一種2，3-環(huán)氧角鯊烯的生物合成方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種2，3-環(huán)氧角鯊烯的生物合成方法，是同時在大腸桿菌（Escherichia?coli）中表達角鯊烯合成酶和角鯊烯環(huán)氧化酶，再將該大腸桿菌發(fā)酵制備2，3-環(huán)氧角鯊烯。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)手段，構(gòu)建了包含角鯊烯合成酶基因和角鯊烯環(huán)氧化酶基因的大腸桿菌工程菌，實現(xiàn)角鯊烯合成酶和角鯊烯環(huán)氧化酶在大腸桿菌體內(nèi)的共表達，其中角鯊烯合成酶可以在大腸桿菌體內(nèi)催化生產(chǎn)角鯊烯，而角鯊烯環(huán)氧化酶可以將底物角鯊烯催化合成2，3-環(huán)氧角鯊烯。利用該大腸桿菌工程菌能夠大大提高2，3-環(huán)氧角鯊烯的產(chǎn)量，也為原人參二醇及羊毛甾醇等天然化合物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種2，3-環(huán)氧角鯊烯的生物合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種2，3-環(huán)氧角鯊烯的生物合成方法，以及本發(fā)明方法所用到的生產(chǎn)菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]2，3-環(huán)氧角鯊烯是角鯊烯烴角鯊烯環(huán)氧化酶(角鯊烯單加氧酶)催化后的產(chǎn)物，系由角鯊烯轉(zhuǎn)變成原人參二醇和羊毛留醇的中間產(chǎn)物。原人參二醇是傳統(tǒng)名貴藥材人參和西洋參的主要活性成分，具有廣泛的抗腫瘤作用；而留醇生物體合成也對高血脂引起的心血管疾病和真菌感染皮膚病的治療有著十分顯著的療效。因此尋求一種能夠大量生成2，3-環(huán)氧角鯊烯的方法對于大量合成原人參二醇或羊毛留醇有著重要意義。
[0003]2，3_環(huán)氧角鯊烯屬于植物三萜皂苷類化合物和留醇類化合物代謝流的中間產(chǎn)物，并不會在細胞內(nèi)大量積累，因此傳統(tǒng)的植物提取方法對于大規(guī)模生產(chǎn)2，3-環(huán)氧角鯊烯是不可行的。隨著基因工程技術(shù)的不斷進步，近些年人們開始廣泛尋求利用微生物合成2，3-環(huán)氧角鯊烯的方法，但未取得實質(zhì)性進展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種2，3-環(huán)氧角鯊烯的生物合成方法，并提供了用于生產(chǎn)2，3-環(huán)氧角鯊烯的重組菌株。本發(fā)明通過將角鯊烯合成酶和角鯊烯環(huán)氧化酶基因進行克隆及在大腸桿菌(Escherichia coli)中共表達,構(gòu)建得到能合成2，3_環(huán)氧角鯊烯的重組菌株，為實現(xiàn)2，3-環(huán)氧角鯊烯的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明一方面提供了一種2，3-環(huán)氧角鯊烯的生物合成方法，是同時在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達角S烯合成酶和角S烯環(huán)氧化酶,再將該大腸桿菌發(fā)酵制備2，3-環(huán)氧角鯊烯。
[0006]其中角鯊烯合成酶，其一種氨基酸序列為SEQ ID N0:1 ；
[0007]角鯊烯環(huán)氧化酶，其一種氨基酸序列為SEQ ID NO:3 ；
[0008]本發(fā)明的2，3-環(huán)氧角鯊烯的生物合成方法，具體步驟如下:
[0009]I)構(gòu)建含角鯊烯合成酶基因的表達載體；
[0010]2)構(gòu)建含角鯊烯環(huán)氧化酶基因的表達載體；
[0011]3)將I)和2)構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，獲得重組表達角鯊烯合成酶和鯊烯環(huán)氧化酶的工程菌；
[0012]4)發(fā)酵培養(yǎng)上述步驟3)得到的大腸桿菌工程菌，生產(chǎn)2，3-環(huán)氧角鯊烯。
