專利名稱：離子束介導(dǎo)麻黃總dna在酵母菌中的轉(zhuǎn)化及獲得轉(zhuǎn)基因酵母工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及借助離子束介導(dǎo)活性裸露DNA大分子的遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及離子注入介導(dǎo)麻黃總DNA在酵母菌中的遺傳轉(zhuǎn)化方法，及通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的轉(zhuǎn)基因酵母工程菌株。
背景技術(shù)：
藥用植物含有的有效成分大多為其次生代謝產(chǎn)物，一般由多基因控制，在目前還不完全了解其遺傳背景的情況下，尚無法構(gòu)建目的基因的質(zhì)粒載體。因此進(jìn)行藥用植物總DNA的遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要的理論和實踐意義。近年來，植物總DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)有了很大進(jìn)展，特別是借助離子束介導(dǎo)活性裸露DNA大分子的遺傳轉(zhuǎn)化已成為引人注目的一個新的研究方向。
中國科學(xué)院離子束生物技術(shù)重點實驗室用離子束介導(dǎo)法將碳4循環(huán)紫玉米的總DNA導(dǎo)入水稻品種早秈213，獲得了一批穩(wěn)定遺傳的變異株系，不僅根系發(fā)達(dá)，而且在莖干等部位表現(xiàn)出供體玉米的紫色性狀[見參考文獻(xiàn)1]。
河南省離子束生物技術(shù)重點實驗室用離子束介導(dǎo)法將兩個大豆品種的總DNA分別導(dǎo)入兩個小麥栽培品種皖9210和揚麥5號，獲得了兩個高蛋白小麥株系[見參考文獻(xiàn)2]。
安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院用離子束介導(dǎo)法將抗枯萎病的比克氏棉D(zhuǎn)NA導(dǎo)入泗棉2號，獲得了抗病棉花新品系[見參考文獻(xiàn)3]；離子束介導(dǎo)紅麻總DNA轉(zhuǎn)入棉花獲得11個優(yōu)良株系，具有高抗枯萎病性能[見參考文獻(xiàn)3]。
在天然藥物研究方面，中國科學(xué)院離子束生物技術(shù)重點實驗室用離子束介導(dǎo)法將銀杏總DNA導(dǎo)入西瓜品種3-16和SR2-14-2中，銀杏內(nèi)酯在西瓜品種3-16和SR2-14-2的轉(zhuǎn)化當(dāng)代葉片中的表達(dá)量分別為17.0756μg/g和45.9998μg/g；有銀杏內(nèi)酯表達(dá)的兩個月齡西瓜葉片超氧化物岐化酶活性，表明了供體植物銀杏的多個基因在受體植物西瓜中的得到了表達(dá)[見參考文獻(xiàn)4]。
在維生素C的微生物發(fā)酵生產(chǎn)中，氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)必須依賴巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)提供代謝產(chǎn)物來維持其正常生產(chǎn)和產(chǎn)酸，而產(chǎn)酸所必需的兩種脫氫酶以及相應(yīng)的糖酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)只存在于G.oxydans中。中國科學(xué)院離子束生物技術(shù)重點實驗室用離子束介導(dǎo)法將B.megaterium總DNA導(dǎo)入G.oxydans，獲得了能單獨生長和產(chǎn)酸的G.oxydans基因工程菌[見參考文獻(xiàn)5]。
而酵母菌與人類的關(guān)系源遠(yuǎn)流長，早在八千年前，人們就會利用酵母菌來制作面包、釀造葡萄酒、啤酒和清酒等。到20世紀(jì)末，酵母菌已作為一種模式生物在生物化學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究等方面擔(dān)任了重要的角色。酵母菌作為單細(xì)胞低等真核生物，具有易培養(yǎng)、繁殖快、便于基因操作、能對外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒物質(zhì)等特性，已成為外源基因表達(dá)的合適宿主。
荒漠藥用植物麻黃(Ephedra sp.)含有特殊的生物堿-麻黃堿(l-ephedrine)和偽麻黃堿(d-pseudoephedrine)，具有很高的藥用價值，不僅是馳名中外的傳統(tǒng)藥材，還是重要的蓄水保土、防風(fēng)固沙的荒漠旱生灌木植物，對維持干旱半干旱荒漠地區(qū)的生態(tài)平衡具有顯著作用。麻黃種群所處生境十分惡劣，在自然條件下荒漠地區(qū)的麻黃種子很難萌發(fā)，在麻黃生長區(qū)，很少見到麻黃的實生苗。所以，野生的麻黃挖一棵就少一棵，很難恢復(fù)。長期的人為的掠奪式采挖，已嚴(yán)重破壞了干旱半干旱地區(qū)本來就很脆弱的生態(tài)平衡，不少草地和荒漠已遭到了嚴(yán)重破壞，加劇了生態(tài)環(huán)境惡化，致使風(fēng)沙滿天、水土流失、沙進(jìn)人退。據(jù)有關(guān)專家預(yù)測，未來幾年國內(nèi)外醫(yī)藥市場對麻黃堿和偽麻黃堿的需求量每年可達(dá)1800～2000噸，而提取1噸麻黃堿就需消耗掉200噸野生麻黃。因此，創(chuàng)建麻黃總DNA大分子在酵母菌中的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的酵母工程菌株，將為實現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿奠定基礎(chǔ)，將對中國干旱半干旱荒漠地區(qū)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和民族制藥業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
麻黃堿和偽麻黃堿是荒漠藥用植物麻黃的主要次生代謝產(chǎn)物，它們的分子式、分子量均相同，只是空間結(jié)構(gòu)不同，具體的是位于C原子上的羥基的位置不同，因此，麻黃堿和偽麻黃堿互為同分異構(gòu)體，麻黃堿又稱“左旋麻黃堿”，偽麻黃堿又稱“右旋麻黃堿”。麻黃堿在某種消旋酶的作用下，可轉(zhuǎn)變?yōu)閭温辄S堿。但它們的生物合成途徑不清，遺傳背景不詳。因此，就無法按照常規(guī)的基因工程方法構(gòu)建產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的工程菌。加之，麻黃的基因組很大，更無人嘗試其在微生物中的遺傳轉(zhuǎn)化方法，即使借助離子束介導(dǎo)，也只是植物與植物、微生物與微生物之間的總DNA遺傳轉(zhuǎn)化的探索。很難想象，比微生物基因組大許多倍的藥用植物基因組如何能在微生物中遺傳轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明首次實現(xiàn)了藥用植物-麻黃總DNA在酵母菌中的轉(zhuǎn)化。成功轉(zhuǎn)化麻黃基因組DNA的酵母菌可產(chǎn)生麻黃堿和/或偽麻黃堿。若轉(zhuǎn)基因酵母菌株只產(chǎn)生麻黃堿，而不產(chǎn)生偽麻黃堿，說明控制這種消旋酶的基因未轉(zhuǎn)入受體，或者轉(zhuǎn)入了受體而失去了功能；若轉(zhuǎn)基因酵母菌株只產(chǎn)生偽麻黃堿，而不產(chǎn)生麻黃堿，說明控制這種消旋酶的基因已轉(zhuǎn)入受體，并且活性很強(qiáng)；若轉(zhuǎn)基因酵母菌株既產(chǎn)生麻黃堿，又產(chǎn)生偽麻黃堿，說明控制這種消旋酶的基因已轉(zhuǎn)入受體，但其活性不強(qiáng)，否則，所有的麻黃堿均轉(zhuǎn)變?yōu)閭温辄S堿。因此，只要是轉(zhuǎn)基因菌株產(chǎn)麻黃堿，不論其是否產(chǎn)偽麻黃堿，均證明轉(zhuǎn)化植物總DNA基因組的成功。

