OsVTC1-1在提高植物鹽脅迫耐性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種OsVTC1-1蛋白在促進(jìn)植物維生素C合成中的應(yīng)用。在體外OsVTC1-1蛋白可以催化甘露糖-1-磷酸生成GDP-甘露糖，表明OsVTC1-1蛋白具有GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性，其在體內(nèi)可能參與半乳糖途徑而調(diào)控Vc合成，提高植物鹽脅迫耐性。OsVTC1-1可以提高擬南芥VTC1突變體vtc1-1中Vc含量，增加了轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。另外，干擾水稻中OsVTC1-1的表達(dá)顯著抑制了水稻Vc的合成，降低了水稻的鹽脅迫耐性?？梢奜sVTC1-1蛋白在提高植物鹽脅迫耐性中具有重要作用。
【專利說明】OsVTC1-1在提高植物鹽脅迫耐性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種OsVTCl-1蛋白在提高植物鹽脅迫耐性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素C是動(dòng)、植物體內(nèi)重要的抗氧化劑和輔酶，可以清除植物體內(nèi)在正常生理活動(dòng)和脅迫條件下積累的活性氧(R0S)，在植物的脅迫應(yīng)答中可以提高植物體內(nèi)積累的R0S，在提高植物脅迫耐性中具有重要作用，所以通過生物技術(shù)的方法提高植物中維生素C含量在改善作物脅迫耐性中具有重要作用。
[0003]研究表明L-半乳糖途徑是植物維生素C生物合成的主要途徑，其活性與植物中維生素C含量密切相關(guān)。半乳糖途徑合成途徑以磷酸果糖為初始底物，磷酸果糖在甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的生成6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖在甘露糖磷酸變位酶的作用下生成1-磷酸甘露糖，1-磷酸甘露糖在GDP-甘露糖焦磷酸化酶生成GDP-甘露糖，進(jìn)入植物維生素C生物合成主要調(diào)控途徑、然后⑶P-甘露糖順序在⑶P-甘露糖_3’，5’ -差向酶、GDP-L-半乳糖磷酸化酶、半乳糖-1-磷酸化酶、半乳糖脫氫酶、半乳糖內(nèi)酯脫氫酶等相關(guān)酶的催化下生成維生素C。L-半乳糖途徑中，催化1-磷酸甘露糖生成⑶P-甘露糖的⑶P-甘露糖焦磷酸化酶是該合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控酶，其活性與植物中維生素C合成量密切相關(guān)，在植物維生素C生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。擬南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶VTCl的點(diǎn)突變體vtcl-1因?yàn)閂TCl的GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性降低而抑制了擬南芥中維生素C的生物合成，其維生素C含量只有野生型的25 - 30%。而VTCl功能缺失突變體，不僅抑制了維生素C的生物合成，而且影響了植物的開花時(shí)間，氧化脅迫耐性等多方面的生理活動(dòng)，降低了植株對(duì)鹽等脅迫的耐性。所以通過調(diào)節(jié)植物中編碼GDP-甘露糖焦磷酸化酶的基因的表達(dá)，不僅可以調(diào)控植物中維生素C的生物合成，而且也可以調(diào)控植物的鹽脅迫耐性。
[0004] 目前，盡管在模式植物擬南芥中Vc合成途徑中關(guān)鍵酶基因的功能比較清楚，但在糧食作物如水稻中Vc還不清楚。我們通過同源克隆的方法從水稻中克隆了擬南芥VTCl的同源基因OsVTCH。體外表達(dá)并純化OsVTCl-1蛋白，在體外檢測(cè)OsVTCl-1蛋白的酶活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在體外OsVTCl-1可以催化1-磷酸甘露糖生成⑶P-甘露糖，表明OsVTCl-1蛋白具有GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性，其在體內(nèi)可能參與半乳糖途徑而調(diào)控Vc合成。將OsVTCl-1構(gòu)建到植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，進(jìn)一步研究OsVTCl-1在植物體內(nèi)的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)OsVTCl-1可以互補(bǔ)擬南芥VTCl功能，提高擬南芥VTCl突變體vtcl-1中Vc含量，表明OsVTCl-1在植物中有VTCl類似功能，通過催化⑶P-甘露糖合成調(diào)控植物Vc合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種OsVTCl-1蛋白在提高植物鹽脅迫耐性中的應(yīng)用。
[0006]在體外OsVTCl-1蛋白可以催化甘露糖-1-磷酸生成⑶P-甘露糖，表明OsVTCl-1蛋白具有GDP-甘露糖焦磷酸化酶活性，其在體內(nèi)可能參與半乳糖途徑而調(diào)控Vc合成。OsVTCl-1可以提高擬南芥WCi突變體Vtcl-1中Vc含量，顯著增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥的鹽脅迫耐性。另外，干擾水稻中OsVTCl-1的表達(dá)顯著抑制了水稻Vc的合成，則明顯降低了水稻鹽脅迫耐性?？梢奜sVTCl-1蛋白在提高植物鹽脅迫耐性中具有重要作用。