[0013]其中，角鯊烯合成酶編碼基因具有:
[0014](a)包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0015](b)與SEQ ID N0:2具有95%序列同一性的核苷酸序列。
[0016]角鯊烯環(huán)氧化酶編碼基因具有:
[0017](a)包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；[0018](b)與SEQ ID N0:4具有95%序列同一性的核苷酸序列。
[0019]本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述的攜帶有能表達角鯊烯合成酶基因的表達載體為質(zhì)粒PACY⑶uet-Ι，表達角鯊烯環(huán)氧化酶基因的表達載體為質(zhì)粒pET28a(+)。
[0020]本發(fā)明另一方面提供了一種生產(chǎn)2，3-環(huán)氧角鯊烯的大腸桿菌工程菌，其特征在于，攜帶有能表達角鯊烯合成酶基因和角鯊烯環(huán)氧化酶基因的表達載體。
[0021 ] 本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述的大腸桿菌為大腸桿菌BL21。
[0022]本發(fā)明利用基因工程技術(shù)手段，構(gòu)建了包含角鯊烯合成酶基因和角鯊烯環(huán)氧化酶基因的大腸桿菌工程菌，實現(xiàn)角鯊烯合成酶和角鯊烯環(huán)氧化酶在大腸桿菌體內(nèi)的共表達，其中角鯊烯合成酶可以在大腸桿菌體內(nèi)催化生產(chǎn)角鯊烯，而角鯊烯環(huán)氧化酶可以將底物角鯊烯催化合成2，3-環(huán)氧角鯊烯。利用該大腸桿菌工程菌能夠大大提高2，3-環(huán)氧角鯊烯的的產(chǎn)量，也為原人參二醇及羊毛留醇等天然化合物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1:本發(fā)明使用的SQS-pACY⑶uet-Ι質(zhì)粒的遺傳圖譜。
[0024]圖2:BL21-SQS菌體胞內(nèi)蛋白SDS-PAGE電泳檢測圖。
[0025]其中:泳道I為BL21-pACYCDuet-l (陰性對照)菌體胞內(nèi)蛋白；泳道2為BL21-SQS菌體胞內(nèi)蛋白；箭頭所指條帶為角鯊烯合成酶。
[0026]圖3:BL21-SQS菌體胞內(nèi)代謝產(chǎn)物HPLC分析圖譜。
[0027]其中:A為角鯊烯標準品分析圖譜；B為BL21-SQS菌體胞內(nèi)代謝產(chǎn)物分析圖譜；箭頭所指的峰表明菌體胞內(nèi)代謝產(chǎn)物中含有角鯊烯。
[0028]圖4:BL21-SQS菌體胞內(nèi)代謝產(chǎn)物MS質(zhì)譜分析圖譜。
[0029]其中:A為角鯊烯標準品分析圖譜；B為BL21-SQS菌體胞內(nèi)目標產(chǎn)物分析圖譜；箭頭所指的峰表明目標產(chǎn)物為角鯊烯。
[0030]圖5:SE-pET28a(+)質(zhì)粒圖譜。
[0031]圖6:BL21-SE菌體胞內(nèi)蛋白SDS-PAGE電泳檢測圖。
[0032]其中:泳道I為蛋白質(zhì)Marker ;泳道2為BL21/pET28a(+)(陰性對照)菌體胞內(nèi)蛋白；泳道3為BL21-SE菌體胞內(nèi)蛋白。
[0033]圖7:BL21-SE菌體細胞裂解液體外測活反應(yīng)產(chǎn)物LC-MS檢測圖譜。
[0034]其中:圖7-A與7-C為環(huán)氧角鯊烯標準品分析圖譜，圖7-B與7_D為BL21-SE菌體細胞裂解液體外測活反應(yīng)產(chǎn)物；箭頭所指的峰表明目標產(chǎn)物為環(huán)氧角鯊烯。
[0035]圖8 =BL-SQS-S`E菌體胞內(nèi)蛋白SDS-PAGE電泳檢測圖。
[0036]其中:泳道M 為蛋白質(zhì) Marker ;泳道 1，2 為 BL21/pACYCDuet_l/pET28a(+)(陰性對照)菌體胞內(nèi)蛋白；泳道3，4為BL21-SQS-SE菌體胞內(nèi)蛋白；箭頭所指處即為重組表達的角鯊烯合成酶和角鯊烯環(huán)氧化酶。
