專利名稱：Erf蛋白terf2在提高植物低溫脅迫耐性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及ERF蛋白TERF2在提高植物低溫脅迫耐性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
低溫對植物的生長發(fā)育具有重大的影響。低溫同樣也嚴(yán)重地影響我國的農(nóng)作物生產(chǎn)安全。如受低溫危害影響比較普遍的東北地區(qū)，在低溫影響嚴(yán)重的年份，可造成20-30％的減產(chǎn)。南方雙季早稻產(chǎn)區(qū)的早春季節(jié)、長江中下游和華南大部地區(qū)的雙季晚稻抽穗開花期的低溫冷害可造成20-70％的產(chǎn)量損失。因此研究植物的抗凍耐低溫脅迫的機(jī)理具有重要應(yīng)用價(jià)值。
在植物的低溫脅迫應(yīng)答中，基因表達(dá)調(diào)控起著重要的作用。通過調(diào)控特異基因的表達(dá)，植物可以迅速的適應(yīng)低溫脅迫，完成低溫脅迫應(yīng)答。蛋白-DNA相互作用是調(diào)控植物基因表達(dá)的重要途徑。ERF轉(zhuǎn)錄因子包含高度保守的ERF DNA結(jié)合域，是一類與植物抗逆性密切相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子。它通過識別不同抗逆基因的順式作用元件，整合了下游相關(guān)抗性功能基因的表達(dá)，改善植物的抗逆性。因此以ERF轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)化植物，便可能同時(shí)改變多個(gè)下游抗逆功能基因的表達(dá)調(diào)控，從而全面改良轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在利用新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TERF2的基因序列(如SEQ ID NO1)，構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化植物，用于提高植物抗凍性能，使植物在寒流突襲或提前到來時(shí)，不致凍壞、凍死。
本發(fā)明技術(shù)方案如下ERF蛋白TERF2在植物抗低溫耐性中的應(yīng)用。
所述應(yīng)用是將TERF2基因用于轉(zhuǎn)化植物，使植物產(chǎn)生低溫耐性。
所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
所述植物為棉花、大豆、油菜、玉米、水稻、苗木、煙草或花草。
所述植物為雙子葉植物煙草。
所述轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、共轉(zhuǎn)化法或基因槍法。
GCC-盒(box)和DRE/CRE元件是植物眾多抗逆性相關(guān)功能基因啟動子中的重要順式作用元件。本發(fā)明利用調(diào)控蛋白與GCC-盒的相互作用，以番茄NP24啟動子上的GCC-box為誘餌，采用酵母單雜交的方法從番茄表達(dá)文庫中篩選到一種ERF蛋白-TERF2(基因庫登陸號為DQ346740)，發(fā)現(xiàn)其在番茄中的表達(dá)受乙烯、ABA、水楊酸和低溫的誘導(dǎo)，能夠與順式作用元件GCC-盒和DRE結(jié)合，具有核定位和轉(zhuǎn)錄激活等特性。超表達(dá)TERF2的煙草能組成型表達(dá)一些乙烯調(diào)控的PR基因的表達(dá)，如煙草PR1(prb-1b)，PR2(β-1，3-glucanase)，PR3(chitinase)，PR5(Osmotin)和植物低溫應(yīng)答相關(guān)基因如ERD10a，ERD10b，SUSY。抗凍實(shí)驗(yàn)證明過表達(dá)TERF2能明顯地提高煙草對凍害的抗性?？梢奣ERF2是一種與植物抗凍性密切相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員。
本發(fā)明提供的利用超表達(dá)TERF2提高轉(zhuǎn)基因植物的抗凍性的用途，對于我國乃致全球的寒冷區(qū)域植物種植，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1表示超表達(dá)TERF2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建。
圖2表示-6℃低溫下處理植物材料不同時(shí)間，恢復(fù)生長48小時(shí)后，存活率的統(tǒng)計(jì)情況。
圖3植物-6℃低溫下處理9小時(shí)，恢復(fù)生長48小時(shí)后的代表性癥狀。
圖4野生型和轉(zhuǎn)TERF2基因煙草在不同溫度凍害處理?xiàng)l件下的電滲透情況。
圖5野生型和轉(zhuǎn)TERF2基因煙草在正常溫度(26℃)和低溫(4℃)脅迫條件下可溶性糖的含量。