發(fā)明內(nèi)容
針對國內(nèi)外藥用植物總DNA在微生物中遺傳轉(zhuǎn)化存在的上述技術(shù)難題，本發(fā)明的目的是提供一種荒漠藥用植物麻黃的總DNA在酵母菌中的轉(zhuǎn)化方法，從而獲得產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的轉(zhuǎn)基因酵母工程菌株。
本發(fā)明提供了一種荒漠藥用植物麻黃的總DNA在酵母菌中的轉(zhuǎn)化方法。
同時，本發(fā)明還提供了產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的轉(zhuǎn)基因酵母工程菌株，這些菌株都是通過利用本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化方法而獲得。
具體地，本發(fā)明提供了一種荒漠藥用植物麻黃的總DNA在酵母菌中的遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體步驟如下1、采集藥用植物麻黃，提取純度A260/A280為1.8±0.1總DNA，并在瓊脂糖電泳中呈單一區(qū)帶；2、將酵母菌的菌種斜面接入麥芽汁培養(yǎng)液中，置旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)8小時-12小時，以可溶性淀粉和葡萄糖溶液(淀粉及葡萄糖的濃度分別為0.1-1.0重量％)作為保護(hù)稀釋液，將菌液稀釋至1.0×107CFU/mL-1.0×108CFU/mL。取稀釋液0.1mL，均勻涂布于無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜。備選地，也可取培養(yǎng)8小時-12小時的酵母菌斜面菌種1～2環(huán)懸浮于濃度為200μg/mL-800μg/mL麻黃總DNA的TE緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到1.0×107CFU/mL-1.0×108CFU/mL，使菌體分散，取0.1mL均勻涂布于無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜；3、將菌膜置于離子注入機(jī)靶臺上，采用劑量為10.0×1015ions/cm2-20.0×1015ions/cm2的Ar+、N+、C+、O+或H+，優(yōu)選Ar+或N+在真空狀態(tài)下，以5s-10s脈沖方式分別注入不同的酵母菌菌體，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)需要無需創(chuàng)造性的勞動確定注入所采用的能量，優(yōu)選為10KeV-20KeV；4、離子注入結(jié)束后，立即用濃度為200μg/mL-800μg/mL麻黃總DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的菌膜，溫育2小時后，洗脫(其中所謂的菌膜，是緊貼于平皿表面的一層含有微生物細(xì)胞的薄膜，無菌分吹干后，此菌膜就被固定在平皿表面。離子注入后，加入含DNA的TE緩沖液，是讓DNA進(jìn)入被離子注入過的細(xì)胞，但TE緩沖液并不能完全將菌膜從平皿上洗脫下來，因此，用無菌玻璃刮鏟反復(fù)涂抹平皿，使菌膜脫離平皿，并充分與TE緩沖液混合，所得液體在離子束生物技術(shù)領(lǐng)域稱為洗脫液)2min，獲得洗脫液，并將洗脫液均勻涂布于分離平板，每一個分離平板可涂布0.1mL洗脫液，倒置，培養(yǎng)72小時，獲得產(chǎn)麻黃堿和/或偽麻黃堿的轉(zhuǎn)基因酵母工程菌株。
本發(fā)明同時提供了轉(zhuǎn)基因酵母工程菌菌株，通過利用荒漠藥用植物麻黃的總DNA在酵母菌中的遺傳轉(zhuǎn)化方法，實現(xiàn)荒漠藥用植物麻黃的總DNA在酵母菌中的遺傳轉(zhuǎn)化，從而獲得產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的轉(zhuǎn)基因酵母工程菌株。
本發(fā)明所用酵母菌選自，但不限于漢遜酵母屬(Hansenula)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)和紅酵母屬(Rhodotorula)。具體地，選自異常漢遜酵母(Hansenula anomala)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans)，樹狀假絲酵母(Candida arborea)，熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，深紅酵母(Rhodotorula rubra)，粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)。
具體地，一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因酵母工程菌株的菌株，命名為0451，其主要次生代謝產(chǎn)物為麻黃堿。該菌株已于申請目前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080。保藏日期是2005年10月20日，保藏號是CGMCC.No.1499。根據(jù)受體菌的來源，0451菌為異常漢遜酵母(Hansenula anomala)?？刹捎萌缦路椒▽ζ溥M(jìn)行保存采用常規(guī)的斜面?zhèn)鞔４娣?，此方法是將本發(fā)明菌種接種于只要適合于酵母菌生長的斜面培養(yǎng)基表面，常規(guī)培養(yǎng)和保存即可?；蚴抢谜婵绽鋬龈稍锓▽⒈景l(fā)明菌種制成干粉菌種，低溫或常溫保藏即可。
另一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因酵母工程菌菌株，命名為1179，其主要次生代謝產(chǎn)物為麻黃堿和偽麻黃堿。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080。保藏日期是2005年10月20日，保藏號是CGMCC.No.1500。根據(jù)受體菌的來源，1179菌為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)?？刹捎蒙鲜霰４?451菌的方法對其進(jìn)行保存。