【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合實例對本發(fā)明的方法做進一步說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。
[0038]實施例1角鯊烯合成酶表達載體的構(gòu)建
[0039]將印度人參基因組中的角鯊烯合成酶基因(GenBank Accession No?⑶732820)依據(jù)大腸桿菌密碼偏愛進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的角鯊烯合成酶基因序列為SEQ ID N0:2，其編碼氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，由上海英濰捷基生物科技有限公司合成。
[0040]設(shè)計基因片段兩邊酶切位點Nco I，EcoRI。分別利用引物F:5，-CATGCCATGGGCACCCTGCGTGCAAT-3，和 R: 5 ’ -CCGGAATTCTTAATTCGGCTCGCTGCGAATCA-3，進行 PCR 擴增，PCR 擴增條件:95°C, IOmin ；95°C,30S ；55°C,30S,30 個循環(huán)；72°C, 1.5min ；72。。，IOmin。
[0041]將PCR擴增產(chǎn)物與大腸桿菌表達質(zhì)粒pACYCDuet-1，經(jīng)Nco I和EcoRI雙酶切，37°C酶切過夜后，酶切產(chǎn)物瓊脂糖膠回收純化。以酶切PCR產(chǎn)物與酶切質(zhì)粒pACYCDuet-1摩爾濃度6:1的設(shè)計連接體系，加入Iul T4連接酶，22°C連接4h，將連接產(chǎn)物加入50ul大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42°C熱擊90s轉(zhuǎn)化。加入Iml LB培養(yǎng)基，37°C復壯Ih,收集菌體涂于氯霉素抗性篩選LB平板中，37°C培養(yǎng)過夜。隔日菌落PCR挑選陽性轉(zhuǎn)化子，序列分析正確后，新質(zhì)粒命名為SQS-pACY⑶uet-1，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0042]實施例2角鯊烯合成酶誘導表達及產(chǎn)物測定
[0043]將陽性轉(zhuǎn)化子于LB培養(yǎng)基中，37 °C，200rpm培養(yǎng)8h，收集菌體，提質(zhì)粒SQS-pACYCDuet-1，4°C 保存待用。
[0044]制備大腸桿菌E.coli BL21電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，加入SQS-pACYCDuet-l質(zhì)粒，混勻，冰浴放置30min，42°C熱擊90s轉(zhuǎn)化。加入Iml LB培養(yǎng)基，37°C復壯lh，收集菌體涂于卡那霉素濃度為50ug/ml抗性篩選LB平板中，37°C培養(yǎng)過夜。菌落PCR驗證目的基因SQS，將獲得的重組菌株命名為大腸桿菌BL21-SQS。
`[0045]將重組菌株BL21-SQS在LB發(fā)酵培養(yǎng)基中37°C、220rpm發(fā)酵培養(yǎng)過夜；隔日轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2h ;加終濃度為ImM IPTG，28°C誘導6h ;離心收集菌體，溶于400 u I超純水中，超聲破碎，SDS-PAGE分析檢測重組菌胞內(nèi)蛋白表達情況，實驗結(jié)果如圖2所示。已知角鯊烯合成酶蛋白分子量為45kDa，圖3中重組菌胞內(nèi)蛋白所在泳道2與陰性對照泳道I相比，在45kDa左右多出一條蛋白條帶，即箭頭所指位置，說明角鯊烯合成酶在重組大腸桿菌BL21-SQS胞內(nèi)得到了有效表達。
[0046]取發(fā)酵液1L，離心收集重組菌體；加入200ml20%K0H乙醇溶液(乙醇與水的體積比為70:30)，501:、200印111裂解411 ;加入等體積正己烷，25°C、200rpm混勻Ih ;室溫靜置20min，取上清濃縮。HPLC檢測條件:流動相甲醇:乙腈體積比為60:40，柱溫30°C，流速
