一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶，該酶活性為8000-10000U/ml，是出發(fā)菌株的2.5倍；比現(xiàn)有的β-葡聚糖酶酶活力高，酶適應(yīng)溫度和pH值范圍寬泛，熱穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性均較高，特別適合工業(yè)化需求。最適作用溫度為65℃，最適反應(yīng)pH值5.0。本發(fā)明中的β-葡聚糖酶由地衣芽孢桿菌制得，所述地衣芽孢桿菌（Βacillus?licheniformis）β-10-25保藏于保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC?NO:M2013538。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種熱穩(wěn)定性好的β -葡聚糖酶。
【背景技術(shù)】
[0002]葡聚糖酶是高效、專(zhuān)一分解葡聚糖的主要酶，在啤酒和飼料的生產(chǎn)中經(jīng)常使用。在飼料工業(yè)中它能水解β_葡聚糖中的1-3或1-4糖苷鍵，使之降解為低分子糖，降解后的β_葡聚糖失去親水性和粘性，不會(huì)在畜禽腸道中膨脹粘連，使得食糜的消化率以及飼料的能量利用率均得到提高。β -葡聚糖酶應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)中，可以轉(zhuǎn)移分解粘度很高的各種大麥β_葡聚糖，疏松大麥胚乳細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物的外溢，提高原料利用率，降低麥芽汁粘度，從而使啤酒產(chǎn)量增加，品質(zhì)得以提升。
[0003]β_葡聚糖是一種天然多糖，通常存在于特殊種類(lèi)的細(xì)菌、酵母菌及真菌的細(xì)胞壁，或者高等植物種子的包被中。β-葡聚糖是構(gòu)成禾本植物細(xì)胞壁的一種結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，在大麥、黑麥、高粱、大米及小米的胚乳細(xì)胞壁中含量尤其高。與一般糖類(lèi)主要以α-1，4_糖苷鍵結(jié)合而成為線形分子不同的是，植物細(xì)胞壁中的β_葡聚糖是以混合的β- (1，3)，(1，4)糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物，因此葡聚糖可以以很大的分子量溶解于水中，從而具有粘度大、親水性高、吸水膨脹力和持水性高的性質(zhì)。當(dāng)以大麥作為啤酒生產(chǎn)原料時(shí)，上述性質(zhì)便會(huì)影響麥芽汁的過(guò)濾速度，降低固形物的浸出率，還會(huì)因凝膠沉淀作用而降低啤酒的品質(zhì)；同時(shí)當(dāng)含有β_葡聚糖的作物用作飼料時(shí)，會(huì)增加非反芻禽畜的腸液粘度，成為飼料的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，降低飼料的利用率。
[0004]目前，美國(guó)、日本、丹麥、德國(guó)、澳大利亞、加拿大等國(guó)均已采用葡聚糖酶作為啤酒和飼料工業(yè)的主要酶制劑，而其在醫(yī)藥、紡織、廢水處理和日用化工、生物防治等其他方面的應(yīng)用價(jià)值也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，前景十分廣闊。但是熱穩(wěn)定性差和酶活力低已經(jīng)成為影響其應(yīng)用效果的制約因素。
`[0005]中國(guó)專(zhuān)利CN103013873A公開(kāi)了一株產(chǎn)熱穩(wěn)定性β -葡聚糖酶的菌株，該發(fā)明首次提供了一株來(lái)源于溫泉的能夠生產(chǎn)β -1, 3-1，4-葡聚糖酶的高地芽孢桿菌，并克隆得到了該酶的基因，該酶在60°C條件下保存Ih后仍能保持90%的酶活力。
[0006]中國(guó)專(zhuān)利CN102719416A提供了一種提高β _1，3_1，4_葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法，通過(guò)HNO2對(duì)β -1, 3-1，4-葡聚糖酶進(jìn)行化學(xué)修飾，所得的β -1, 3-1，4-葡聚糖酶T5tl值和t(1/2,60D 分別提高了 4.76%和62.1%。
[0007]之前，市場(chǎng)上高品質(zhì)的β -葡聚糖酶幾乎被國(guó)外的酶制劑生產(chǎn)公司所壟斷，雖然近幾年我國(guó)所報(bào)道的微生物產(chǎn)葡聚糖酶的酶活力已達(dá)到甚至超過(guò)了國(guó)際水平，但是能夠獲得兼具高活性及熱穩(wěn)定性的β_葡聚糖酶及其生產(chǎn)菌株仍然是目前工業(yè)應(yīng)用中亟待解決的一大問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種熱穩(wěn)定性好的β -葡聚糖酶。[0009]所述的熱穩(wěn)定性好的β -葡聚糖酶，其酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0010](I)溫度:該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度為65°C，在50_70°C之間具有較聞的酶活；
[0011](2) pH:該酶最適反應(yīng)pH值為5.0，在pH值為4.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定；
[0012](3)酶活性:8000-10000U/ml，是出發(fā)菌株的2.5倍。
[0013](4)熱穩(wěn)定性:該酶在60°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C條件下保存IOmin后保持20%以上酶活；