再一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因酵母工程菌菌株，命名為3161，其主要次生代謝產(chǎn)物為麻黃堿和偽麻黃堿。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080。保藏日期是2005年10月20日，保藏號是CGMCC.No.1501。根據(jù)受體菌的來源，3161菌為發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)?？刹捎蒙鲜霰４?451菌的方法對其進(jìn)行保存。
從如上轉(zhuǎn)基因酵母工程菌的培養(yǎng)液中采集產(chǎn)物，可如下進(jìn)行轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的定性和定量檢測。即轉(zhuǎn)基因酵母工程菌液體培養(yǎng)結(jié)束后，離心，收集培養(yǎng)液，測定轉(zhuǎn)基因酵母胞外麻黃堿和偽麻黃堿含量；收集菌體，冰融破壁，離心，棄細(xì)胞碎片，收集上清液，測定轉(zhuǎn)基因酵母胞內(nèi)麻黃堿和偽麻黃堿含量。其中定性檢測通過銅鉻鹽反應(yīng)進(jìn)行，定量檢測通過高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)行。
培養(yǎng)液或上清液中麻黃堿的銅鉻鹽定性檢測分別取上述培養(yǎng)液或上清液1mL，加入硫酸銅試劑1滴，再加氫氧化鈉試液1滴，含麻黃堿的培養(yǎng)液或上清液顯藍(lán)紫色；再加入1mL乙醚，振搖后放置分層，醚層顯紫紅色，水層變?yōu)榧t色。通過對轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液進(jìn)行銅鉻鹽反應(yīng)，其反應(yīng)為陽性，表明轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液中含有麻黃堿。偽麻黃堿的定性檢測同樣進(jìn)行。同時具備上述兩種顏色反應(yīng)，即表示為陽性，表示培養(yǎng)液或上清液中含有麻黃堿或(和)偽麻黃堿。見[參考文獻(xiàn)6]。
培養(yǎng)液或上清液中麻黃堿和偽麻黃堿的高壓液相色譜(HPLC)定量檢測方法應(yīng)用美國產(chǎn)Waters 1525pump高壓液相色譜儀，UV2487雙通道紫外檢測器，檢測波長(λ)210nm，Kromasil 100-5C18色譜柱(4.6mm×150mm)，Breeze 3.30色譜工作站。流動相0.02M KH2PO4∶乙晴＝95∶5；流量1.2mL/min。
酵母菌胞內(nèi)的麻黃堿和偽麻黃堿的定性及定量檢測同上。
本發(fā)明還提供一種分離轉(zhuǎn)化麻黃總DNA的酵母的培養(yǎng)基，其由下述成分組成葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸鈉0.5％～1.5％，硫酸鎂0.05％～0.1％，磷酸氫二鉀0.05％～0.1％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0后，再加入溴百里香酚蘭0.02％，瓊脂1.5％～2.0％，余量為水。上述百分比為重量百分比。通過該分離培養(yǎng)基，可以分離出成功轉(zhuǎn)化麻黃總DNA的酵母菌。
本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)轉(zhuǎn)化麻黃總DNA的酵母的培養(yǎng)基，其由下述成分組成葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸鈉0.5％～1.5％，硫酸鎂0.05％～0.1％，磷酸氫二鉀0.05％～0.1％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，余量為水。利用該培養(yǎng)基，可以獲得高產(chǎn)率的成功轉(zhuǎn)化麻黃總DNA的酵母菌，其中酵母菌培養(yǎng)液中麻黃堿的產(chǎn)率高達(dá)2.93mg/L。上述百分比為重量百分比。從而可以實現(xiàn)利用酵母菌高產(chǎn)量獲得麻黃堿或偽麻黃堿。
通過實施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果利用本發(fā)明的方法，有效克服了由于植物基因組DNA很大使得難以實現(xiàn)其在微生物中遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)難題。本發(fā)明充分利用酵母菌具有易培養(yǎng)、繁殖快、便于基因操作、能對外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒物質(zhì)等特性，獲得產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的酵母工程菌株，可實現(xiàn)微生物發(fā)酵生產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的目的。


圖1所示為轉(zhuǎn)基因酵母菌在分離平板上的生長情況。
圖2所示為轉(zhuǎn)基因酵母菌株0451的HPLC色譜圖。
圖3所示為轉(zhuǎn)基因酵母菌株1179的HPLC色譜圖。
圖4所示為轉(zhuǎn)基因酵母菌株3161的HPLC色譜圖。
圖5所示為麻黃總DNA瓊脂糖電泳圖。
申請人于2005年10月20日將轉(zhuǎn)基因酵母菌株保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080。保藏號分別是CGMCC.No.1499(菌株0451)、CGMCC.No.1500(菌株1179)和CGMCC.No.1501(菌株3161)。
具體實施例方式
下面，通過參考實施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，則％皆指重量百分比。
其中，分離平板培養(yǎng)基配方如下葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸鈉0.5％～1.5％，硫酸鎂0.05％～0.1％，磷酸氫二鉀0.05％～0.1％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0后，再加入溴百里香酚蘭0.02％，瓊脂1.5％～2.0％，余量為水。分裝，121℃滅菌15min。
斜面培養(yǎng)基配方如下葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸鈉0.5％～1.5％，硫酸鎂0.05％～0.1％，磷酸氫二鉀0.05％～0.1％，瓊脂1.5％～2.0％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，余量為水。分裝試管，121℃滅菌15min。