圖中WT、OE-2、OE-11、OE-8分別表示為非轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)TERF2煙草株系-2、轉(zhuǎn)TERF2煙草株系-11、轉(zhuǎn)TERF2煙草株系-8。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.1載體構(gòu)建TERF2超表達(dá)載體pROK-TERF2的構(gòu)建將TERF2的編碼序列用引物5’-CCTGATCTAGATGGATTCTTCTTCTTC-3’和5’-CCTGTGTCGACAAAATCATTCGCTTAG-3’擴(kuò)增后，通過XbaI和Kpn1酶切位點(diǎn)克隆到植物雙元表達(dá)載體pROK2[由pBI121(Clontech)改造]的35SCaMV啟動子的下游。(如圖1所示，TERF2全長cDNA插入到pROK2植物表達(dá)載體XbaI和Kpn1位點(diǎn)和CaM35S啟動子的下游)上述載體通過電轉(zhuǎn)化方法分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。
1.2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)pROK2-TERF2轉(zhuǎn)化煙草(1)培養(yǎng)無菌煙草小苗，至長出5片真葉時(shí)用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；(2)將無菌苗的葉片切去邊緣和主脈，切成0.4×0.6cm2大小的外植體；
(3)將農(nóng)桿菌菌液(OD600＝0.8)用新鮮YEB培養(yǎng)基重懸后浸泡切好的外植體5分鐘；(4)用無菌濾紙吸干外植體表面的菌液，轉(zhuǎn)入MS固體基本培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)；(5)三天后，將材料轉(zhuǎn)到含有抗生素(Kan＝100mg/L，羧芐＝500mg/L)和6-BA的分化培養(yǎng)基中于25℃，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗光照周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)，兩周繼代一次；(6)待分化出的小苗長至2-3cm高時(shí)，切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。
將上述2實(shí)例中獲得的T0代轉(zhuǎn)基因植物采用Northern blot鑒定。T0轉(zhuǎn)基因種子使用卡那霉素選擇平板萌發(fā)，確認(rèn)其具有3∶1的分離比，然后將T1轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)至土壤培養(yǎng)直至成熟，收獲T2種子后開展以下抗凍性功能分析。
1.3抗凍性功能分析(圖中WT、OE-2、OE-11、OE-8分別指表示為非轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)TERF2煙草株系-2、轉(zhuǎn)TERF2煙草株系-11、轉(zhuǎn)TERF2煙草株系-8)1.3.1轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性鑒定為了檢測轉(zhuǎn)TERF2煙草植株的抗凍性，對生長6周的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行-6℃低溫處理。低溫處理時(shí)，每處理1小時(shí)，取出部分煙草在正常生長條件(26℃，16/8小時(shí)光周期)恢復(fù)生長48小時(shí)，觀察和統(tǒng)計(jì)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的死亡率，比較野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的抗凍性。
結(jié)果表明在低溫處理5小時(shí)時(shí)野生型煙草開始死亡，而轉(zhuǎn)基因煙草，處理6小時(shí)后，才出現(xiàn)死亡。在處理9小時(shí)時(shí)，野生型煙草的死亡率已達(dá)86.7％，而轉(zhuǎn)TERF2基因煙草的死亡率僅為17.8％(圖2，3)。
1.3.2轉(zhuǎn)基因植株的凍害脅迫下電滲漏率的檢測為了檢驗(yàn)轉(zhuǎn)TERF2對煙草抗凍性的影響，進(jìn)一步檢測植物抗凍性的重要指標(biāo)-低溫脅迫條件下植物離子滲漏性。分別取兩個(gè)培養(yǎng)在土壤中超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草(6周大小的小苗)的葉片(來自不同植株)，用去離子水沖洗，放入50ml離心管中，加入200微升去離子水，按從-2℃到-10℃每個(gè)1℃溫度梯度處理2小時(shí)，然后將處理后的樣品加15毫升去離子水，在搖床輕搖過夜，測電滲，然后將樣品放在滅菌鍋中高溫處理10分鐘，測電滲，計(jì)算電滲漏率。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)兩次，統(tǒng)計(jì)平均電滲漏率。
野生型和轉(zhuǎn)基因煙草不同低溫溫度條件下處理的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)TERF2煙草改善了低溫凍害脅迫條件下(-2℃--10℃)的離子滲漏性(圖4)。如圖中數(shù)據(jù)表明，-6℃低溫冷凍處理下，野生型煙草平均離子滲漏率高于90％，而轉(zhuǎn)基因煙草的不足40％。