1.0ml/min。實驗結(jié)果如圖3所示，A為角鯊烯標準品，在13.5min出現(xiàn)一 HPLC吸收峰，B為重組菌體胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，在相同的時間也出現(xiàn)了一吸收峰(即箭頭所指位置)，說明重組菌體胞內(nèi)代謝產(chǎn)物中可能存在角鯊烯。進一步將上述兩個HPLC吸收峰分別進行MS質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖4所示，重組菌體胞內(nèi)目標產(chǎn)物(B圖)的分子量與角鯊烯標準品(A圖)的分子量相同，說明該目標產(chǎn)物就是角鯊烯，從而也說明本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌工程菌株BL21-SQS可以在體內(nèi)合成天然產(chǎn)物角鯊烯。多個重組菌的表達產(chǎn)物分析結(jié)果也證明了本發(fā)明方法的可靠性。
[0047]實施例3角鯊烯環(huán)氧化酶表達載體構(gòu)建[0048]將莢膜甲基球菌基因組中的角鯊烯環(huán)氧化酶基因DDBJ (GenBank AccessionN0.AAU91076)依據(jù)大腸桿菌密碼偏愛進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的角鯊烯環(huán)氧化酶基因序列為SEQ ID NO: 4，其編碼氨基酸序列為SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4由金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0049]設(shè)計基因片段兩邊酶切位點EcoRI，Sal I，分別利用引物F:5’ -CCGGAATTCTTAATACGACTCACTATAGGGG-3’ 和 R:5’ -CAAGTCGACTTACTTCGCACGCAGAGCTTGA-3’ 進行 PCR 擴增，PCR擴增條件:95°C，IOmin ；95°C，30S ；55°C, 30S, 30 個循環(huán)；72°C, 1.5min ；72°C, IOmin0
[0050]將PCR擴增產(chǎn)物與大腸桿菌表達質(zhì)粒pET28a( + )，經(jīng)EcoRI和Sal I雙酶切，37°C酶切過夜后，酶切產(chǎn)物瓊脂糖膠回收純化。以酶切PCR產(chǎn)物與酶切線性化質(zhì)粒pET28a ( + )摩爾濃度6:1的設(shè)計連接體系，加入Iul T4連接酶，22°C連接4h，將連接產(chǎn)物加入50ul大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42°C熱擊90s轉(zhuǎn)化。加入Iml LB培養(yǎng)基，37°C復壯Ih,收集菌體涂于卡 那霉素抗性篩選LB平板中，37°C培養(yǎng)過夜。隔日菌落PCR挑選陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)驗證序列正確后，將新質(zhì)粒命名為SE-pET28a ( + ),質(zhì)粒圖譜如圖5所示。
[0051]實施例4角鯊烯環(huán)氧化酶的誘導表達與產(chǎn)物測定
[0052]將陽性轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基中，37 °C，200rpm培養(yǎng)8h，收集菌體，提質(zhì)粒SE-pET28a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21 ;菌落PCR驗證正確后，將獲得的重組菌株命名為大腸桿菌BL21-SE。
[0053]將大腸桿菌BL21-SE接種至5ml含卡那霉素濃度為50ug/ml的LB液體培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)；將菌液按1% (v/v)比例轉(zhuǎn)接至上述新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C、220rpm培養(yǎng)2h ;加入IPTG至終濃度為luM，28°C誘導6h ;收集Iml菌夜，蒸餾水洗2次；超聲破碎，SDS-PAGE分析檢測大腸桿菌BL21-SE胞內(nèi)蛋白表達情況。結(jié)果如圖5所示，已知角鯊烯環(huán)氧化酶蛋白分子量為48kDa，圖6中BL21-SE胞內(nèi)蛋白所在泳道3與陰性對照泳道2相比，在45-50kDa之間有一條變濃的帶，即箭頭所指位置，從而說明角鯊烯環(huán)氧化酶在大腸桿菌BL21-SE胞內(nèi)得到表達。