液體培養(yǎng)基配方如下葡萄糖5.0％～15.0％，酵母膏粉0.5％～1.5％，硝酸鈉0.5％～1.5％，硫酸鎂0.05％～0.1％，磷酸氫二鉀0.05％～0.1％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，余量為水。分裝三角瓶，四層紗布和兩層牛皮紙封口，121℃滅菌15min。
本實施例中的斜面培養(yǎng)基，最重要的功能是轉(zhuǎn)接菌種，其次是保證菌種在傳代時保持穩(wěn)定遺傳，因此，在各實施例中均保持其成分不變。
而分離平板培養(yǎng)基對于獲得轉(zhuǎn)基因酵母是關(guān)鍵的，而液體培養(yǎng)基對獲得高產(chǎn)率的麻黃堿或偽麻黃堿是關(guān)鍵的。從液體培養(yǎng)基的組成可以看出，轉(zhuǎn)基因酵母是以葡萄糖為碳源、NaNO3為氮源合成麻黃堿和/或偽麻黃堿的。
實施例1麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化獲得異常漢遜酵母工程菌0451(1)、藥用植物麻黃的采集、總DNA的制備使用藍(lán)麻黃(Ephedra glauca)樣品10倍量的變色硅膠(產(chǎn)地上海)與帶鱗片狀三角形葉片的藍(lán)麻黃嫩枝(采自新疆雅瑪里克山荒漠區(qū))共同放入密封袋中，室溫下保證12小時內(nèi)干燥，如果發(fā)現(xiàn)硅膠已從深藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，就及時更換，回到實驗室后立即將干燥好的藍(lán)麻黃材料密封放在干燥器中保存。
藍(lán)麻黃材料經(jīng)液氮速凍后，加石英砂共研，采用CTAB法(見參考文獻(xiàn)7)提取總DNA。紫外分光光度計檢測DNA的純度A260/A280為1.8，并在瓊脂糖電泳中呈單一區(qū)帶(附圖5a)。
(2)、酵母菌細(xì)胞的處理將異常漢遜酵母(Hansenula anomala)的菌種(購于北京中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為2.340)斜面接入麥芽汁培養(yǎng)液(見參考文獻(xiàn)8)中，置旋轉(zhuǎn)式搖床230r/min、30℃培養(yǎng)12小時。以0.5％可溶性淀粉(國產(chǎn)，分析純)和0.5％葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)作為保護(hù)稀釋液(保護(hù)稀釋液的配制方法在100mL蒸餾水中加入0.5g可溶性淀粉和0.5g葡萄糖，裝入300mL三角瓶中，塞棉塞，121℃滅菌15min)，對酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。取濃度為1.0×107CFU/mL的菌體稀釋液0.1mL，用無菌玻璃刮鏟均勻涂布于直徑為90mm的無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，置于IBB-Devicel型(產(chǎn)地合肥，中國科學(xué)院等離子體物理研究所制造)或LZD1000型離子注入機(jī)(產(chǎn)地成都，原核工業(yè)部西南物理研究院制造)小真空靶室的無菌靶臺上進(jìn)行氬離子(Ar+)或氮離子(N+)注入。(注入條件見(3)、離子注入)另外，取30℃培養(yǎng)12小時的酵母菌的斜面菌種2環(huán)懸浮于濃度為300μg/mL的藍(lán)麻黃總DNA的TE緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到1.0×108CFU/mL，輕搖使菌體分散，取0.1mL用無菌玻璃刮鏟均勻涂布于直徑為90mm的無菌平皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌膜，置于IBB-Devicel型或LCD1000型離子注入機(jī)小真空靶室的無菌靶臺上進(jìn)行氬離子(Ar+)或氮離子(N+)注入。(注入條件見(3)、離子注入)(3)、離子注入采用能量15KeV、劑量15.0×1015ions/cm2的Ar+或N+在10-3Pa真空狀態(tài)下，以8s脈沖方式注入酵母菌菌體。
(4)、麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化上述兩種菌體離子注入結(jié)束后，分別立即用2mL濃度為400μg/mL的藍(lán)麻黃總DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的菌膜，30℃培育2小時后，用無菌玻璃刮鏟反復(fù)洗脫2min，獲得洗脫液。洗脫液用無菌玻璃刮鏟均勻涂布于分離平板，每一個分離平板可涂布0.1mL洗脫液，倒置，于30℃培養(yǎng)72小時。轉(zhuǎn)基因酵母在分離平板上的生長情況如圖1(a)所示。其中分離平板培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)10.0％，酵母膏粉(Sigma產(chǎn)，生化試劑)0.5％，硝酸鈉(NaNO3，國產(chǎn)，分析純)1.0％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O，國產(chǎn)，分析純)0.05％，磷酸氫二鉀(K2HPO3·3H2O，國產(chǎn)，分析純)0.1％，用氫氧化鈉(國產(chǎn)，分析純)調(diào)pH至7.0后，再加入溴百里香酚蘭(BTB，國產(chǎn)，指示劑)0.02％，瓊脂(國產(chǎn)，生化試劑)1.8％，分裝，121℃滅菌15min，傾倒平板。每個直徑為90mm的無菌平皿傾倒分離平板培養(yǎng)基20mL。
(5)、轉(zhuǎn)基因酵母菌的培養(yǎng)將轉(zhuǎn)化后在分離平板上生長的酵母菌菌落分別接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72小時。再分別接入液體培養(yǎng)基，置旋轉(zhuǎn)式搖床230r/min、30℃培養(yǎng)72小時。其中液體培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)10.0％，酵母膏粉(Sigma產(chǎn)，生化試劑)0.5％，硝酸鈉(NaNO3，國產(chǎn)，分析純)1.0％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O，國產(chǎn)，分析純)0.05％，磷酸氫二鉀(K2HPO3·3H2O，國產(chǎn)，分析純)0.1％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，分裝三角瓶，四層紗布和兩層牛皮紙封口，121℃滅菌15min。
(6)、轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的定性和定量檢測液體培養(yǎng)結(jié)束后，3500r/min離心10min，收集培養(yǎng)液，測定轉(zhuǎn)基因酵母胞外麻黃堿含量；收集菌體，冰融破壁，3500r/min離心15min，棄細(xì)胞碎片，收集上清液，測定轉(zhuǎn)基因酵母胞內(nèi)麻黃堿含量。
