蠟狀芽孢桿菌zjb-11071及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ZJB-11071及其在生物催化合成環(huán)氧氯丙烷及手性藥物中間體中的應用，所述菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國·武漢·武漢大學，430072，保藏編號CCTCC No：M 2013314，保藏日期2013年7月5日；蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071對1,3-二氯-2-丙醇轉化率達到42.3％，對2,3-二氯-2-丙醇轉化率達到21.1％，對1,3-二溴-2-丙醇轉化率達到95％，對S(-)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯轉化率達到24.6％。
CCTCC No：M 2013314
2013.07.05
【專利說明】蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071及其應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株產脫鹵酶的菌株-錯狀芽孢桿菌（Bacillus cereus) ZJB-11071，及其在生物催化合成環(huán)氧化物和手性藥物中間體中的應用。 (二）

【背景技術】
[0002] 1948年Η印pel等首先描述了由微生物產生的能使二氯甲烷水解成甲醛的脫鹵 酶，此后不同類型的脫鹵酶被相繼發(fā)現(xiàn)。I960年Janssen把能從鹵族有機化合物上使鹵 族離子釋放出來的酶統(tǒng)稱作脫鹵酶（Dehalogenase)。從1968年Castro等首次發(fā)現(xiàn)以 2,3-二溴丙醇作為唯一碳源而生存的黃桿菌$13￥(^3丨61'；[111]18口.）菌株至今，人們相繼 篩選到多種可以降解鹵代醇的微生物。其中包括從淡水沉淀物中分離的放射形土壤桿菌 (Agrobacterium radiobacter)ADl和節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.)AD2 以及從土壤中獲得的 棒狀桿菌（Corynebacterium sp. )N-1074等。雖然它們降解有機齒化物的途徑雖然存在明 顯差異，但是鹵代醇脫鹵酶作為關鍵酶之一，催化碳鹵鍵的斷裂存在于所有的代謝途徑中。 (三）


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠產生鹵醇脫鹵酶的菌株一一蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus) ZJB-11071，及其在生物催化合成環(huán)氧化物和手性藥物中間體中的應 用。
[0004] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0005] 蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus)ZJB-11071，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址：中國.武漢.武漢大學，430072,保藏編號CCTCC N〇:M2013314,保藏日期2013年7 月5日。該菌株由浙江工業(yè)大學生物工程研究所從土壤中分離獲得，經檢測具有催化合成 環(huán)氧化物和手性藥物中間體（R(-)4-氰基-3-羥基丁酸乙酯）的性能。
[0006] 本發(fā)明還涉及所述的蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071在微生物催化鹵代醇制備環(huán)氧化 物中的應用，所述的應用為：以蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071經發(fā)酵培養(yǎng)后的濕菌體為催化劑， 以鹵代醇為底物，于pH值為7. 0?7. 5的緩沖液中，在35°C、150rpm條件下進行轉化反應， 轉化反應結束后，將轉化反應液用乙酸乙酯萃取，離心，取上層有機相即為含有環(huán)氧化物的 混合液，將混合液分離純化，獲得所述環(huán)氧化物。
[0007] 所述催化劑的用量以濕菌體質量計，終濃度為30?80g/L，優(yōu)選50g/L，所述底物 的初始濃度為20?50mmol/L。
[0008] 所述鹵代醇為1，3-二氯-2-丙醇、2, 3-二氯-2-丙醇或1，3-二溴-2-丙醇。
[0009] 本發(fā)明還涉及所述的蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071在生物催化合成手性藥物中間體 中的應用，所述的應用為：以蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071經發(fā)酵培養(yǎng)后的濕菌體為催化劑，以 S (_)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，于pH值為7. 0?7. 5的緩沖液中，在35°C下進行轉 化反應，轉化反應結束后，將轉化反應液用乙酸乙酯萃取，離心，取上層有機相，將混合液分 離純化，獲得R(_) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯；所述催化劑的用量以濕菌體質量計，終濃度 為50g/L，所述底物的初始濃度為20?50mmol/L。