[0054]為了進一步證明本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌BL21-SE重組表達的角鯊烯環(huán)氧化酶具有活性，將BL21-SE細胞破碎后直接用于酶反應(yīng)檢測，具體做法如下:離心收集剩余IL大腸桿菌 BL21-SE 菌體，加入 IOmL 緩沖液(20mM Tris-HCl，Trition X-1000.1%，ρΗ7.4)，超聲波破碎細胞，得細胞破碎液；具體酶活反應(yīng)體系為:細胞破碎液4ml，NADPH終濃度ImM，F(xiàn)AD終濃度ImM，TritionX-1OO終濃度0.5%，角鯊烯(squalene)終濃度15uM ;將上述反應(yīng)體系在25°C條件下處理30min，然后加入等體積的正己烷萃取，25°C、200rpm混合Ih ;室溫靜置20min，取上清液濃縮；將濃縮后的上清液進行質(zhì)譜檢測。結(jié)果如7-A、7-B所示，所述上清液在6.55min出現(xiàn)了與2，3環(huán)氧角鯊烯標準品分子量同為449的峰(箭頭所指處)，即為2，3-環(huán)氧角鯊烯加鈉離子后的分子量，同時圖7-C、7-D所示2，3-環(huán)氧角鯊烯標準品和上清液6.55min時的列峰圖中也都有449這個峰值(箭頭所指處)，說明上述反應(yīng)體系中有2，3-環(huán)氧角鯊烯產(chǎn)物生成，從而說明本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌BL21-SE能重組表達角鯊烯環(huán)氧化酶，且該酶具有有效的酶活，能夠催化角鯊烯生成2，3-環(huán)氧角鯊烯。
[0055]實施例5角鯊烯合成酶與角鯊烯環(huán)氧化酶共表達菌株的構(gòu)建與誘導表達
[0056]制備大腸桿菌E.coli BL21電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞；加入實施例1所述質(zhì)粒SQS-pACYCDuet-Ι和實施例3所述質(zhì)粒SE_pET28a ( + )各3ul，冰浴放置lOmin，轉(zhuǎn)入1_電轉(zhuǎn)杯，1.8kv,電擊轉(zhuǎn)化；加入Iml提前預(yù)冷的LB培養(yǎng)基,將電轉(zhuǎn)杯中的液體轉(zhuǎn)入無菌的
1.5ml離心管，37°C，220rpm復壯Ih ;涂布于氯霉素與卡那霉素雙抗性篩選的LB固體平板，37 °C過夜培養(yǎng)。隔日菌落PCR挑選陽性轉(zhuǎn)化子，序列分析正確后，將獲得的重組菌株命名為大腸桿菌BL21-SQS-SE。
[0057]將大腸桿菌BL21-SQS-SE接于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm過夜培養(yǎng)；將菌液按1% (v/v)比例轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基，37°C、220rpm培養(yǎng)2h ;添加IPTG至終濃度為luM，20°C過夜誘導；收集Iml菌夜，蒸餾水洗2次；超聲破碎；SDS_PAGE分析檢測大腸桿菌BL21-SQS-SE胞內(nèi)蛋白表達情況。pACYCDuet-1和pET28a ( + )是復制子不同的兩個可共存質(zhì)粒，其可分別誘導表達各自的蛋白，角鯊烯合成酶SQS和角鯊烯環(huán)氧化酶SE分子量大小相近，分別為45kD和48kD。電泳檢測結(jié)果如圖8所示，其中泳道I和2為陰性對照，泳道3和4泳道為大腸桿菌BL21-SQS-SE胞內(nèi)蛋白，在箭頭所指處即為重組表達的角鯊烯合成酶SQS和角鯊烯環(huán)氧化酶SE。