將獲得的兩種轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液分別進(jìn)行銅鉻鹽反應(yīng)取上述培養(yǎng)液1mL，加入硫酸銅試劑1滴，再加氫氧化鈉試液1滴，含麻黃堿和(或)偽麻黃堿的培養(yǎng)液顯藍(lán)紫色；再加入1mL乙醚，振搖后放置分層，醚層顯紫紅色，水層變?yōu)榧t色。通過對轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液進(jìn)行銅鉻鹽反應(yīng)，其反應(yīng)為陽性，表明轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液中含有麻黃堿和(或)偽麻黃堿。兩種轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液經(jīng)HPLC檢測后，色譜圖如圖2所示。按美國產(chǎn)WATERS 1525pump高壓液相色譜儀的操作規(guī)程進(jìn)行儀器的操作。每次進(jìn)樣量10μL。標(biāo)樣來源于新疆國際實業(yè)股份有限公司麻黃素事業(yè)部，標(biāo)樣符合美國FDA藥典標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)液與標(biāo)樣的對應(yīng)關(guān)系如圖2所示，經(jīng)檢測，兩種培養(yǎng)液中麻黃堿含量為1.32mg/L，不含偽麻黃堿。
針對兩種轉(zhuǎn)基因酵母菌的胞內(nèi)檢測同樣如上所述進(jìn)行。經(jīng)銅鉻鹽檢測呈陽性。
將獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌株編號為0451，并于2005年10月20日保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCC.No.1499。
實施例2麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化獲得釀酒酵母工程菌1179(1)、藥用植物麻黃的采集、總DNA的制備除使用帶鱗片狀三角形葉片的草麻黃(Ephedra sinica)嫩枝(采自新疆塔里木盆地北部荒漠區(qū))以外，以與實施例1的第(1)部分所述相同的方法制得總DNA。紫外分光光度計檢測DNA的純度A260/A280為1.9，并在瓊脂糖電泳中呈單一區(qū)帶(附圖5b)。
(2)、酵母菌細(xì)胞的處理將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌種(購于北京中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為2.1882)斜面接入麥芽汁培養(yǎng)液(見參考文獻(xiàn)8)中，置旋轉(zhuǎn)式搖床230r/min、30℃培養(yǎng)12小時。以0.1％可溶性淀粉(國產(chǎn)，分析純)和0.1％葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)作為保護(hù)稀釋液(保護(hù)稀釋液的配制方法在100mL蒸餾水中加入0.1g可溶性淀粉和0.1g葡萄糖，裝入300mL三角瓶中，塞棉塞，121℃滅菌15min)，對酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋以外，其它操作過程同實施例1的部分(2)。
(3)、離子注入采用能量20KeV、劑量10.0×1015ions/cm2的Ar+或N+在10-3Pa真空狀態(tài)下，以5s脈沖方式注入酵母菌菌體。
(4)、麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化兩種菌體離子注入結(jié)束后，分別立即用2mL濃度為400μg/mL的草麻黃總DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的菌膜，30℃溫育2小時后，用無菌玻璃刮鏟反復(fù)洗脫2min，獲得洗脫液。洗脫液用無菌玻璃刮鏟均勻涂布于分離平板，每一個分離平板可涂布0.1mL洗脫液，倒置，于30℃培養(yǎng)72小時。轉(zhuǎn)基因酵母在分離平板上的生產(chǎn)情況如圖1(b)所示。其中分離平板培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)5.0％，酵母膏粉(Sigma產(chǎn)，生化試劑)1.5％，硝酸鈉(NaNO3，國產(chǎn)，分析純)0.5％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O，國產(chǎn)，分析純)0.1％，磷酸氫二鉀(K2HPO3·3H2O，國產(chǎn)，分析純)0.05％，用氫氧化鈉(國產(chǎn)，分析純)調(diào)pH至7.0后，再加入溴百里香酚蘭(BTB，國產(chǎn)，指示劑)0.02％，瓊脂(國產(chǎn)，生化試劑)1.8％，分裝，121℃滅菌15min，傾倒平板。每個直徑為90mm的無菌平皿傾倒分離平板培養(yǎng)基20mL。
(5)、轉(zhuǎn)基因酵母菌的培養(yǎng)將轉(zhuǎn)化后在分離平板上生長的酵母菌菌落分別接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72小時。再分別接入液體培養(yǎng)基，置旋轉(zhuǎn)式搖床230r/min、30℃培養(yǎng)72小時。其中液體培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)5.0％，酵母膏粉(Sigma產(chǎn)，生化試劑)1.5％，硝酸鈉(NaNO3，國產(chǎn)，分析純)0.5％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O，國產(chǎn)，分析純)0.1％，磷酸氫二鉀(K2HPO3·3H2O，國產(chǎn)，分析純)0.05％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，分裝三角瓶，四層紗布和兩層牛皮紙封口，121℃滅菌15min。
(6)、轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的定性和定量檢測液體培養(yǎng)結(jié)束后，重復(fù)實施例1的部分(6)，對獲得的轉(zhuǎn)基因酵母胞外麻黃堿和偽麻黃堿及胞內(nèi)麻黃堿和偽麻黃堿進(jìn)行定性及定量測定。其中銅鉻鹽反應(yīng)為陽性，表明轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液中含有麻黃堿。轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液經(jīng)HPLC檢測后，色譜圖如圖3所示。按美國產(chǎn)WATERS 1525pump高壓液相色譜儀的操作規(guī)程進(jìn)行儀器的操作。每次進(jìn)樣量10μL。標(biāo)樣來源于新疆國際實業(yè)股份有限公司麻黃素事業(yè)部，標(biāo)樣符合美國FDA藥典標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)液與標(biāo)樣的對應(yīng)關(guān)系如圖3所示，兩種菌體培養(yǎng)液中麻黃堿含量為1.91mg/L，偽麻黃堿含量為1.18mg/L。
