一株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 3-2及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開(kāi)了一株枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis?3-2及其應(yīng)用。所述枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis?3-2于2013年11月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號(hào)為CCTCC?No.M2013555。該菌株的16SrDNA核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis?3-2能夠產(chǎn)生角蛋白酶，經(jīng)測(cè)定，該菌培養(yǎng)3天后，角蛋白酶活性達(dá)46.43U/ml，因此可用于生產(chǎn)角蛋白酶，對(duì)角蛋白酶的研究和利用具有重要的價(jià)值。
【專利說(shuō)明】—株枯草芽孢桿菌Baci I I us subti I is 3-2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一株枯草芽孢桿菌feci/AAs.subti I is3-2及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，大型的養(yǎng)殖場(chǎng)越來(lái)越多。家禽養(yǎng)殖和加工過(guò)程中產(chǎn)生的大量羽毛等角蛋白廢棄物每年在全球范圍內(nèi)可至成百上千萬(wàn)噸，我國(guó)也達(dá)幾十萬(wàn)噸，這對(duì)環(huán)境造成了極大的污染，同時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)，角蛋白富含有大量的蛋白質(zhì)和氨基酸，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分的研究表明:羽毛中含粗蛋白超過(guò)80 %，各種氨基酸總量超過(guò)70 %?？梢?jiàn)，若加以恰當(dāng)處理，羽毛等角蛋白廢棄物可達(dá)到生物轉(zhuǎn)化的目的。
[0003]組成家禽羽毛的角蛋白是一種纖維，不可溶性的結(jié)構(gòu)蛋白，大部分以折疊成超螺旋結(jié)構(gòu)，多肽鏈的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵高度緊密交叉聯(lián)結(jié)，因而機(jī)械穩(wěn)定性強(qiáng)，一般的蛋白水解酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都難以將其降解。
[0004]然而，在自然界中角蛋白并未有聚積的現(xiàn)象，這表明某些特殊的微生物在發(fā)揮降解角蛋白的作用，其原因就在于這些微生物能分泌一類酶，稱為角蛋白酶(keratinase,EC 3.4.21/24/99.11)，該類酶能夠特異性地分解角蛋白，使其降解為多肽和氨基酸。自1899年Ward報(bào)道了真菌馬爪甲團(tuán)囊菌)能分解角蛋白以來(lái)，已先后發(fā)現(xiàn)30余種微生物具有降解角蛋白的能力，主要包括真菌、放線菌和細(xì)菌3類。其中，產(chǎn)生蛋白酶的細(xì)菌多來(lái)自芽孢桿菌，研究最為深入的是地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，個(gè)別菌株所產(chǎn)角蛋白酶已進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)，如地衣芽孢桿菌PWD-1 {BadIIius IicheniforrmisPWD-1)純化后角蛋白酶活性很高，商品名稱為Versazyme?。
[0005]我國(guó)在羽毛角蛋白分解菌的培養(yǎng)和篩選方面的研究落后于國(guó)外，分離與篩選出的高效菌種并不多，且多是真菌與放線菌，因而篩選高產(chǎn)而且具較好穩(wěn)定性角蛋白酶新的菌群也是一個(gè)研究熱點(diǎn)。羽毛廢棄物經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理，使廢棄的羽毛角蛋白直接轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)或復(fù)合氨基酸，從而變廢為寶，既能保護(hù)環(huán)境又資源利用，這也將具有十分顯著的經(jīng)濟(jì)效益和深遠(yuǎn)的社會(huì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種枯草芽孢桿菌。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供上述枯草芽孢桿菌的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:
一株枯草芽孢桿菌，分類命名為枯草芽孢桿菌^Bacillus3-2，本發(fā)明中簡(jiǎn)
稱枯草芽孢桿菌3-2，該菌于2013年11月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013555。
[0009]所述枯草芽孢桿菌subtil is 3_2是發(fā)明人從廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)采集的土樣中分離出來(lái)的。[0010]菌株分離后經(jīng)菌落形態(tài)鑒定:該菌在平板上培養(yǎng)24h后的菌落呈白色，圓形，表面光滑不透明，邊緣整齊；革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體桿狀，具有端生纖毛，運(yùn)動(dòng)，無(wú)莢膜，芽孢周生，橢圓形。
[0011]該菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]經(jīng)生理生化測(cè)定，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌3-2的脲酶試驗(yàn)為陰性，接觸酶試驗(yàn)為陰性；能水解明膠、淀粉，對(duì)吐溫80不具水解性；硝酸還原測(cè)定為陽(yáng)性，苯丙氨酸測(cè)定為陰性。生長(zhǎng)最適溫度范圍28~30 °C。