[0014](5)存儲(chǔ)穩(wěn)定性:該酶在室溫下保存6個(gè)月后酶活損失小于25%，4°C保存12個(gè)月后酶活損失小于20%。
[0015]所述的β -葡聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:
[0016](I)種子培養(yǎng)
[0017]將地衣芽孢桿菌斜面菌種經(jīng)三級(jí)搖瓶發(fā)酵及一級(jí)種子罐發(fā)酵；
[0018]所述種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCll %,ρΗ4.5-7.0,121-123°C滅菌 30_40min。
[0019](2)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0020]將一級(jí)種子罐發(fā)酵`液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35-45 °C，攪拌速度200-300r/min，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時(shí)間10_15h ;然后將IL經(jīng)過(guò)121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時(shí)恒溫培養(yǎng)15-20h ;此時(shí)，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)10-15h ;再將IL經(jīng)過(guò)121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時(shí)恒溫培養(yǎng)10-15h ;
[0021]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水1000mL, pH值4.5-7.0,121°C滅菌20min ；
[0022]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0023]稱(chēng)取黃芪20-30份；黨參10-18份；柴胡10_15份；麥冬10_15份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C~90°C保持2~4h，然后降溫至45-60°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOff功率下超聲萃取0.5~1.5h，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑；
[0024]所述混合酶添加量為混合物料總重量的5-10% ；
[0025]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普魯蘭酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果膠酶10-15份，酸性蛋白酶
10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
[0026]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1-1.5。
[0027](3)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、精濾、干燥得β -葡聚糖酶。
[0028]所述的β -葡聚糖酶由地衣芽孢桿菌(B acillus Iicheniformis) β-10-25生產(chǎn)所得。該菌株已于該菌株已于2013年11月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院),保藏號(hào)為CCTCCN0:M2013538o
[0029]所述菌株在固體平板上菌落為白色，邊緣不整齊，表面干燥不透明，鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞形態(tài)呈短桿狀，芽孢中生，橢圓形，不膨大。
[0030]所述菌株生理生化特征:V-P試驗(yàn)( + )，淀粉水解( + )，酪素水解( + )，明膠水解( + )，硝酸鹽還原( + )，吲哚試驗(yàn)(_)，利用檸檬酸鹽( + )，硝酸還原( + )，甘露醇( + )，木糖(+ )。
[0031]有益效果:
[0032]1、由該菌株生產(chǎn)所得的β -葡聚糖酶酶活力高達(dá)8000-10000u/ml，是原始菌株的
2.5倍；在50-70°C條件下具有較高酶活，最適反應(yīng)溫度為65°C;適用反應(yīng)pH值范圍為5.0 ；在室溫下保存6個(gè)月后酶活損失小于25%，4°C保存12個(gè)月后酶活損失小于20%。比現(xiàn)有的β -葡聚糖酶酶活力高，酶作用最適PH值范圍寬泛，熱穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性均較高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。
[0033]2、本發(fā)明中的葡聚糖酶在制備過(guò)程中一方面采用溫度刺激發(fā)酵的方法，一方面對(duì)培養(yǎng)基實(shí)施全程優(yōu)化，添加了具有抗熱應(yīng)激原作用的黃芩、柴胡，使得所得的β -葡聚糖酶具有更好的穩(wěn)定性和保存活性。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035]實(shí)施例1:
[0036]淀粉酶活性的測(cè)定
[0037](I)酶活單位的定義:lmL粗酶液,于50°C、pH6.0條件下，Imin從濃度為4mg/ml義葡聚糖溶液終降解出I μ mo I還原糖，即為I個(gè)酶活單位(lU/ml)
