一種空間環(huán)境下的蠟狀芽孢桿菌lct-bc235菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及空間環(huán)境下的蠟狀芽孢桿菌及其基因組序列。既往研究發(fā)現(xiàn)空間環(huán)境能夠影響微生物的許多特征，例如生長速率、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞代謝水平、生物被膜的產(chǎn)生、毒力和耐藥性的增加或者降低。本發(fā)明利用太空特殊環(huán)境，通過搭載神舟八號飛船將蠟狀芽孢桿菌送入太空，歷經(jīng)398小時(shí)、1100萬公里的飛行返回地面后進(jìn)行了表型相關(guān)實(shí)驗(yàn)，證明了空間環(huán)境下的菌株存在明顯的變化。隨后對其進(jìn)行了基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，旨在發(fā)現(xiàn)發(fā)生這些變化的潛在機(jī)制及其應(yīng)用。隨著對這些問題的深入研究，有利于我們發(fā)現(xiàn)和了解空間環(huán)境對細(xì)菌的影響致病性和耐藥性改變的機(jī)制，為保障航天員安全提供了理論基礎(chǔ)。
【專利說明】一種空間環(huán)境下的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種空間環(huán)境下的蠟狀芽孢桿菌生物特性、全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序和差異蛋白組學(xué)分析。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類空間探索活動(dòng)的日益頻繁，宇宙空間成為了人類活動(dòng)的一個(gè)重要領(lǐng)域。 微生物是自然環(huán)境中的一部分，其存在于空氣、水、土壤等生物圈的各個(gè)部分。因此，人類的空間活動(dòng)不可避免的將微生物也帶上了宇宙空間。盡管外層空間具有極端和復(fù)雜的環(huán)境， 這些微生物都能夠適應(yīng)這些諸如微重力、宇宙射線、溫度、壓力等的改變并表現(xiàn)出相應(yīng)的形態(tài)和生理學(xué)的變化。尤其是有研究發(fā)現(xiàn)在模擬微重力條件下培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌對小鼠感染的毒力會增強(qiáng)；肺炎鏈球菌等機(jī)會致病菌在模擬微重力條件下毒力增強(qiáng)。目前，在空間站中已檢測出包括肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙雷氏菌、 蠟狀芽孢桿菌和腸球菌等多種細(xì)菌。對這些細(xì)菌進(jìn)行深入研究有助于了解這些細(xì)菌的致病力和耐藥性的改變機(jī)制，為載人航天提供醫(yī)學(xué)保障基礎(chǔ)。
[0003]蠟樣芽胞桿菌是革蘭氏陽性桿菌，好氧或兼性厭氧并能夠形成孢子。蠟狀芽孢桿菌是一種條件致病菌，其能夠產(chǎn)生相關(guān)導(dǎo)致嘔吐的毒素和三種不同的腸毒素，引起嘔吐綜合征和腹瀉病造成食物中毒，是一種潛在的會導(dǎo)致宇航員急性胃腸道疾病的重要致病菌。 尤其是空間飛行時(shí)，航天員所攜帶的食物大多是由從地球出發(fā)前制作的罐頭食品，極容易受蠟狀芽孢桿菌污染。一旦宇航員感染此種疾病我們尚未有很好的認(rèn)識。因此，通過表型研究空間環(huán)境下的突變株，并利用基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組三大組學(xué)研究方法，全面研究該菌株對空間環(huán)境的適應(yīng)性變化，關(guān)注其致病性、耐藥性的變化，為預(yù)防感染性疾病的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種太空環(huán)境中的蠟狀芽孢桿菌菌株LCT-BC235。通過表型研究，全基因組測序，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)闡明該細(xì)菌對空間的變化機(jī)制。
[0005]本發(fā)明提供的菌株LCT-B`C25，其保藏號為CGMCC N0.6516。
[0006]所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235，其表型特征為:革蘭氏陽性桿菌，具有芽孢，菌體單個(gè)或者成雙排列；與地面對照株相比較，其耐藥性沒有發(fā)生明顯變化；其生長速率減慢；生化特征為硫酸四癸鈉反應(yīng)、四氮唑紫反應(yīng)陰性。
[0007]所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235進(jìn)行全基因組測序，得到其全基因組序列及注釋內(nèi)容。LCT-BC235的全基因組鳥槍法測得序列總長度為5，514，728bp，平均GC含量為35.32*%。其序列包含34個(gè)contigs,能夠組裝成為5個(gè)scaffolds。用Glimmer version3.02軟件預(yù)測出5，263個(gè)編碼基因。對該菌株的序列進(jìn)行SNP分析發(fā)現(xiàn)，蠟狀芽孢桿菌 LCT-BC235 有三個(gè) SNP。分別是 UW1GL000001，UW1GL002432, UW1GL005263。然而，其中兩個(gè)為基因間區(qū)SNP，一個(gè)為同義SNP。此同義SNP是一個(gè)保守的假定蛋白。[0008]所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235，通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定獲得差異表達(dá)基因。結(jié)果有624個(gè)上調(diào)基因和813個(gè)下調(diào)基因。對這些基因進(jìn)行GO功能富集分析顯示，具有明顯差異表達(dá)的基因的生物學(xué)功能主要與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)(P = 0.04239)。對這些基因進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)基因主要與與磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、氧化磷酸化過程的 pathway 有關(guān)。
[0009]所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235，利用蛋白組學(xué)鑒定獲得差異表達(dá)蛋白分子。結(jié)果得到8個(gè)上調(diào)表達(dá)的蛋白和73個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白。對這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能富集分析和pathway富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要是與糖類代謝脂類代謝和氨基酸代謝相關(guān)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235革蘭氏染色
[0011]圖2蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235進(jìn)化分析
[0012]圖3蠟狀芽孢桿菌空間菌株LCT-BC235的biolog生化特征
[0013]圖4蠟狀芽孢桿菌空間誘變株LCT-BC235與地面對照株LCT-BC244的生長曲線比較