[0010] 本發(fā)明所述濕菌體按如下方法制備：
[0011] (1)斜面培養(yǎng)
[0012] 將蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071接種至斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)12h，獲得斜面菌體；
[0013] 所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCllO. Og/L，酵母粉5. Og/L，蛋白胨10. Og/L，瓊 脂20. Og/L，溶劑為水，pH值為7. 0 ;
[0014] ⑵種子培養(yǎng)
[0015] 從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)24h，獲得種子液； 所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCllO. 0g/L，酵母粉5. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，溶劑為水， pH值為7.0 ;
[0016] ⑶發(fā)酵培養(yǎng)
[0017] 將種子液以體積濃度1%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，150rpm振蕩培養(yǎng) 60h后，在12000g下離心5min，收集濕菌體；
[0018] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HP0 43. 2g/ L, K2HP041. 5g/L, Na2EDTA0. 06g/L, MnS040. 002g/L, MgS040. OOlg/L, ZnS040. 002g/L, FeS040 . 01g/L，溶劑為水，pH 值為 6. 8。
[0019] 通常的，保存的菌株從冰箱中取出后進行下一步操作前，需要進行活化培養(yǎng)，按照 常規(guī)方法即可，通常選擇LB培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時間2天。
[0020] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一株新菌株一蠟狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus)ZJB-l 1071，及其在生物催化環(huán)氧化物和手性藥物中間體中的應用，錯 狀芽孢桿菌ZJB-11071對1，3-二氯-2-丙醇轉化率達到42. 3%，對2, 3-二氯-2-丙醇轉 化率達到21. 1 %，對1，3-二溴-2-丙醇轉化率達到95%，對S (-) -4-氯-3-羥基丁酸乙酯 轉化率達到24. 6 %，具有重要應用前景。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0021] 圖1為1，3-DCP和ECH的氣相色譜圖。 (五）

【具體實施方式】：
[0022] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0023] 實施例1 :錯狀芽孢桿菌ZJB-11071的篩選
[0024] 本發(fā)明從全國各地取土樣，共取土樣80份。篩選的具體方法：稱取lg 土樣置于 50mL富集培養(yǎng)基中，于30°C，150r/min振蕩培養(yǎng)2-3天。取lmL富集液加入50mL新鮮富集 培養(yǎng)基中，如此重復3次后進行分離純化。
[0025] 選用溴百里香酚藍作為指示劑檢測能夠降解底物的菌落。其原理為：含氯有機物 降解的同時會釋放質子，從而使培養(yǎng)基局部的pH值發(fā)生改變。指示劑溴百里香酚藍變色范 圍為5. 8-7. 6 (黃-藍），因此能利用含氯有機物的菌落周圍呈現(xiàn)黃色，而不能利用的則菌落 周圍平板顏色仍為青綠色。
[0026] 將富集液用無菌水逐級稀釋10個梯度，選取10' 10' 10' 10' 1(Γ1(Ι五個梯度的 稀釋液各取0. lmL均勻涂布在平板篩選培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)48h。挑取指示平板上黃色 單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，放入30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),長至菌落直徑大小為3-4mm 左右時，于4 C保減。
[0027] 將保存于斜面上的菌株接種至種子培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)24h。將種子液以體 積濃度1%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，150rpm振蕩培養(yǎng)60h。在12000g下離心 5min，收集濕菌體，加入一定體積的磷酸緩沖液（50mM，pH7. 0)制成0. 5g/mL菌懸液用于轉 化。轉化條件如下：磷酸鹽緩沖液（50mM，pH7. 0) 10ml中加入0. 5g/mL菌懸液（菌懸液的用 量以濕菌體質量計為50g/L反應體系）10ml，1，3-DCPO. 03mol (終濃度30mM)，置于30°C水 浴搖床轉化24h，取lmL轉化液，乙酸乙酯萃取后氣相檢測分析。最終得到一株催化活力較 高的野生菌株，并將此菌株命名為菌株ZJB-11071。