針對兩種轉(zhuǎn)基因酵母菌的胞內(nèi)檢測同樣如上所述進(jìn)行。經(jīng)銅鉻鹽檢測呈陽性。
將獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌株編號為1179，并于2005年10月20日保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCC.No.1500。
實施例3麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化獲得發(fā)酵畢赤酵母工程菌3161(1)、藥用植物麻黃的采集、總DNA的制備除使用帶鱗片狀三角形葉片的中麻黃(Ephedra intermadia)嫩枝(采自新疆準(zhǔn)葛爾盆地西部荒漠區(qū))以外，重復(fù)實施例1的部分(1)，提取總DNA。紫外分光光度計檢測DNA的純度A260/A280為1.7，并在瓊脂糖電泳中呈單一區(qū)帶(附圖5c)。
(2)、酵母菌細(xì)胞的處理將發(fā)酵畢赤酵母(Pichia fermentans)的菌種(購于北京中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為2.1706)斜面接入麥芽汁培養(yǎng)液(見參考文獻(xiàn)8)中，置旋轉(zhuǎn)式搖床230r/min、30℃培養(yǎng)12小時。以1.0％可溶性淀粉(國產(chǎn)，分析純)和1.0％葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)作為保護(hù)稀釋液(保護(hù)稀釋液的配制方法在100mL蒸餾水中加入1.0g可溶性淀粉和1.0g葡萄糖，裝入300mL三角瓶中，塞棉塞，121℃滅菌15min)，對酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋以外，其它操作過程同實施例1的部分(2)。
(3)、離子注入采用能量10KeV、劑量20.0×1015ions/cm2的Ar+或N+在10-3Pa真空狀態(tài)下，以10s脈沖方式注入酵母菌菌體。
(4)、麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化兩種菌體離子注入結(jié)束后，分別立即用2mL濃度為400μg/mL的中麻黃總DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的菌膜，30℃溫育2小時后，用無菌玻璃刮鏟反復(fù)洗脫2min，獲得洗脫液。洗脫液用無菌玻璃刮鏟均勻涂布于分離平板，每一個分離平板可涂布0.1mL洗脫液，倒置，于30℃培養(yǎng)72小時。轉(zhuǎn)基因酵母在分離平板上的生產(chǎn)情況如圖1(c)所示。其中分離平板培養(yǎng)基配方如下葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)15.0％，酵母膏粉(Sigma產(chǎn)，生化試劑)1.0％，硝酸鈉(NaNO3，國產(chǎn)，分析純)1.5％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O，國產(chǎn)，分析純)0.08％，磷酸氫二鉀(K2HPO3·3H2O，國產(chǎn)，分析純)0.08％，用氫氧化鈉(國產(chǎn)，分析純)調(diào)pH至7.0后，再加入溴百里香酚蘭(BTB，國產(chǎn)，指示劑)0.02％，瓊脂(國產(chǎn)，生化試劑)1.8％，分裝，121℃滅菌15min，傾倒平板。每個直徑為90mm的無菌平皿傾倒分離平板培養(yǎng)基20mL。
(5)、轉(zhuǎn)基因酵母菌的培養(yǎng)將轉(zhuǎn)化后在分離平板上生長的酵母菌菌落分別接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72小時。再分別接入液體培養(yǎng)基，置旋轉(zhuǎn)式搖床230r/min、30℃培養(yǎng)72小時。其中液體培養(yǎng)基的組成如下葡萄糖(C6H12O6·H2O，國產(chǎn)，分析純)15.0％，酵母膏粉(Sigma產(chǎn)，生化試劑)1.0％，硝酸鈉(NaNO3，國產(chǎn)，分析純)1.5％，硫酸鎂(MgSO4·7H2O，國產(chǎn)，分析純)0.08％，磷酸氫二鉀(K2HPO3·3H2O，國產(chǎn)，分析純)0.08％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，分裝三角瓶，四層紗布和兩層牛皮紙封口，121℃滅菌15min。
(6)、轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的定性和定量檢測兩種菌體液體培養(yǎng)結(jié)束后，重復(fù)實施例1的部分(6)，測定轉(zhuǎn)基因酵母胞外麻黃堿和偽麻黃堿含量；測定轉(zhuǎn)基因酵母胞內(nèi)麻黃堿和偽麻黃堿含量。
其中，對獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液進(jìn)行銅鉻鹽反應(yīng)為陽性，表明轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液中含有麻黃堿。轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液經(jīng)上述HPLC檢測后，色譜圖如圖4所示。經(jīng)檢測，兩種菌體培養(yǎng)液中麻黃堿含量為2.19mg/L，偽麻黃堿含量為1.78mg/L。
針對轉(zhuǎn)基因酵母菌的胞內(nèi)檢測同樣如上所述進(jìn)行。經(jīng)銅鉻鹽檢測呈陽性。
將獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌株編號為3161，并于2005年10月20日保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCC.No.1501。
實施例4麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化獲得樹狀假絲酵母工程菌(1)、藥用植物麻黃的采集、總DNA的制備重復(fù)實施例1的部分(1)，提取總DNA。紫外分光光度計檢測DNA的純度A260/A280為1.8，并在瓊脂糖電泳中呈單一區(qū)帶(參見實施例1的電泳圖)。
(2)、酵母菌細(xì)胞的處理將樹狀假絲酵母(Candida arborea)的菌種(購于北京中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為2.566)斜面接入麥芽汁培養(yǎng)液中，其它操作過程同實施例1。