[0038](2)酶活力測(cè)定方法:采用DNS法測(cè)定
[0039]①取5支試管，編號(hào)1、2、3、4、5，分別加入0.5ml葡聚糖溶液；
[0040]②向1、2、3號(hào)試管中加入0.5ml待測(cè)粗酶液，于50°C水浴中反應(yīng)15min ；
[0041]③向4、5號(hào)試管中加入0.5ml待測(cè)粗酶液；
[0042]④向5支試管中個(gè)加入3mlDNS試劑,搖勻后沸水浴5min ；
[0043]⑤水浴冷卻后，以4、5號(hào)試管為對(duì)照，測(cè)定1、2、3號(hào)在540nm下的吸光度；
[0044]⑥對(duì)照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。
[0045]實(shí)施例2:
[0046]酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定
[0047](I)溫度對(duì)β-葡聚糖酶酶活性的影響
[0048]于40、50、60、70、80、90°C下分別測(cè)定所得β -葡聚糖酶粗酶液的活力，結(jié)果表明該酶在50-70°C之間均具有較高的酶活性，說(shuō)明該酶的溫度適應(yīng)范圍較寬，其最適作用溫度為 65。。。[0049](2) β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性
[0050]將所得的粗酶液于40、50、60、70、80、90°C下保存10min、30min、Ih后于50°C條件下測(cè)定酶活，結(jié)果表明該酶在60°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C條件下保存IOmin后保持20%以上酶活。
[0051](3) β-葡聚糖酶的保存穩(wěn)定性
[0052]將所得的粗酶液于4°C和室溫條件下保存I天、15天、I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月后于50°C條件下測(cè)定酶活。結(jié)果表明該酶在室溫下保存6個(gè)月后酶活損失小于25%，4°C保存12個(gè)月后酶活損失小于20%。
[0053](4) pH對(duì)酶活性的影響
[0054]在50°C，pH3-9下分別測(cè)該酶酶活，結(jié)果表明該酶在pH4.5-7.0時(shí)酶活性較高，最適 pH 為 6.5.。
[0055]實(shí)施例3:
[0056]一種β -葡聚糖酶的制備方法
[0057]包括如下步驟:
[0058](I)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0059]①一級(jí)種子培養(yǎng):將活化后的斜面菌種2環(huán)接入500毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時(shí)間IOh ；
[0060]②二級(jí)種子培養(yǎng):將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；`
[0061]③三級(jí)種子培養(yǎng):將二級(jí)種子以10%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度40°C，培養(yǎng)時(shí)間10-15h ；
[0062]④一級(jí)種子罐培養(yǎng):將三級(jí)種子以10%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度41 °C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量(V/V) 1: 1.5，罐壓
0.05Mpa,培養(yǎng)時(shí)間15h ；
[0063]所述種子培養(yǎng)基為:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉1%，NaCll%, pH5.5，121°C 滅菌 35min。
[0064](2)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0065]將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度37°C，攪拌速度250r/min，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3，培養(yǎng)時(shí)間12h ;然后將IL經(jīng)過(guò)121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至37°C時(shí)恒溫培養(yǎng)18h ;此時(shí)，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)12h ;再將IL經(jīng)過(guò)121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至37°C時(shí)恒溫培養(yǎng)12h ；
[0066]所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑0.5g,純凈水1000mL, pH值5.5，121°C滅菌20min ；
[0067]所述中草藥粉劑的制備方法如下:
[0068]稱(chēng)取黃芪25份；黨參15份；柴胡12份；麥冬12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOW功率下超聲萃取lh，過(guò)濾；濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
[0069]所述混合酶添加量為混合物料總重量的8%。
[0070]所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β -淀粉酶18份，果膠酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