[0028] 氣相分析條件為：采用的氣相色譜儀為美國安捷倫Agilent-7890型，配備FID檢 測器。色譜分析條件：色譜柱為HP-5毛細管柱；柱溫為80°C保持4minlO°C /min升溫至 l〇〇°C ;前進樣口溫度為230°C ;檢測器FID溫度為250°C ;載氣（N2)流速為54. OmL/min。在 該條件下，標樣出峰情況如圖1所示，1，3-DCP和ECH的出峰時間分別為5. lmin和3. 7min。
[0029] 所述富集培養(yǎng)基終濃度組成為（g/L) :Na2HP045. 37, ΚΗ2Ρ041· 36,（NH4)2S041. 25， Na2EDTA0. 06, MnS040 . 00 2, MgS040 . 001，ZnS040. 002, FeS040. 01，溶劑為水，pH 值為 6· 8。
[0030] 所述平板篩選培養(yǎng)基為（g/L) :Κ2ΗΡ045· 37,（NH4)2S041. 25, ΚΗ2Ρ041· 36,酵母抽提 物0.2,瓊脂20,溶劑為水，pH值為6.8。121°C20min滅菌。冷卻至50-60°C時加入溴百里 香酚藍0. 06g，1，3-DCP2mL，利用NaOH調至青綠色后倒平板。
[0031] 所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為（g/L) :NaC110.0,酵母粉5.0,蛋白胨10.0,瓊脂 20. 0,溶劑為水，pH值為7.0。
[0032] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為（g/L):乳糖8,蛋白胨6, Na2HP043. 2, K2HP041. 5， Na2EDTA0. 06, MnS040 . 00 2, MgS040 . 001，ZnS040. 002, FeS040. 01，溶劑為水，pH 值為 6· 8。
[0033] 實施例2 :菌株ZJB-11071的鑒定
[0034] 本發(fā)明實施例1篩選得到的菌株ZJB-11071在斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24小時 后形成圓形或近圓形，質地軟，表面較粗糙，扁平，邊緣不規(guī)則，有光澤的乳白色菌落，直徑 5-7_。革蘭氏染色觀察：紫色短桿狀。產芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，孢囊無明 顯膨大。
[0035] 通過Biolog(GENIII)自動微生物檢定系統(tǒng)對菌株ZJB-11071進行了 94種表型 測試，包括71種碳源利用情況以及23種化學敏感性檢測。經Biolog讀數(shù)儀分析菌株的 代謝指紋，結果表明菌株ZJB-11071能與22種化學物質發(fā)生靈敏反應，對40種碳源的利 用率較大，而對其他31種的碳源的利用較低或者完全不能利用。Biolog系統(tǒng)給出36h鑒 定結果，如表1和表2所示，確定菌株ZJB-11071為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)。 同時以菌株ZJB-11071的總DNA為模板，利用引物：P1:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 P2:5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'擴增菌株的16S rDNA基因，將基因產物同T載體連接后， 委托上海生工對該菌16S rDNA擴增及測序，得到該菌株的16S rDNA序列后，在NCBI網站上 用BLAST檢索GenBank中相關菌株的16S rDNA基因序列，并進行同源性比對?；谛螒B(tài)、 生理生化特征和16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育學分析等方面的鑒定，最終確定該菌為蠟狀芽孢 桿菌，命名為錯狀芽抱桿菌（Bacillus cereus)ZJB-11071。
[0036] 表1菌株對Biolog GEN III板上71種碳源的利用能力
[0037] TablelUtilization of71carbon-substrates by the strain using Biolog GEN III microplate
[0038]

【權利要求】
1. 蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus)ZJB-11071，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地 址：中國?武漢?武漢大學，430072,保藏編號CCTCC No :M2013314,保藏日期2013年7月 5曰。
2. 如權利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071在生物催化鹵代醇生成環(huán)氧化物中 的應用，其特征在于所述的應用為：以蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071經發(fā)酵培養(yǎng)后的濕菌體為 催化劑，以鹵代醇為底物，于pH值為7. 0?7. 5的緩沖液中，在35°C下進行轉化反應，轉化 反應結束后，將轉化反應液用乙酸乙酯萃取，離心，取上層有機相即為含有環(huán)氧化物的混合 液，將混合液分離純化，獲得所述環(huán)氧化物。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述催化劑的用量以濕菌體質量計，終濃度 為30?80g/L，所述底物的初始濃度為20?50mmol/L。
4. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述鹵代醇為1，3-二氯-2-丙醇、2, 3-二 氯-2-丙醇或1，3-二溴-2-丙醇。
5. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述濕菌體按如下方法制備： (1) 斜面培養(yǎng) 將蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071接種至斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)12h，獲得斜面菌體； 所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCllO. Og/L，酵母粉5. Og/L，蛋白胨10. Og/L，瓊脂 20. 0g/L，溶劑為水，pH值為7. 0 ; (2) 種子培養(yǎng) 從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)24h，獲得種子液；所述 種子培養(yǎng)基終濃度組成為：NaC110.0g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，溶劑為水，pH值 為 7.0 ; (3) 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以體積濃度1 %的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，150rpm振蕩培養(yǎng)60h 后，在12000g下離心5min，收集濕菌體； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HP043. 2g/L，K2HP04l. 5g/L， Na2EDTA0. 06g/L，MnS040. 002g/L，MgS040. 001g/L，ZnS040. 002g/L，F(xiàn)eS040 . 01g/L，溶劑為水， pH值為6.8。
6. 如權利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071在生物催化合成手性藥物中間體中的 應用，其特征在于所述的應用為：以蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071經發(fā)酵培養(yǎng)后的濕菌體為催 化劑，以S (-)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯為底物，于pH值為7. 0?7. 5的緩沖液中，在35°C下 進行轉化反應，轉化反應結束后，將轉化反應液用乙酸乙酯萃取，離心，取上層有機相，將混 合液分離純化，獲得R(_) -4-氰基-3-羥基丁酸乙酯。
7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于所述催化劑的用量以濕菌體質量計，終濃度 為30?80g/L，所述底物的初始濃度為20?50mmol/L。
8. 如權利要求6所述的應用，其特征在于所述濕菌體按如下方法制備： (1)斜面培養(yǎng) 將蠟狀芽孢桿菌ZJB-11071接種至斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)12h，獲得斜面菌體； 所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCllO. 0g/L，酵母粉5. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，瓊脂 20. 0g/L，溶劑為水，pH值為7. 0 ; (2) 種子培養(yǎng) 從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)24h，獲得種子液；所述 種子培養(yǎng)基終濃度組成為：NaCllO. Og/L，酵母粉5. Og/L，蛋白胨10. Og/L，溶劑為水，pH值 為 7.0 ; (3) 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以體積濃度1 %的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，150rpm振蕩培養(yǎng)60h 后，在12000g下離心5min，收集濕菌體； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：乳糖8g/L，蛋白胨6g/L，Na2HP043. 2g/L，K2HP04l. 5g/L， Na2EDTA0. 06g/L，MnS040. 002g/L，MgS040. 001g/L，ZnS040. 002g/L，F(xiàn)eS040 . 01g/L，溶劑為水， pH值為6.8。
【文檔編號】C12N1/20GK104232508SQ201410359149
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權日:2014年7月25日
【發(fā)明者】柳志強, 鄭裕國, 高愛存, 薛亞平, 薛峰, 萬南微 申請人:浙江工業(yè)大學