一株蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus J2及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物【技術領域】，具體公開了一株蠟狀芽孢桿菌BacilluscereusJ2及其應用。所述蠟狀芽孢桿菌BacilluscereusJ2于2013年11月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCCNo.M2013556。該菌株的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明所述蠟狀芽孢桿菌J2能夠產(chǎn)生角蛋白酶，經(jīng)測定，該菌培養(yǎng)24小時后，角蛋白酶活性達16.9U/ml，因此可用于生產(chǎn)角蛋白酶，對角蛋白酶的研究和利用具有重要的價值。
【專利說明】—株錯狀芽孢桿菌公C/7/?/S cereus J2及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術領域】，具體涉及一株蠟狀芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002]在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，大型的養(yǎng)殖場越來越多。家禽養(yǎng)殖和加工過程中產(chǎn)生的大量羽毛等角蛋白廢棄物每年在全球范圍內(nèi)可至成百上千萬噸，我國也達幾十萬噸，這對環(huán)境造成了極大的污染，同時，研究人員發(fā)現(xiàn)，角蛋白富含有大量的蛋白質(zhì)和氨基酸，對其營養(yǎng)成分的研究表明:羽毛中含粗蛋白超過80 %，各種氨基酸總量超過70 %?？梢?，若加以恰當處理，羽毛等角蛋白廢棄物可達到生物轉化的目的。 [0003]組成家禽羽毛的角蛋白是一種纖維，不可溶性的結構蛋白，大部分以折疊成超螺旋結構，多肽鏈的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵高度緊密交叉聯(lián)結，因而機械穩(wěn)定性強，一般的蛋白水解酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都難以將其降解。
[0004]然而，在自然界中角蛋白并未有聚積的現(xiàn)象，這表明某些特殊的微生物在發(fā)揮降解角蛋白的作用，其原因就在于這些微生物能分泌一類酶，稱為角蛋白酶(keratinase,EC 3.4.21/24/99.11)，該類酶能夠特異性地分解角蛋白，使其降解為多肽和氨基酸。自1899年Ward報道了真菌馬爪甲團囊菌)能分解角蛋白以來，已先后發(fā)現(xiàn)30余種微生物具有降解角蛋白的能力，主要包括真菌、放線菌和細菌3類。其中，產(chǎn)生蛋白酶的細菌多來自芽孢桿菌，研究最為深入的是地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，個別菌株所產(chǎn)角蛋白酶已進行了商業(yè)化生產(chǎn)，如地衣芽孢桿菌PWD-1 {BadIIius IicheniforrmisPWD-1)純化后角蛋白酶活性很高，商品名稱為Versazyme?。
[0005]我國在羽毛角蛋白分解菌的培養(yǎng)和篩選方面的研究落后于國外，分離與篩選出的高效菌種并不多，且多是真菌與放線菌，因而篩選高產(chǎn)而且具較好穩(wěn)定性角蛋白酶新的菌群也是一個研究熱點。羽毛廢棄物經(jīng)過適當處理，使廢棄的羽毛角蛋白直接轉變成蛋白質(zhì)或復合氨基酸，從而變廢為寶，既能保護環(huán)境又資源利用，這也將具有十分顯著的經(jīng)濟效益和深遠的社會效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術中的上述不足，提供一株蠟狀芽孢桿菌。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供上述蠟狀芽孢桿菌的應用。
[0008]本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的:
一株蠟狀芽孢桿菌，分類命名為蠟狀芽孢桿菌cereus) J2，本發(fā)明中簡稱蠟狀芽孢桿菌J2，該菌于2013年11月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國湖北省武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC N0.M2013556。
[0009]所述蠟狀芽孢桿菌cereus J2是發(fā)明人從廣東溫氏食品集團有限公司養(yǎng)殖場采集的土樣中分離出來的。
[0010]菌株分離后經(jīng)菌落形態(tài)鑒定:該菌在平板上培養(yǎng)24h后的菌落呈白色，圓形，表面蠟質(zhì)不透明，邊緣波狀；革蘭氏染色為陽性，菌體桿狀，周生鞭毛，運動，無莢膜，芽孢周生，橢圓形。