[0014]圖5蠟狀芽孢桿菌空間誘變菌株LCT-BC235的轉(zhuǎn)錄組基因覆蓋度
[0015]圖6蠟狀芽孢桿菌空間誘變菌株LCT-BC235的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因
[0016]圖7蠟狀芽孢桿菌空間誘變菌株LCT-BC235的蛋白組差異表達(dá)蛋白
【具體實(shí)施方式】
[0017]下述實(shí)施實(shí)例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018]下述實(shí)施實(shí)例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0019]本項(xiàng)目研究人員采用自制的樣本管搭載細(xì)菌，依據(jù):HYK_GF15《航天員系統(tǒng)載人運(yùn)輸飛船/目標(biāo)飛行器艙載產(chǎn)品環(huán)境試驗(yàn)技術(shù)條件》，該樣本管通過了沖擊、快速減壓、震動(dòng)實(shí)驗(yàn)。褪色沙雷菌接種至樣本管中，培養(yǎng)基為LB瓊脂半固體培養(yǎng)基。然后封裝入代號為 20111001的樣品包(材料為藍(lán)色美塔斯阻燃布料)。經(jīng)過神舟八號搭載，獲得太空環(huán)境下的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235菌株。
[0020]具體實(shí)施實(shí)例一、LCT-BC235的表型研究:
[0021](I).菌種選擇:蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235，保藏號為CGMCCN0.6528
[0022](2).形態(tài)學(xué):原樣品進(jìn)行稀釋涂布，進(jìn)行革蘭氏染色。LCT-BC235為革蘭氏陽性桿菌，具有芽孢，菌體單個(gè)或者成雙排列，如圖1。
[0023](3) ? LCT-BC235菌株16s rDNA鑒定及進(jìn)化分析
[0024]16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長約1.5kb。將已分純的單菌直接經(jīng)菌液PCR 擴(kuò)增16S rDNA，部分通過菌液PCR較難 擴(kuò)增的單菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組后擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物序列如下:
[0025]SgF:AGAGTTTGATCATGGCTCAG
[0026]SgR: TAGGGTTACCTTGTTACGACTT
[0027]16S rDNA PCR產(chǎn)物用96孔mi I Ipore純化系統(tǒng)純化后準(zhǔn)確定量，經(jīng)AB13730xl全自動(dòng)序列分析儀測序，測序結(jié)果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測序結(jié)果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp(雙向測序)即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxonserver2.1數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對,確定菌株大致的分類地位。所有單菌16S序列全部導(dǎo)入seqman,輸出single file (fasta)后，經(jīng)Mega5.0軟件clusterW 多重比對，輸出meg文件重新導(dǎo)入構(gòu)建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method為bootstrap參數(shù)設(shè)置為1000。16s rDNA鑒定結(jié)果顯示LCT-BC235屬于蠟狀芽孢菌。對其進(jìn)行進(jìn)化分析如圖2所示。
[0028](4).耐藥性檢測:配制菌懸液后稀釋涂布，粘貼藥敏片，選擇的抗生素為青霉素 G、氨芐青霉素、頭孢唑林、復(fù)達(dá)欣(頭孢他啶)(頭孢噻甲羧肟)、菌必治(頭孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、環(huán)丙沙星(奔克)(悉復(fù)歡)(丙氟哌酸)、潔霉素(林可霉素)、萬古霉素、 復(fù)方新諾明、氯霉素、舒普深(先鋒必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、鏈霉素、美滿霉素 (二甲胺四環(huán)素)(米諾環(huán)素)、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。培養(yǎng)24h后觀察抑菌圈大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與地面對照株相比較，蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235的耐藥性沒有發(fā)生明顯變化。
[0029](5).溶血試驗(yàn):采用點(diǎn)種法，將太空株和地面株點(diǎn)種于同一血瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果顯示LCT-BC235無溶血圈出現(xiàn)。
[0030](6).生化代謝(Biolog)實(shí)驗(yàn):制備菌懸液，接種至Biolog96孔板，37°C培養(yǎng) 24-48h觀察結(jié)果(見圖3)。該菌株生化代謝較地面株差別較大如表1。
[0031]表1蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235的biolog生化特征
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種空間環(huán)境下的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235，其保藏號為:CGMCCN0.6516。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235，其表型特征為:革蘭氏陽性桿菌， 具有芽孢，菌體單個(gè)或者成雙排列；與地面對照株相比較，其耐藥性沒有發(fā)生明顯變化；該菌的生長速率減慢；生化特征為硫酸四癸鈉反應(yīng)、四氮唑紫反應(yīng)陰性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235進(jìn)行全基因組測序，得到其全基因組序列及注釋內(nèi)容。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235，通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定獲得差異表達(dá)基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢`桿菌LCT-BC235，利用蛋白組學(xué)鑒定獲得差異表達(dá)蛋白分子。
【文檔編號】C12N1/20GK103555602SQ201210380072
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月26日
【發(fā)明者】劉長庭, 蘇龍翔, 方向群, 王俊峰, 李天志, 郭英華, 常德, 王雅娟, 陳振鴻, 姜學(xué)革 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院