[0007]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一種OsVTCl-1基因在改變植物鹽脅迫耐性中的應(yīng)用，所述基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0008]一種OsVTCl-1基因在改變植物鹽脅迫耐性中的應(yīng)用，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1 所示。
[0009]所述的應(yīng)用，所述植物是水稻。
[0010]所述的應(yīng)用，所述改變植物鹽脅迫是降低植物的耐受性，其通過基因工程技術(shù)降低所述基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
[0011]所述的應(yīng)用，所述改變植物鹽脅迫是提高植物的耐受性，其通過基因工程技術(shù)使所述基因在植物中過量表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
[0012]同時(shí)，本發(fā)明還提供所述的OsVTCl-1基因的載體，轉(zhuǎn)化細(xì)胞或宿主細(xì)胞。
[0013]本發(fā)明還提供一種提高植物中Vc合成的方法:將SEQ ID N0.1所示序列的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的維生素C合成提高，鹽脅迫耐性增強(qiáng)。
[0014]上述的方法，所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述植物中的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PCAMBIA1307的多克隆位點(diǎn)得到的。
[0015]本發(fā)明具有以下有益效果:
OsVTCl -1蛋白具有催化甘露糖-1-磷酸生成⑶P-甘露糖的功能，其過表達(dá)不僅可以通過半乳糖途徑提高植物中Vc的生物合成，而且可以顯著增加植物的鹽脅迫耐性。Vc是人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，本發(fā)明提供了一種提高作物(水稻)脅迫耐性(耐鹽脅迫)，同時(shí)改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(高Vc含量)的有效方法，在糧食作物耐性和營(yíng)養(yǎng)改良中具有重要意義。
[0016]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1 為 OsVTC卜I mRNA 序列。
[0018]圖2為OsVTCH基因過表達(dá)載體pCAMBIA1307-0sVTCl_l構(gòu)建示意圖。
[0019]圖3為OsVTCH基因干擾表達(dá)載體pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl_l示意圖。
[0020]圖4為OsVTCl-1基因過表達(dá)材料與干擾材料中OsVTCl-1基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中，A為轉(zhuǎn)基因材料的Western blot的檢測(cè)結(jié)果，B為轉(zhuǎn)基因材料中OsVTCl-1基因表達(dá)的Q-PCR檢測(cè)結(jié)果。
[0021]圖5為OsVTCl-1基因過表達(dá)材料與干擾材料中維生素C含量的檢測(cè)結(jié)果，A中，WT為T3織OsVTCl-1植物表達(dá)載體pCAMBIA1307空載體的擬南芥，vtcl-Ι為擬南芥VTCl的單點(diǎn)突變體vtcl-1，0E7和0E13為T3代轉(zhuǎn)OsVTCH過表達(dá)載體pCAMBIA1307_0sVTCl_l擬南芥的兩個(gè)獨(dú)立株系；B中，WT為野生型水稻中花17，R1-l、R1-2、R1-3為T3代轉(zhuǎn)flsK7T7-7干擾載體pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l水稻的3個(gè)株系。
[0022]圖6為OsVTCl-1基因過表達(dá)擬南芥鹽脅迫耐性，其中，A為用150 mM NaCl處理兩周擬南芥苗7天后，過表達(dá)OsVTCl-1擬南芥在鹽脅迫處理下的耐鹽表型；B為用150 mMNaCl處理兩周擬南芥苗10天后，過表達(dá)AsITCV-7擬南芥在鹽脅迫處理下存活率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。。