(3)、離子注入采用能量15KeV、劑量15.0×1015ions/cm2的Ar+或N+在10-3Pa真空狀態(tài)下，以8s脈沖方式注入酵母菌菌體。
(4)、麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化操作過程同實施例1(5)、轉(zhuǎn)基因酵母菌的培養(yǎng)操作過程同實施例16、轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)麻黃堿和偽麻黃堿的定性和定量檢測操作過程同實施例1通過對獲得的兩種轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液進(jìn)行銅鉻鹽反應(yīng)，其反應(yīng)為陽性，表明轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液中含有麻黃堿和偽麻黃堿。轉(zhuǎn)基因酵母菌株經(jīng)HPLC檢測后，培養(yǎng)液中麻黃堿含量為4.11mg/L，偽麻黃堿含量為1.32mg/L。兩種轉(zhuǎn)基因酵母胞內(nèi)檢測銅鉻鹽反應(yīng)為陽性。
將成功獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌編號為0806。
實施例5麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化獲得深紅酵母工程菌1、藥用植物麻黃的采集、總DNA的制備重復(fù)實施例2的部分(1)，提取總DNA。紫外分光光度計檢測DNA的純度A260/A280為1.9，并在瓊脂糖電泳中呈單一區(qū)帶(參見實施例2的電泳圖)。
2、酵母菌細(xì)胞的處理將深紅酵母(Rhodotorula rubra)(購于北京中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為2.279)的菌種斜面接入麥芽汁培養(yǎng)液中，其它操作過程同實施例1。
3、離子注入采用能量20KeV、劑量10.0×1015ions/cm2的Ar+或N+在10-3Pa真空狀態(tài)下，以5s脈沖方式注入酵母菌菌體。
4、麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化操作過程同實施例25、轉(zhuǎn)基因酵母菌的培養(yǎng)操作過程同實施例26、轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)麻黃堿的定性和定量檢測操作過程同實施例2通過對獲得的兩種轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液進(jìn)行銅鉻鹽反應(yīng)，其反應(yīng)為陽性，表明轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液中含有麻黃堿和偽麻黃堿。轉(zhuǎn)基因酵母菌株經(jīng)HPLC檢測后，培養(yǎng)液中麻黃堿含量為1.39mg/L，偽麻黃堿含量為0.13mg/L。兩種轉(zhuǎn)基因酵母胞內(nèi)檢測銅鉻鹽反應(yīng)為陽性。
將成功獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌編號為1016。
實施例6麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化獲得粘紅酵母工程菌1、藥用植物麻黃的采集、總DNA的制備重復(fù)實施例3的部分(1)，提取總DNA。紫外分光光度計檢測DNA的純度A260/A280為1.7，并在瓊脂糖電泳中呈單一區(qū)帶(參見實施例3的電泳圖)。
2、酵母菌細(xì)胞的處理將粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)(購于北京中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為2.102)的菌種斜面接入麥芽汁培養(yǎng)液中，其它操作過程同實施例3。
3、離子注入采用能量20KeV、劑量10.0×1015ions/cm2的Ar+或N+在10-3Pa真空狀態(tài)下，以5s脈沖方式注入酵母菌菌體。
4、麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化操作過程同實施例35、轉(zhuǎn)基因酵母菌的培養(yǎng)操作過程同實施例36、轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)麻黃堿的定性和定量檢測操作過程同實施例3通過對獲得的兩種轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液進(jìn)行銅鉻鹽反應(yīng)，其反應(yīng)為陽性，表明轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液中含有麻黃堿和偽麻黃堿。轉(zhuǎn)基因酵母菌株經(jīng)HPLC檢測后，培養(yǎng)液中麻黃堿含量為2.16mg/L，不含偽麻黃堿。兩種轉(zhuǎn)基因酵母胞內(nèi)檢測銅鉻鹽反應(yīng)為陽性。
將成功獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌編號為編號為3140。
實施例7麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化獲得熱帶假絲酵母工程菌1、藥用植物麻黃的采集、總DNA的制備重復(fù)實施例3的部分(1)，提取總DNA。紫外分光光度計檢測DNA的純度A260/A280為1.7，并在瓊脂糖電泳中呈單一區(qū)帶(參見實施例3的電泳圖)。
2、酵母菌細(xì)胞的處理將熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)(購于北京中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為2.587)的菌種斜面接入麥芽汁培養(yǎng)液中，其它操作過程同實施例3。
3、離子注入采用能量10KeV、劑量20.0×1015ions/cm2的Ar+或N+在10-3Pa真空狀態(tài)下，以10s脈沖方式分別注入不同的酵母菌菌體。
4、麻黃總DNA的導(dǎo)入和轉(zhuǎn)化操作過程同實施例35、轉(zhuǎn)基因酵母菌的培養(yǎng)操作過程同實施例36、轉(zhuǎn)基因酵母菌產(chǎn)麻黃堿的定性和定量檢測操作過程同實施例3通過對獲得的兩種轉(zhuǎn)基因酵母菌株培養(yǎng)液進(jìn)行銅鉻鹽反應(yīng)，其反應(yīng)為陽性，表明轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液中含有麻黃堿和偽麻黃堿。轉(zhuǎn)基因酵母菌株經(jīng)HPLC檢測后，培養(yǎng)液中麻黃堿含量為2.93mg/L，偽麻黃堿含量為0.30mg/L。兩種轉(zhuǎn)基因酵母胞內(nèi)檢測銅鉻鹽反應(yīng)為陽性。
