固定化土曲霉脂肪酶的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于化學合成領域，具體涉及固定化土曲霉脂肪酶的制備方法及其應用。本發(fā)明要解決的技術問題是游離的土曲霉脂肪酶穩(wěn)定性差、不能回收利用，現(xiàn)有的酮洛芬乙烯酯水解方法產(chǎn)率低。本發(fā)明解決上述技術問題的方案是提供一種固定化土曲霉脂肪酶的制備方法，包括以下步驟：將土曲霉脂肪酶與Alg-g-mPEG混合均勻后，再與α-CD反應，得到固定化土曲霉脂肪酶。本發(fā)明還提供了上述固定化土曲霉脂肪酶催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解的方法，并且該方法具有更好的立體選擇性，同時大大提高了產(chǎn)率，可多次循環(huán)回收利用。
【專利說明】固定化土曲霉脂肪酶的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于化學合成領域，具體涉及固定化土曲霉脂肪酶的制備方法及其應用?！颈尘凹夹g】
[0002]游離的酶穩(wěn)定性差，而且在實際工業(yè)應用中不能回收利用，酶的固定化技術使酶克服了這些缺點。目前，酶的固定化技術主要分為四類:吸附法，包埋法，交聯(lián)法和共價結合法。吸附法是通過離子作用或物理吸附將酶固定到載體上，操作簡單，條件溫和，對酶活保持較好，但是由于物理吸附作用力弱，固定的酶容易流失，工業(yè)應用在一定程度上受到了限制。交聯(lián)法是通過雙功能或多功能試劑使酶分子之間交聯(lián)實現(xiàn)固定化，雖然固定的酶很牢固但由于交聯(lián)的條件苛刻，酶分子通常失活很嚴重。共價結合法通過雙功能試劑將酶分子與載體連接起來，操作比較復雜，容易破壞酶的部分活性中心。包埋法是將酶分子包埋在凝膠網(wǎng)格或高分子囊腔中，雖然只適合小分子底物和產(chǎn)物，但是其固定化條件溫和，對酶的結構影響小，酶活保持較好。
[0003]酮洛芬作為一種非留體抗炎藥，其中只有S-構型才具有廣泛的抗炎鎮(zhèn)痛的作用，R-構型的酮洛芬只對治療牙痛有用。目前酮洛芬被廣泛用于治療類風濕性關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、關節(jié)強硬性脊椎炎及痛風等。根據(jù)已有報道，將酮洛芬制成酯類衍生物可以增加生物應用性(Bonina F P，Montenegro L, Guerrera F.Naproxenl-alkylazacycloalkan-2-one esters as dermal prodrugs:1n vitro evaluation[J].1nternationaljournal of pharmaceutics, 1993，100 (I):99-105.)。并且，S-構型的酮洛芬乙烯酯可以作為一種前藥或者重要聚合物藥物的單體(Cai X Q, Chen Z C，Wang N，et al.A facilemethod for preparation of polymerizable, optically active ketoprofen prodrug byirreversible lipase-catalysed resolution[J].World Journal of Microbiology andBiotechnology, 2006, 22(7):723-727.)。
[0004]選擇性的水解消旋的酮洛芬乙烯酯，可以得到R-構型的酮洛芬乙烯酯和S-構型的酮洛芬，或者S-構型的酮洛芬乙烯酯和R-構型的酮洛芬。目前，獲得單一構型酮洛芬的方法有結晶法，動力學拆分法，不對稱合成法和色譜分離法。其中，動力學拆分是最為廣泛使用的方法。與化學催化劑相比，酶法拆分具有更大的優(yōu)勢。在酶促動力學拆分中，對映選擇性水解是常用方法之一。酮洛芬乙烯酯被選為對映選擇性水解的底物，是因為其水解生成的醇可以通過互變異構體成為乙醛，使水解過程不可逆，并且易于分離。Zhong Ni等人用固定化的枯草芽孢桿菌脂肪酶A催化酮洛芬乙烯酯的水解(NiZ, Zhou P，Jin X, et al.1ntegrating in silico and in vitro approaches to dissectthe stereoselectivity of Bacillus subtilis lipase a toward Ketoprofen VinylEster [J].Chemical Biology&Drug Design, 2011, 78(2):301-308.)，產(chǎn)物的對映體過量(ee值)為93%，但是轉化率只有20.3%，并且沒有對固定化的枯草芽孢桿菌脂肪酶A進行回收。