[0023]圖7為OsVTCl-1基因干擾水稻鹽脅迫耐性，其中A為用150 mM NaCl處理兩周齡抑制OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗10天后，抑制OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗在鹽脅迫處理下的鹽敏感表型；B為用150 mM NaCl處理兩周齡抑制OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗10天后，在正常生長(zhǎng)條件下恢復(fù)培養(yǎng)I周后抑制OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗存活率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0025]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0026]水稻中花17 (Zhonghua 17)在文獻(xiàn)“ Liu D, Chen X，Liu J, Ye J, Guo Z.(2012)
The rice ERF transcription factor 0sERF922 negatively regulates resistance to
Magnaporthe oryzae and salt tolerance.J Exp Bot.63:3899-3911.，，中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得。 [0027]擬南芥維生素C合成關(guān)鍵基因VTCl的單點(diǎn)突變體vtcl-1在文獻(xiàn)“Conklin PL,Saracco SA, Norris SR, Last RL.(2000) Identification of ascorbic acid-deficientArabidopsis thaliana mutants.Genetics.154:847-856.” 中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得。
[0028]pCAMBIA1307購(gòu)自上海吉然生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為JR13080311。
[0029]農(nóng)桿菌LBA4404購(gòu)自行知生物科技有限公司http://www.biomart, cn/8627/index, htm，產(chǎn)品目錄號(hào)為 AABV02-03。
[0030]誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基)購(gòu)自上?？泼羯锟萍加邢薰荆浱?hào)為BS1309。
[0031]繼代培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基中加2mg/L 2，4_D制成。
[0032]IOOuM AS+AA液體培養(yǎng)基由NB培養(yǎng)基加2mg/L 2，4-D以及100uM/L AS制成。
[0033]pUCCRNAi 在文獻(xiàn) “Gan D, Zhang J, Jiang H, Jiang T, Zhu S，Cheng B (2010)Bacterially expressed dsRNA protects maize against SCMV infection.Plant Cell Rep.29:1261-1268.”中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所獲得。
[0034]PCAMBIA2300購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為MCV036。
[0035]實(shí)施例1、OsVTCl-1基因過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥 一、干擾表達(dá)載體的構(gòu)建
(一)提取水稻中花17的基因組DNA。
[0036](二)設(shè)計(jì)并合成如下引物:
上游引物:5’ -GCTCTAGAACCATGAAGGCGCTCATT-3，(SEQ ID N0.4)
下游引物:5’ -CAGTCGACCATGACAATCTCAGGCTT-3’ (SEQ ID N0.5)
(下劃線所示序列為酶切識(shí)別位點(diǎn))
(三)以步驟(一)的基因組DNA為模板，以步驟(二)中的上游引物和下游引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到OsVTCH基因。
[0037](四)用尬aI與I雙酶切步驟(三)得到的PCR產(chǎn)物，得到基因片段伽I與Sal I雙酶切PCAMBIA1307，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pCAMBIA1307-0sVTCl-l，將該質(zhì)粒送測(cè)序結(jié)果正確，其構(gòu)建示意圖如圖2所示。[0038]二、將pCAMBIA1307-0sVTCl-l通過電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，得到重組農(nóng)桿菌，將其命名為 LBA4404/pCAMBIA1307-0sVTCl-l。
[0039]三、過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥
(一)取生長(zhǎng)狀況良好的、有較多的花苞的擬南芥維生素C合成關(guān)鍵基因VTCl的單點(diǎn)突變體ric7-7,轉(zhuǎn)化前一天燒水。
[0040](二)將重組農(nóng)桿菌 LBA4404/pCAMBIA1307-0sVTCl-l 于 28 °C 培養(yǎng)過夜，至OD600=0.8,6000rpm 離心 6min,收集菌體。
[0041](三)將菌體沉淀懸浮于新鮮配制的轉(zhuǎn)化緩沖液中，至終濃度0D_=0.4，制成懸浮液。