將成功獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌編號為編號為0406。
[1]楊劍波，吳李君，吳家道等.應(yīng)用低能離子束介導(dǎo)法獲得水稻轉(zhuǎn)基因植株[J].科學(xué)通報，1994，36(16)1530-1534[2]吳麗芳，尹若春，谷運紅等.離子注入法將外源DNA直接導(dǎo)入小麥的研究[J].生物物理學(xué)報，2001，17(4)724-730[3]程備久，田秋元，姚佐文等.離子注入法導(dǎo)入棉花外源基因的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993(增刊)19-22[4]宋道軍，陳若雷，尹若春等.離子束介導(dǎo)植物分子超遠(yuǎn)緣雜交研究[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2001，11(3)327-330 虞龍，余增亮.低能離子注入介導(dǎo)Vc前體(2-KLG)產(chǎn)生菌DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)[J].核技術(shù).2004，27(4)264～268[6]吳立軍.天然藥物化學(xué)[M].北京人民衛(wèi)生出版社，2003[7]閆新甫.轉(zhuǎn)基因植物[M].北京科學(xué)出版社，2003[8]趙斌，何紹江.微生物學(xué)實驗[M].北京，科學(xué)出版社，200權(quán)利要求
1.一種在酵母菌中轉(zhuǎn)化麻黃總DNA的方法，其包含下述步驟(1)采集麻黃，提取總DNA，使其純度為A260/A280＝1.8±0.1；(2)培養(yǎng)酵母菌，并稀釋至1.0×107CFU/mL-1.0×108CFU/mL，所述稀釋使用含淀粉和葡萄糖的溶液或濃度為200μg/mL-800μg/mL麻黃總DNA的TE緩沖液進(jìn)行，其中所述淀粉和葡萄糖的濃度分別為0.1-1.0重量％；(3)將稀釋后的酵母菌制成菌膜；(4)采用劑量為10.0×1015ions/cm2-20.0×1015ions/cm2的離子，在真空狀態(tài)下，以5s～10s脈沖方式注入菌膜中的酵母菌菌體，所述離子選自Ar+、N+、C+、O+或H+；(5)用濃度為200μg/mL-800μg/mL的麻黃總DNA的TE緩沖液浸泡離子注入后的菌膜，溫育2小時后，洗脫，將獲得的洗脫液均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，其中所述分離培養(yǎng)基由下述物質(zhì)組成葡萄糖5.0重量％-15.0重量％，酵母膏粉0.5重量％-1.5重量％，硝酸鈉0.5重量％-1.5重量％，硫酸鎂0.05重量％-0.1重量％，磷酸氫二鉀0.05重量％-0.1重量％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0后，再加入溴百里香酚蘭0.02重量％，瓊脂1.5重量％-2.0重量％，余量為水。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(2)中所述淀粉和葡萄糖的濃度分別為0.5重量％。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(4)中離子注入的能量為10KeV-20KeV。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述酵母菌選自漢遜酵母屬(Hansenula)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)或紅酵母屬(Rhodotorula)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述酵母選自異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)，樹狀假絲酵母(Candida arborea)，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)，深紅酵母(Rhodotorula rubra)或粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)。
6.權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中步驟(4)中所述離子為Ar+或N+。
7.利用權(quán)利要求1-6任一項的方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因酵母。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因酵母，其是保藏號為CGMCC.No.1499的異常漢遜酵母，保藏號為CGMCC.No.1500的釀酒酵母或保藏號為CGMCC.No.1501的發(fā)酵畢赤酵母。
9.一種分離權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因酵母的培養(yǎng)基，其由下述成分組成葡萄糖5.0重量％-15.0重量％，酵母膏粉0.5重量％-1.5重量％，硝酸鈉0.5重量％-1.5重量％，硫酸鎂0.05重量％-0.1重量％，磷酸氫二鉀0.05重量％-0.1重量％，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，溴百里香酚蘭0.02重量％，瓊脂1.5重量％-2.0重量％，余量為水。
10.一種培養(yǎng)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因酵母的培養(yǎng)基，其由下述成分組成葡萄糖5.0重量％-15.0重量％，酵母膏粉0.5重量％-1.5重量％，硝酸鈉0.5重量％-1.5重量％，硫酸鎂0.05重量％-0.1重量％，磷酸氫二鉀0.05重量％-0.1重量％，氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明提供一種將麻黃總DNA轉(zhuǎn)化入酵母菌的方法，由該方法所獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌。同時，本發(fā)明還提供了一種分離上述轉(zhuǎn)基因酵母菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)基因酵母菌的液體培養(yǎng)基。
文檔編號C12N15/87GK101029315SQ20061001140
公開日2007年9月5日 申請日期2006年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日
發(fā)明者毛培宏, 婁愷, 金湘 , 王志方, 魏東, 張軍 申請人:新疆大學(xué), 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所