[0071]所述乙醇和丙醇的質(zhì)量比例為1:1.2。
[0072](3)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、精濾、干燥得β -葡聚糖酶。
[0073]經(jīng)上述制備方法得`到的β -葡聚糖酶液體酶活力為10000u/ml。
【權(quán)利要求】
1.一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶，所述β-葡聚糖酶具有以下特性: (1)溫度:該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度為65°C，在50-70 V之間具有較高的酶活； (2)pH:該酶最適反應(yīng)pH值為5.0，在pH值為4.0時(shí)酶活完全穩(wěn)定； (3)酶活性:8000-10000U/ml，是出發(fā)菌株的2.5倍； (4)熱穩(wěn)定性:該酶在60°C條件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C條件下保存IOmin后保持20%以上酶活； (5)存儲(chǔ)穩(wěn)定性:該酶在室溫下保存6個(gè)月后酶活損失小于25%，4°C保存12個(gè)月后酶活損失小于20%。
2.如權(quán)利要求1所述的一種熱穩(wěn)定性好的β_葡聚糖酶，其特征在于，該酶由地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) β-10-25 生產(chǎn)所得，菌種保藏號(hào)為 CCTCC Ν0:Μ2013538。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶，由以下方法制得: (1)地衣芽孢桿菌(Bacillus Iicheniformis) β-10-25菌種活化,一、二、三級(jí)種子培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)； (2)發(fā)酵罐發(fā)酵 將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以 3%接種量接入含有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度35-45°C，攪拌速度200-300r/min，通風(fēng)量(V/V) 1:1-3,培養(yǎng)時(shí)間10_15h ;然后將IL經(jīng)過(guò)121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時(shí)恒溫培養(yǎng)15-20h ;此時(shí)，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液以2%接種量追加接入發(fā)酵罐，恒溫培養(yǎng)10-15h ;繼續(xù)將IL經(jīng)過(guò)121°C滅菌20min，溫度為10°C的發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)入發(fā)酵罐，待溫度升至35_45°C時(shí)恒溫培養(yǎng)10-15h ; (3)發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、精濾、干燥得β-葡聚糖酶。
4.如權(quán)利要求3所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成為:酵母粉0.5%，蛋白胨1%，可溶性淀粉l%，NaCll%，pH4.5-7.0。
5.如權(quán)利要求3所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:麥麩75g，玉米粉55g，米糠25g，豆餅粉20g，β -葡聚糖2g，中草藥劑粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米漿3g，硫酸銨2g，磷酸氫二鉀2g，磷酸二氫鉀2g，檸檬酸鈉3g，消泡劑 0.5g,純凈水 1000mL, pH 值 4.5-7.0,121°C滅菌 20min。
6.如權(quán)利要求5所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶，其特征在于，所述中草藥粉劑的制備方法如下: 稱(chēng)取黃芪25份；黨參15份；柴胡12份；麥冬12份；分別將上述中草藥粉碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持3h，然后降溫至50°C，加入混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，IlOff超聲萃取0.5~1.5h ;濾液真空濃縮后冷凍干燥獲得中草藥粉劑。
7.如權(quán)利要求6所述的一種熱穩(wěn)定性好的β-葡聚糖酶，其特征在于，中草藥粉劑的制備方法中所述混合酶的重量份數(shù)組成為:β -葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普魯蘭酶25份，β，淀粉酶18份，果膠酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
8.如權(quán)利要求1或2所 述的一種熱穩(wěn)定性好的β -葡聚糖酶在飼料和啤酒工業(yè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/24GK103805578SQ201310716429
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】李洪兵, 李海清, 胡永明, 胡波, 易繼云, 樊淳紅 申請(qǐng)人:湖南鴻鷹生物科技有限公司