[0013]該菌株具有分解羽毛的功能，能夠產(chǎn)生角蛋白酶，經(jīng)測(cè)定，該菌培養(yǎng)3天后，角蛋白酶活性達(dá)46.43U/ml，因此可用于生產(chǎn)角蛋白酶的工業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)角蛋白酶的研究和利用具有重要價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1.枯草芽孢桿菌3-2的透射電子顯微鏡照片(6000倍)。
[0015]圖2.枯草芽孢桿菌3-2及部分相關(guān)菌株依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0016]圖3.枯草芽孢桿菌3-2降解羽毛的效果圖，其中錐形瓶3-2為加入枯草芽孢桿菌3-2的實(shí)驗(yàn)組，錐形瓶CK為空白對(duì)照組。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限定。以下實(shí)施例中除特殊說(shuō)明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑和方法步驟。
[0018]實(shí)施例1枯草芽孢桿菌3-2的分離` 土樣取自廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)，混入雞羽毛，待羽毛分解后收集土樣，自然陰干，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0019]取IOg上述土樣放入裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中(帶玻璃珠)，在180 rpm轉(zhuǎn)速下振蕩30分鐘，靜置10分鐘后，取上層液稀釋10倍后，依次制成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6 土壤稀釋液，取0.1mL均勻涂布在NA瓊脂培養(yǎng)基平板上，翻轉(zhuǎn)平板置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。對(duì)每個(gè)菌落形態(tài)不同的菌株做2個(gè)平行純化平板。挑取初篩單菌落于基礎(chǔ)鹽羽毛培養(yǎng)基中，置于30°C搖床，120rpm培養(yǎng)，以未接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，觀察羽毛降解情況。
[0020]NA瓊脂培養(yǎng)基配方:蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化鈉5g，瓊脂20.0g，水1000ml ；pH 7.4±0.2。
[0021]基礎(chǔ)鹽羽毛培養(yǎng)基配方:磷酸氫二鈉0.3g，磷酸二氫鈉0.4g，氯化鈉0.5g，水1000ml, 0.1% 天然羽毛，pH 7.4±0.2。
[0022]經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)鹽羽毛培養(yǎng)基的進(jìn)一步培養(yǎng)，篩選出分解羽毛效率最高的菌株，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)及生理生化和DNA鑒定后，命名枯草芽孢桿菌3-2。
[0023]實(shí)施例2枯草芽孢桿菌3-2的生物學(xué)性狀及生理生化和分子鑒定 S1.形態(tài)特征
枯草芽孢桿菌3-2在電鏡下的形態(tài)見(jiàn)于圖1,該枯草芽孢桿菌在平板上培養(yǎng)24h后的菌落呈淡黃色，圓形，表面光滑半透明，邊緣整齊；革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體桿狀，具有周身纖毛，運(yùn)動(dòng)，無(wú)莢膜，芽孢端生，橢圓形。[0024]S2.生理生化特征:經(jīng)生理生化測(cè)定，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的脲酶試驗(yàn)為陰性，接觸酶試驗(yàn)為陰性；能水解明膠、淀粉，對(duì)吐溫80不具水解性；硝酸還原測(cè)定為陽(yáng)性，苯丙氨酸測(cè)定為陰性。生長(zhǎng)最適溫度范圍28~30°C，如表1所示。
[0025]表1枯草芽孢桿菌3-2的生理生化特性
【權(quán)利要求】
1.一株枯草芽孢桿菌，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 3_2，該菌于3013年11月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013555。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株的菌落形態(tài)為:菌落呈白色，圓形，表面光滑不透明，邊緣整齊；革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體桿狀，具有端生纖毛，運(yùn)動(dòng)，無(wú)莢膜，芽孢周生，橢圓形。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌，其特征在于該菌的16SrDNA核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述枯草芽孢桿菌在分解角蛋白中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)`所述枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)角蛋白酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103667155SQ201310716496
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】姚青, 顧振紅, 劉曉迪, 朱紅惠, 謝小林 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)