[0005]本發(fā)明采用的Alg-g-mPEG (海藻酸鈉接枝聚乙二醇單甲醚)的制備方法為:將Boc (叔丁氧羰基保護)的甘氨酸與mPEG2000 (聚乙二醇單甲醚2000)反應，得到Boc保護甘氨酸修飾的mPEG2000 ;再脫去Boc保護基，得到端氨基修飾的mPEG2000 ;將端氨基修飾的mPEG2000與海藻酸鈉反應，得到Alg-g-mPEG。上述Alg-g-mPEG的制備方法參見Meng X W，Qin J, Liu Y，et al.Degradable hollow spheres based on self-assemblyinclusion[J].Chemical Communications, 2010, 46(4):643-645。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是游離的土曲霉脂肪酶穩(wěn)定性差、不能回收利用，現(xiàn)有的酮洛芬乙烯酯水解方法產(chǎn)率低。
[0007]本發(fā)明解決上述技術問題的方案是提供一種固定化土曲霉脂肪酶的制備方法，包括以下步驟:將土曲霉脂肪酶與Alg-g-mPEG (海藻酸鈉接枝聚乙二醇單甲醚)混合均勻后，再與a -⑶(a -環(huán)糊精)反應，得到固定化土曲霉脂肪酶(Alg-g-PEG/a -⑶)。
[0008]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述固定化土曲霉脂肪酶的制備方法的具體操作步驟包括:
[0009]a、制備海藻酸鈉接枝聚乙二醇單甲醚；
[0010]b、將土曲霉脂肪酶加入到Alg-g-mPEG的Tris (三羥甲基氨基甲烷)-HCl緩沖溶液中混合均勻，再滴加a -⑶溶液，滴加完畢后，3~5°C下反應12~24h,將反應液離心,然后將沉淀冷凍干燥，得到固定化土曲霉脂肪酶(Alg-g-PEG/a-⑶)。
[0011]其中，上述固定化土曲霉脂肪酶的制備方法中，步驟b所述Alg-g-mPEG、a -⑶、土曲霉脂肪酶的質量比為I~2: 6~9: 0.015~0.075。
[0012]其中，上述固定化土曲霉脂肪酶的制備方法中，步驟b所述Tris-HCl緩沖溶液的pH值為6.6~8.0。
[0013]其中，上述固定化土曲霉脂肪酶的制備方法中，步驟b所述Alg-g-mPEG的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液的濃度為1%~2%(w/v)。
[0014]其中，上述固定化土曲霉脂肪酶的制備方法中，步驟b所述a-CD的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液的濃度為6%~9%。
[0015]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述固定化土曲霉脂肪酶可進行雙重固定化。所述雙重固定化的操作步驟包括:將固定化土曲霉脂肪酶用Tris-HCl緩沖溶液分散沉淀，再加入海藻酸鈉制成質量-體積分數(shù)為1%~1.5%的混合液，再將上述混合液滴入質量-體積分數(shù)為0.5%~1.0%的氯化鈣溶液中，形成直徑為2~4mm的小球,制得雙重固定化土曲霉脂肪酶。
[0016]本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的固定化土曲霉脂肪酶，在選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解反應中的用途。
[0017]固定化土曲霉脂肪酶選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解反應的操作步驟包括:將固定化土曲霉脂肪酶或雙重固定化土曲霉脂肪酶與酮洛芬乙烯酯在有機溶劑/Tris-HCl緩沖溶液中反應。其中，所述水解反應的反應溫度為30~50°C，反應時間為96~120h。所述固定化土曲霉脂肪酶或雙重固定化土曲霉脂肪酶與酮洛芬乙烯酯的質量比為I~10:1。
[0018]其中，上述固定化土曲霉脂肪酶選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解的反應中，所述的有機溶劑為1，4-二氧六環(huán)、乙腈、丙酮、異丙醇、四氫呋喃、正丁醇、二氯甲烷、叔丁基甲醚、異丙醚、環(huán)己烷或正己烷中的任意一種。
[0019]其中，上述固定化土曲霉脂肪酶選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解的反應中，所述Tris-HCl緩沖溶液的pH為7~8，含水量為20%~40%。