[0058]為了進一步證明本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌BL21-SQS-SE重組表達的角鯊烯合成酶和角鯊烯環(huán)氧化酶具有活性，能夠在胞內(nèi)催化合成2，3-環(huán)氧角鯊烯。取大腸桿菌發(fā)酵液1L，離心收集菌體，加入 IOmL 緩沖液(20mM Tris-HCl，Trition X-1000.1%，ρΗ7.4)，超聲波破碎細胞，得細胞破碎液；然后向細胞破碎液中加入等體積的正己烷萃取，25 °C、200rpm混合Ih ;室溫靜置20min，取上清液濃縮；將濃縮后的上清液進行質(zhì)譜檢測。結(jié)果顯示，所述上清液在6.55min出現(xiàn)了與2，3環(huán)氧角鯊烯標準品分子量同為449的峰，說明本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌BL21-SQS-SE胞內(nèi) 有2，3-環(huán)氧角鯊烯產(chǎn)物生成，從而說明本發(fā)明構(gòu)建的大腸桿菌BL21-SQS-SE重組表達的角鯊烯合成酶和角鯊烯環(huán)氧化酶具有有效的酶活，能夠在胞內(nèi)催化生成2，3-環(huán)氧角鯊烯。多個重組菌的表達產(chǎn)物分析結(jié)果也證明了本發(fā)明方法的可靠性。
【權(quán)利要求】
1.一種2，3-環(huán)氧角鯊烯的生物合成方法，其特征在于，所述的合成方法是同時在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達角S烯合成酶和角S烯環(huán)氧化酶,再將該大腸桿菌發(fā)酵來制備2，3-環(huán)氧角鯊烯。
2.如權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的角鯊烯合成酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
3.如權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于所述的角鯊烯環(huán)氧化酶，其氨基酸序列為 SEQ ID NO:3 ；。
4.權(quán)利要求1所述的合成方法，其具體步驟如下: 1)構(gòu)建含角鯊烯合成酶基因的表達載體； 2)構(gòu)建含角鯊烯環(huán)氧化酶基因的表達載體； 3)將I)和2)構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，獲得重組表達角鯊烯合成酶和鯊烯環(huán)氧化酶的工程菌； 4)發(fā)酵培養(yǎng)上述步驟3)得到的大腸桿菌工程菌，生產(chǎn)2，3-環(huán)氧角鯊烯。
5.如權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于所述的角鯊烯合成酶編碼基因包含有: Ca)包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列； (b)與SEQ ID N0:2 具有95%序列同一性的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于所述的角鯊烯環(huán)氧化酶編碼基因包含有: (a)包含SEQID N0:4所示的核苷酸序列； (b)與SEQID NO:4具有95%序列同一性的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于所述的步驟I)中的表達載體為質(zhì)粒pACYCDuet-1。
8.如權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于所述的步驟2)中的表達載體為質(zhì)粒pET28a(+)ο
9.一種生產(chǎn)2，3-環(huán)氧角鯊烯的大腸桿菌工程菌，其特征在于，所述的大腸桿菌工程菌攜帶有表達角鯊烯合成酶基因和角鯊烯環(huán)氧化酶基因的表達載體。
10.如權(quán)利要求9所述的大腸桿菌工程菌，為大腸桿菌BL21。
【文檔編號】C12N15/70GK103695493SQ201310724660
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】郭小飛, 黃亦鈞, 王華明 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司