[0042](四)轉(zhuǎn)化時(shí)剪去已經(jīng)開花的花朵或者已有的果莢，傾倒小盆，確保擬南芥全部花苞都浸沒入步驟(三)制備的懸浮液中，浸泡約40s。
[0043](五)吸去植物周圍多余的液體，將植物平放于一個(gè)密封的小盒內(nèi)以保持濕度，避光過夜。
[0044](六)第二天將植物取出，豎直，轉(zhuǎn)移到20°C，16h光照/8h黑暗條件下生長(zhǎng)，得到Tl代種子。
[0045](七)將Tl代種子鋪于含40ug/mL潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，4°C春化48h_72h，移到人工氣候室，16h光照/8h黑暗條件下生長(zhǎng)兩周。
[0046](A)待長(zhǎng)出綠色的轉(zhuǎn)基因抗性幼苗(轉(zhuǎn)基因植物為綠色的幼苗且根較長(zhǎng)；非轉(zhuǎn)基因植物基本為黃化苗或綠色無根幼苗)后移栽入土繼續(xù)生長(zhǎng)，獲得Tl代轉(zhuǎn)基因植株(圖4A為轉(zhuǎn)基因材料的Western blot的檢測(cè)結(jié)果)。
[0047](九)篩選Tl代苗的潮霉素抗性與非抗性的種子具有3:1分離比的轉(zhuǎn)基因植株并加代繁殖，得到T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，將其應(yīng)用于OsVTCl-1蛋白在植物中的功能分析。
[0048]實(shí)施例2、Os VTCl_2基因干擾載體轉(zhuǎn)化水稻 一、過表達(dá)載體的構(gòu)建
(一)提取水稻中花17的基因組DNA。
[0049](二)設(shè)計(jì)并合成如下引物:
上游引物:5’ -CTCTCGAGCCTCCTTTTATGTTATGGTA-3 (SEQ ID N0.6)
下游引物:5’ -CCAGATCTAAGAACAAAGTACAAGGCTG-3’ (SEQ ID N0.7 )
(下劃線所示序列為酶切識(shí)別位點(diǎn))
(三)以步驟(一)的基因組DNA為模板，以步驟(二)的上游引物和下游引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，該DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。(ACCESSIONNUMBER 為 NM_001051330 ;序列為
cctccttttatgttatggtatactcaagttcttttaatgcagtatctttagtttatacctgtgatccttccaagatgttgacctagcatgtgtgttactcacattctgaaaactgcttctcaatgagaattcagtgtgccatatttgattgtaccttcatttggaccatccagtaaagttctcaaccctgcaccaagaggaccagaagaaactctttttcctataaaagaagaggatcagccttgtactttgttctt)(該片段不包含基因 cDNA 片段，位于OsVTCl-1 基因的 3’ UTR 區(qū))
m)Xho I與Bgl II雙酶切步驟(三)得到的PCR產(chǎn)物，得到OsVTCl-1基因的3’UTR片段'Xho I與Bgl II雙酶切pUCCRNAi，得到載體大片段I ;將該片段與載體大片段I連接，得到中間載體I。
[0050]Sal I與BrniH I雙酶切中間載體I，得到載體大片段2 'Xho I與Bgl II雙酶切步驟(三)得到的PCR產(chǎn)物，得到基因片段；將載體大片段2與基因片段連接，得到中間載體2(.Xho I 與 BanM I ,Bgl II 與 I 是同尾酶)。
[0051]Pst I酶切中間載體2，得到雙向互補(bǔ)的OsVTCl-1基因的3’UTR片段^Pst I酶切PCAMBIA2300，得到載體大片段3 ;將雙向互補(bǔ)的OsVTCl-1基因片段與載體大片段3連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l，其構(gòu)建示意圖如圖3所示。
[0052]二、將pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l以電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，得到重組農(nóng)桿菌，將其命名為 LBA4404/pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l。
[0053]三、干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻
(一)將用體積百分含量75%乙醇滅菌后的水稻中花17的種子種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28°C黑暗培養(yǎng)。兩周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28°C繼代暗培養(yǎng)，共繼代暗培養(yǎng)2代。
[0054](二)將第三 代繼代愈傷組織中自然分散、顏色淡黃的胚性愈傷顆粒置于繼代培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)3天，得到的愈傷組織用于重組農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。