1.3.3轉(zhuǎn)基因植株低溫脅迫下可溶性糖含量的檢測提高可溶性糖的含量是植物抗凍性的重要表現(xiàn)。將培養(yǎng)在土壤中超表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草(10周大小的苗)分別在正常溫度(26℃)和低溫(4℃)培養(yǎng)48小時(shí)，取葉片，凍干后(約20毫克)，加80％的乙醇2毫升，80℃處理15分鐘，室溫?fù)u床輕搖1小時(shí)，再加80％的乙醇2毫升，80℃處理15分鐘，室溫?fù)u床輕搖1小時(shí)，4℃過夜后5000g離心10分鐘，然后1-2倍體積的氯仿抽提去除葉綠素，再利用蒽酮法檢測其可溶性糖的含量。
通過對轉(zhuǎn)TERF2煙草檢測其可溶形糖的含量，發(fā)現(xiàn)TERF2明顯提高了轉(zhuǎn)基因煙草凍害脅迫下可溶性糖的含量(圖5)。如圖中所示，低溫4℃處理48小時(shí)后，轉(zhuǎn)基因煙草可溶性糖含量達(dá)到400(微克/毫克.干重)，而野生型煙草可溶性糖的含量不足200(微克/毫克.干重)。
結(jié)論本發(fā)明提供的利用超表達(dá)TERF2提高轉(zhuǎn)基因植物的抗病凍性，具有廣闊的應(yīng)用前景。
附錄SEQ ID NO1(GenBank基因庫登錄號DQ346740，編碼區(qū)105bp-246bp，321-961bp，內(nèi)含子249bp-322bp，小寫字母表示)ACCAAAACCAAAACTGAAACTAAAAgaaaacttttctatacattttTCATTTCTGTATCAATCAATATTCTTTGTTTCTGCTGTTTTGATGAAATCACACTAAGATGTGTGGTGGTGCAATTCTTGCTGATATCATTCCTCCTCGTGACCGCCGTTTGTCATCCACCGACCTATGGCCGACTGATTTCTGGCCAATTTCCACCCAAAATGTTCCTCTCAACCCCAAACGAGCTCGACCCTCTACAGgtactagttaatcatatataaagcttaatttgttgattttgtttttatgctcatttaggcatttcaacaaacagGTGGTGAGCAGATGAAGAAGAGGCAAAGGAAGAATCTTTACAGAGGGATAAGACAACGTCCATGGGGTAAATGGGCTGCTGAAATTCGTGACCCGAGAAAAGGGGTTAGGGTTTGGTTAGGTACTTTCAACACTGCTGAAGAAGCTGCAAGAGCTTATGATAGAGAAGCTCGTAAAATCAGGGGTAAGAAAGCTAAAGTTAATTTCCCCAATGAAGATGACGACCATTACTGCTACAGTCATCCAGAGCCCCCTCCCTTGAACATTGCTTGTGATACTACTGTTACTTACAATCAAGAATCAAATAACTGTTACCCCTTTTACTCAATCGAGAACGTTGAACCTGTTATGGAATTTGCAAGTTATAATGGAATTGAAGATGGAGGAGAGGAGATGGTGAAAAATTTGAATAACAGGGTTGTAGAGGAAGAGGAGAAAACAGAGGATGAAGTGCAGATACTTTCTGATGAGCTGATGGCTTATGAGTCATTGATGAAGTTCTATGAAATACCGTATGTTGACGGGCAATCAGTGGCGGCGACGGTGAATCCAGCGGCGGAGACCGCCGTGGGCGGTGGCTCGATGGAGCTTTGGAGTTTTGATGATGTTAGTCGTCTACAACCAAGTTATAATGTAGTTTAATTATTGTTTTG
權(quán)利要求
1.ERF蛋白TERF2在植物低溫耐性中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于將TERF2基因用于轉(zhuǎn)化植物，使植物產(chǎn)生低溫耐性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述植物為雙子葉植物和單子葉植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述植物為棉花、大豆、油菜、玉米、水稻、苗木、煙草或花草。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述植物為煙草。
6 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、共轉(zhuǎn)化法或基因槍法。
全文摘要
本發(fā)明涉及ERF蛋白TERF2在提高植物低溫脅迫耐性中的應(yīng)用。利用新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TERF2的基因序列(如SEQ ID NO1)，構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化植物，用于提高植物抗凍性能，使植物在寒流突襲或提前到來時(shí)，不致凍壞、凍死。本發(fā)明對于我國乃致全球的寒冷區(qū)域植物的種植，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/29GK1821414SQ20061001140
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者黃榮峰, 張執(zhí)金, 王學(xué)臣, 張海文, 王俊英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所