[0011]該菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]經(jīng)生理生化測定，本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌J2的脲酶試驗為陰性，氧化酶、接觸酶試驗為陽性；能水解明膠、淀粉、吐溫80、七葉靈及卵黃卵磷脂；Π引哚試驗為陽性；甲基紅，V-P試驗為陽性；硝酸還原測定為陽性；苯丙氨酸測定為陰性；生長溫度范圍10~40 0C ；最適生長pH為5.7~6.8。
[0013]該菌株具有分解羽毛的功能，能夠產(chǎn)生角蛋白酶，經(jīng)測定，該菌培養(yǎng)24小時后，角蛋白酶活性達16.9U/ml,因此可用于生產(chǎn)角蛋白酶的工業(yè)生產(chǎn)中，對角蛋白酶的研究和利用具有重要價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1.蠟狀芽孢桿菌J2的透射電子顯微鏡照片(6000倍)。
[0015]圖2.蠟狀芽孢桿菌J2及部分相關菌株依據(jù)16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0016]圖3.蠟狀芽孢桿菌J2降解羽毛的效果圖，其中錐形瓶J2中為加入蠟狀芽孢桿菌J2的實驗組，錐形瓶CK為空白對照組。
【具體實施方式】
[0017]以下結合說明書附圖和具體實施例進一步解釋本發(fā)明，但不對本發(fā)明構成任何限定。以下實施例中除特殊說明外，均為本領域常規(guī)試劑和方法步驟。
[0018]實施例1蠟狀芽孢桿菌J2的分離
土樣取自廣東溫氏食品集團有限公司養(yǎng)殖場，混入雞羽毛，待羽毛分解后收集土樣，自然陰干，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019]取IOg上述土樣放入裝有90mL無菌水的三角瓶中(帶玻璃珠)，在180 rpm轉速下振蕩30分鐘，靜置10分鐘后，取上層液稀釋10倍后，依次制成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6 土壤稀釋液，取0.1mL均勻涂布在NA瓊脂培養(yǎng)基平板上，翻轉平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。對每個菌落形態(tài)不同的菌株做2個平行純化平板。挑取初篩單菌落于基礎鹽羽毛培養(yǎng)基中，置于30°C搖床，120rpm培養(yǎng)，以未接種的培養(yǎng)基作對照，觀察羽毛降解情況。
[0020]NA瓊脂培養(yǎng)基配方:蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化鈉5g，瓊脂20.0g，水1000ml ；pH 7.4±0.2。
[0021]基礎鹽羽毛培養(yǎng)基配方:磷酸氫二鈉0.3g，磷酸二氫鈉0.4g，氯化鈉0.5g，水1000ml, 0.1% 天然羽毛，pH 7.4±0.2。
[0022]經(jīng)過基礎鹽羽毛培養(yǎng)基的進一步培養(yǎng)，篩選出分解羽毛效率最高的菌株，經(jīng)過形態(tài)學及生理生化和DNA鑒定后，命名為cereus J2,簡稱蠟狀芽孢桿菌J2。
[0023]實施例2蠟狀芽孢桿菌J2的生物學性狀及生理生化和分子鑒定 S1.形態(tài)特征
蠟狀芽孢桿菌J2在電鏡下的形態(tài)見于圖1，該芽孢八疊球菌在平板上培養(yǎng)24h后的菌落呈菌落呈白色，圓形，表面蠟質(zhì)不透明，邊緣波狀；革蘭氏染色為陽性，菌體桿狀，周生鞭毛，運動，無莢膜，芽孢周生，橢圓形。[0024]S2.生理生化特征
經(jīng)生理生化測定，本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌J2的脲酶試驗為陰性，氧化酶、接觸酶試驗為陽性；能水解明膠、淀粉、吐溫80、七葉靈及卵黃卵磷脂；Π引哚試驗為陽性；甲基紅，V-P試驗為陽性；硝酸還原測定為陽性；苯丙氨酸測定為陰性；生長溫度范圍10~40°C;最適生長pH為5.7~6.8，結果見表1。
[0025]表1蠟狀芽孢桿菌J2生理生化特征
【權利要求】
1.一株蠟狀芽孢桿菌，分類命名為蠟狀芽孢桿菌(feci77m cer￡^s)J2，該菌株于2013年11月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0.M2013556。
2.根據(jù)權利要求1所蠟狀芽孢桿菌，其特征在于，所述菌株的菌落形態(tài)為:菌落呈白色，圓形，表面蠟質(zhì)不透明，邊緣波狀；革蘭氏染色為陽性，菌體桿狀，周生鞭毛，運動，無莢膜，芽孢周生，橢圓形。
3.根據(jù)權利要求1所蠟狀芽孢桿菌，其特征在于，該菌的16SrDNA核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
4.權利要求1至3任一項所述蠟狀芽孢桿菌在分解角蛋白中的應用。
5.權利要求1至3任一項所述蠟狀芽孢桿菌在生產(chǎn)角蛋白酶中的應用。
【文檔編號】C12R1/085GK103695354SQ201310716495
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權日:2013年12月23日
【發(fā)明者】姚青, 顧振紅, 劉曉迪, 朱紅惠, 謝小林 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學