過采用唯一針對已觀察到表達變化的RNA編碼的蛋白質(zhì)的抗體，繼續(xù)基因表達的分析。
在第二個非限制性的例子中，可分析細胞過量或不足表達某基因序列對蛋白質(zhì)活性的影響。這對于編碼另一個蛋白質(zhì)或酶的激活劑或抑制劑的基因序列可能是特別感興趣的。一個細胞的例子可用于酶或其它蛋白質(zhì)試驗以檢測活性的變化。例如，某特異性激酶的激活劑的過量表達，將提高適當試驗中所述激酶的可檢測活性。這種作用可能或不可能獨立于該激酶的基因表達或蛋白質(zhì)水平的任何變化。
在第三個非限制性的例子中，可分析細胞中過量或不足表達某基因序列對蛋白質(zhì)磷酸化的影響?？膳嘤^量或不足表達某基因序列的細胞以便于通過磷基團放射性標記該磷酸化蛋白質(zhì)。然后可采用雙向凝膠或適當?shù)拿庖咴囼?例如采用對已知的磷蛋白具有特異性的抗體)分析從這種細胞的樣品以檢測蛋白質(zhì)磷酸化的變化。
在第四個非限制性的例子中，可分析細胞過量或不足表達某基因序列對不是基因產(chǎn)物的細胞因子的影響。例如，可分析對各種小分子(例如鈣、鈉和氯離子；各種酶促循環(huán)中的中間體；脂類；等等)的細胞內(nèi)濃度的影響。在另一個例子中，檢測細胞表面上各種細胞因子的產(chǎn)生和表達，例如脂類或糖。
本發(fā)明還提供了分離某基因序列編碼產(chǎn)物的有利方法，這可通過收集過量表達所述序列的細胞和純化所述產(chǎn)物而簡單地完成。
本發(fā)明進一步提供了不需要知道待過量或不足表達的序列的功能的優(yōu)點件。這樣，可任選地去掉生物信息學(xué)所需的時間和花費，雖然在實施本發(fā)明中包含生物信息學(xué)的信息將增加精確賦予某基因序列功能的可能性。
而且，本發(fā)明提供了使一種未鑒定的基因序列的功能與另一種基因序列的功能性相關(guān)聯(lián)的能力。本發(fā)明還允許將這種能力與鑒定未鑒定的和已知的序列之間的功能關(guān)系的有利能力相聯(lián)合，以提供功能上相關(guān)的基因序列家族的測定。各個家族成員之間的關(guān)系可表達為基于功能關(guān)系的圖譜，如果沒有進行廣泛的研究將不會認識該圖譜。
本文所引用的全部參考文獻以全文引入作為參考，不論是否事先已特別引入。如本文所使用，所有以單數(shù)形式表達的術(shù)語是指包括單數(shù)和復(fù)數(shù)形式。
現(xiàn)在已全面描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在具有等效參數(shù)、濃度和不背離本發(fā)明思路或范圍的條件下以及無須過度實驗可進行與本發(fā)明相同的實驗。
雖然已結(jié)合具體的實施例描述了本發(fā)明，應(yīng)理解它能夠作進一步的修飾。本申請意圖包括，概括地說遵循本發(fā)明的原理對本發(fā)明所作的任何變化應(yīng)用或改進，以及包括本公開的這種背離來自本發(fā)明從屬領(lǐng)域中的已知或常規(guī)實踐中，并在陳述前可應(yīng)用于本文的本質(zhì)特征。
權(quán)利要求
1.一種鑒定細胞類型中感興趣基因序列功能的方法，其特征在于，所述方法包括a)在所述類型的第一細胞群中過量表達所有或部分所述序列；b)在所述類型的第二細胞群中抑制所述序列的表達；c)檢測所述第一和第二細胞群中一種或多種細胞因子的變化；d)根據(jù)對所述一種或多種細胞因子的鑒定或影響，鑒定所述感興趣基因序列的功能。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述變化是所述細胞因子表達的增加和/或減少。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述變化是所述細胞因子的翻譯后修飾。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述變化是所述細胞因子的磷酸化或糖基化。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述變化是所述細胞因子的活性變化。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一細胞群中的過量表達是通過使用假型慢病毒載體進行的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二細胞群中抑制表達是通過使用能夠以反義方向表達所有或部分所述基因序列的假型慢病毒載體進行的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞類型是原代細胞。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞類型是培養(yǎng)的細胞系。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述感興趣基因序列是當在所述細胞類型的細胞中表達時先鑒定的。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述感興趣基因序列是當在所述細胞類型的細胞中表達時沒有事先鑒定的。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述感興趣基因序列編碼一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物通過與編碼或調(diào)節(jié)所述一種或多種細胞因子表達的核酸結(jié)合，調(diào)節(jié)所述一種或多種細胞因子的表達。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述感興趣基因序列編碼一轉(zhuǎn)錄激活劑。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述感興趣基因序列編碼一轉(zhuǎn)錄阻遏物。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述感興趣基因序列是人的序列。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞類型是人的細胞類型。
17.一種改變在含有過量表達或抑制某基因序列表達的細胞中的一種或多種細胞因子表達的方法，其特征在于，該方法采用如權(quán)利要求1所述的方法鑒定該基因序列的功能。
18.一種改變含有過量表達或抑制某基因序列表達細胞的表型的方法，其特征在于，該方法采用如權(quán)利要求1所述的的方法鑒定該基因序列的功能。
19.一種鑒定某感興趣基因序列在與所述序列的細胞來源異源的細胞中的功能的方法，其特征在于，所述方法包括a)在所述類型的第一細胞群中過量表達所有或部分所述序列；b)在所述類型的第二細胞群中抑制所述序列的表達；c)檢測所述第一和第二細胞群中一種或多種細胞因子的變化；d)根據(jù)對所述一種或多種細胞因子的鑒定或影響，鑒定所述感興趣基因序列的所述功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于有效鑒定感興趣核酸序列編碼產(chǎn)物的一種或多種功能的方法和組合物。所述方法利用在細胞中過量和/或不足表達該產(chǎn)物的能力，以及這些結(jié)果的聯(lián)合使得能夠鑒定該產(chǎn)物的至少一種細胞或體內(nèi)功能。
文檔編號C12Q1/02GK1524126SQ02806861
公開日2004年8月25日 申請日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月25日
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