[0055](三)將重組農(nóng)桿菌LBA4404/pCAMBIA2300-RNA1-0sVTCl-l 懸浮于 IOOuM AS+AA 液體培養(yǎng)基中(0D_為0.3)，然后將步驟(二)得到的愈傷組織置于菌懸浮液中浸泡10-20分鐘，其間輕輕搖動(dòng)，于28°C培養(yǎng)過夜，至OD6tltl=0.8，6000rpm離心6min，收集菌體。將菌體沉淀懸浮于新鮮配制的轉(zhuǎn)化緩沖液中，至終濃度0D_=0.3-0.6ο
[0056](四)倒掉菌液，小心取出愈傷組織用濾紙吸干多余菌液，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，21 °C -22°C暗培養(yǎng)3天。
[0057](五)挑選共培養(yǎng)后的愈傷組織，濾紙濾干表面水汽后平鋪于篩選培養(yǎng)基(含50mg/L潮霉素)上，28°C進(jìn)行暗培養(yǎng)。2周時(shí)繼代一次，共繼代2次。
[0058](六)將步驟(五)得到的生長(zhǎng)旺盛，呈乳白色或微黃色的新鮮愈傷組織轉(zhuǎn)至預(yù)分化培養(yǎng)基，28°C暗培養(yǎng)I周左右，然后28°C光照培養(yǎng)，兩周左右繼代一次，得到分化苗。
[0059](七)將長(zhǎng)勢(shì)好的分化成苗移至生根培養(yǎng)基(瓶裝)上。培養(yǎng)1-2周后移栽溫室，得到TO代轉(zhuǎn)基因植株以及TO轉(zhuǎn)基因植株的種子。
[0060]將TO轉(zhuǎn)基因植株的種子使用潮霉素選擇平板萌發(fā)，確認(rèn)潮霉素抗性具有3:1分離比的株系，然后將由其得到的Tl轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)至土壤培養(yǎng)直至成熟。將獲得的轉(zhuǎn)基因材料加代繁殖，利用獲得的T3代轉(zhuǎn)基因水稻分析OsVTCl-1蛋白在植物中的功能。
[0061](圖4B為轉(zhuǎn)基因材料中OsVTCl-1基因表達(dá)的Q-PCR檢測(cè)結(jié)果)
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因植株中的維生素C含量檢測(cè)
一、選取3周齡T3代轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻中花17的根及轉(zhuǎn)基因擬南芥、野生型擬南芥和擬南芥VTCl突變體Vtcl-1的葉片,用水沖洗干凈,并用吸水紙吸干多余的水分,然后分別用液氮迅速冷凍，于_80°C保存。
[0062]二、準(zhǔn)確稱取0.175g AsA,溶于Iml體積百分含量為6%的高氯酸(HClO4)水溶液中，即得lmmol/ml的AsA溶液。[0063]三、將lmmol/ml的AsA溶液用體積百分含量為6%的高氯酸溶液將其最終稀釋為濃度分別為 1000nmol/ml、800nmol/ml、600nmol/ml、400nmol/ml、200nmol/ml、100nmol/ml的AsA溶液。
[0064]四、分別取300μ I步驟三得到的不同濃度的AsA溶液，加入2700μ I ρΗ=12.7 丁二酸鈉緩沖液中，混勻，此時(shí)的ρΗ=5.8左右，AsA的濃度相應(yīng)減少了 10倍。在265nm處測(cè)不同濃度的AsA的吸收值。以吸收值(OD)為橫坐標(biāo)，AsA濃度為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。
[0065]五、分別取步驟一得到的0.5g的各植株的材料，在液氮下研磨，分別加入1ml體積百分含量為6%的HClO4水溶液，混勻，冰上放置5min，4°C，12000g,離心10min。取上清，提取其中的AsA。
[0066]六、將步驟五提取的上清液200 μ I加入1800 μ I ρΗ=12.7 丁二酸鈉緩沖液中，然后加入4U的抗壞血酸氧化酶(購(gòu)自Sigma),反應(yīng)10min后，記錄265nm紫外吸收值,記作ODl ;取步驟五提取的上清液200 μ I加入1800 μ I ρΗ=12.7 丁二酸鈉緩沖液中，加入DTT至終濃度為30mM，室溫反應(yīng)30min，記錄265nm紫外吸收值，記作0D2。
[0067]七、將0D2-0D1值代入步驟四得到的線性回歸方程，計(jì)算出AsA的濃度。
[0068]各植株中的維生素C含量檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。
[0069]實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植株鹽脅迫耐性檢測(cè) 將野生型和OsVTCl-1過表達(dá)擬南芥T3種子在MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)，并生長(zhǎng)兩周。將兩周齡的擬南芥苗轉(zhuǎn)入含150 mM NaCl的MS基本培養(yǎng)基上，14小時(shí)光照/10黑暗，22°C，生長(zhǎng)7天。觀察鹽脅迫條件下野生型和OsVTCl-1過表達(dá)擬南芥苗生長(zhǎng)情況，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分析提高OsVTCH表達(dá)在改善擬南芥鹽脅迫耐性中的作用。將野生型和抑制OsVTCl-1表達(dá)水稻T3種子37°C催芽24小時(shí)后，在水中30°C發(fā)芽并生長(zhǎng)3_4天，然后中植土中，28-32°C培養(yǎng)2周。然后用澆150 mM NaCl溶液處理水稻苗10天。觀察鹽脅迫條件下野生型和抑制OsVTCl-1表達(dá)水稻苗生長(zhǎng)情況，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在150 mM NaCl溶液處理水稻苗10天后，恢復(fù)澆灌不加NaCl水溶液，恢復(fù)培養(yǎng)I周，然后統(tǒng)計(jì)野生型和抑制OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分析抑制OsVTCl-1表達(dá)對(duì)水稻鹽脅迫耐性的影響。