[0020]上述固定化土曲霉脂肪酶選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解的反應式為:
[0021]
【權利要求】
1.固定化土曲霉脂肪酶的制備方法，包括以下步驟:將土曲霉脂肪酶與海藻酸鈉接枝聚乙二醇單甲醚混合均勻后，再與a-環(huán)糊精反應，得到固定化土曲霉脂肪酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的固定化土曲霉脂肪酶的制備方法，其特征在于:包括以下操作步驟: a、制備海藻酸鈉接枝聚乙二醇單甲醚； b、將土曲霉脂肪酶加入到海藻酸鈉接枝聚乙二醇單甲醚的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液中混合均勻，再滴加a -環(huán)糊精的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液，滴加完畢后，3~5°C下反應12~24h，將反應液離心，然后將沉淀冷凍干燥，得到固定化土曲霉脂肪酶。
3.根據(jù)權利要求2所述的固定化土曲霉脂肪酶的制備方法，其特征在于:步驟b所述海藻酸鈉接枝聚乙二醇單甲醚、a-環(huán)糊精、土曲霉脂肪酶的質量比為I~2: 6~9:0.015 ~0.075。
4.根據(jù)權利要求2所述的固定化土曲霉脂肪酶的制備方法，其特征在于:步驟b所述三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液的pH值為6.6~8.0 ;步驟b所述海藻酸鈉接枝聚乙二醇單甲醚的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液的濃度為1.0~2.0%(w/v);步驟b所述a-環(huán)糊精的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液的濃度為6.0~9.0%。
5.根據(jù)權利要求1~4任一項所述的固定化土曲霉脂肪酶的制備方法，其特征在于:將固定化土曲霉脂肪酶進行雙重固定化；所述雙重固定化的操作步驟包括:將固定化土曲霉脂肪酶用三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液分散沉淀，再加入海藻酸鈉制成質量-體積分數(shù)為1%~1.5%的混合液，再將上述混合液滴入質量-體積分數(shù)為0.5%~1.0%的氯化鈣溶液中，形成直徑為2~4_的小球,制得雙重固定化土曲霉脂肪酶。
6.權利要求1~4任一項所述的方法制備得到的固定化土曲霉脂肪酶或權利要求5所述的方法制備得到的雙重固定化土曲霉脂肪酶，在選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解反應中的用途。
7.根據(jù)權利要求6所述的固定化土曲霉脂肪酶選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解反應的用途，其特征在于:水解反應的操作步驟包括:將固定化土曲霉脂肪酶或雙重固定化土曲霉脂肪酶與酮洛芬乙烯酯在有機溶劑/三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液中反應。
8.根據(jù)權利要求7所述的固定化土曲霉脂肪酶選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解反應的用途，其特征在于:所述水解反應的反應溫度為30~50°C，反應時間為96~120h。
9.根據(jù)權利要求7所述的固定化土曲霉脂肪酶選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解反應的用途，其特征在于:固定化土曲霉脂肪酶或雙重固定化土曲霉脂肪酶與酮洛芬乙烯酯的質量比為I~10:1。
10.根據(jù)權利要求7所述的固定化土曲霉脂肪酶選擇性催化消旋的酮洛芬乙烯酯水解反應的用途，其特征在于:所述的有機溶劑為1，4-二氧六環(huán)、乙腈、丙酮、異丙醇、四氫呋喃、正丁醇、二氯甲烷、叔丁基甲醚、異丙醚、環(huán)己烷或正己烷中的任意一種；所述三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖溶液的pH為7~8，含水量為20%~40%。
【文檔編號】C12R1/66GK103667242SQ201310752140
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權日:2013年12月31日
【發(fā)明者】余孝其, 胡成莉, 王娜, 張晟 申請人:四川大學