[0070]圖6展示提高OsVTCl-1表達(dá)在改善擬南芥鹽脅迫耐性中的作用。圖6A為用150mM NaCl處理兩周擬南芥苗7天后，過表達(dá)OsVTCl-1擬南芥在鹽脅迫處理下的耐鹽表型；圖6B為用150 mM NaCl處理兩周擬南芥苗10天后，過表達(dá)OsVTCl-1擬南芥在鹽脅迫處理下存活率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。上述研究發(fā)現(xiàn)提高OsVTCl-1表達(dá)可以增加擬南芥的鹽脅迫耐性，表明OsVTCl-1蛋白在植物中能通過提高植物Vc合成，增加植物鹽脅迫耐性。
[0071]圖7展示抑制OsVTCl-1表達(dá)降低了水稻鹽脅迫耐性。當(dāng)用NaCl處理抑制水稻中OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因材料時(shí)發(fā)現(xiàn)用NaCl處理抑制水稻中OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗后，轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出鹽敏感性。圖7A為用150 mM NaCl處理兩周齡抑制OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗10天后，抑制OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗在鹽脅迫處理下的鹽敏感表型；圖6B為用150 mM NaCl處理兩周齡抑制OsVTCl-1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗10天后，在正常生長(zhǎng)條件下恢復(fù)培養(yǎng)I周后抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻苗存活率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。上述研究發(fā)現(xiàn)抑制OsVTCl-1表達(dá)顯著降低了轉(zhuǎn)基因水稻的鹽脅迫耐性，表明OsVTCl-1可通過調(diào)節(jié)水稻Vc合成調(diào)控水稻的鹽脅迫耐性。
[0072]綜上所述，OsVTCl-1在植物鹽脅迫應(yīng)答中具有重要作用(圖6，圖7)。
【權(quán)利要求】
1.一種OsVTCl-1基因在改變植物鹽脅迫耐性中的應(yīng)用，其特征在于:所述基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示。
2.—種OsVTCl-1基因在改變植物鹽脅迫耐性中的應(yīng)用，其特征在于:所述基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物是水稻。
4.如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于:所述改變植物鹽脅迫是降低植物的耐受性，其通過基因工程技術(shù)降低所述基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
5.如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于:所述改變植物鹽脅迫是提高植物的耐受性，其通過基因工程技術(shù)使所述基因在植物中過量表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
6.含權(quán)利要求1中所述的OsVTCl-1基因的載體，轉(zhuǎn)化細(xì)胞或宿主細(xì)胞。
7.一種提高植物中Vc合成的方法，其特征在于:將SEQ ID N0.1所示序列的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的維生素C合成提高，鹽脅迫耐性增強(qiáng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述編碼基因是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述植物中的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PCAMBIA1307的多克隆位點(diǎn)得到 。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104004078SQ201410269067
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】張執(zhí)金, 秦華, 鄧載安, 張傳玉, 王亞云, 王娟, 張海文, 權(quán)瑞黨, 黃榮峰 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所