用反向載體法構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的制作方法
【專利摘要】用反向載體法構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻。本發(fā)明構(gòu)建的工程魚腥藻，用基因操作調(diào)控藍藻中pepc基因的表達包括目的基因的釣出和載體的構(gòu)建，藍藻的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選，工程藍藻的培養(yǎng)和檢測，總脂及脂肪酸含量測定。結(jié)果證明，與野生型相比，pepc基因反向表達的魚腥藻含脂率提高了93%，總脂從野生型的11.5%提高到22.2%，脂產(chǎn)率增加了一倍，已達到真核藻的平均含脂水平。因此，本發(fā)明構(gòu)建的pepc基因反向表達的魚腥藻可作為制備生物柴油和必需脂肪酸較理想的原料。
【專利說明】用反向載體法構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍
藻
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和微藻能源領(lǐng)域，具體為構(gòu)建一種工程藍藻為生產(chǎn)生物柴油和必需脂肪酸提供原料。
【背景技術(shù)】
[0002]用哪種微藻制備生物柴油，已成國內(nèi)外開發(fā)生物能源的關(guān)鍵之一。從1978年美國能源部啟動“水生物種計劃(Aquatic Species Program, ASP)”以來35年中，各國學(xué)者在開發(fā)微藻能源上取得了許多進展。近6年Chisti (2007)和Hu等(2008)對微藻特性的進一步闡明，全球掀起了用微藻制備生物柴油的熱潮。微藻這個群體，可分為真核藻和原核藻。真核微藻含脂率較高，一直受到大家的關(guān)注；然而藍藻(又名藍細菌)是原核微藻，除了含脂率較低，有許多優(yōu)點值得注意，可以利用。例如絲狀體魚腥藻7120 (Anabaena sp PCC 7120)能固氮，可生長在無氮營養(yǎng)液中，不易受其它藻類和植物干擾；不通氣或不攪拌，易沉淀便于采收；較耐高溫，30~35°C是最適生長溫度；基因水平操作較成熟；基因組序列測定已經(jīng)完成。
[0003]長期以來提高藻類含脂率的主要方法是缺N (用于綠藻)、缺Si (用于硅藻)、處于休眠(用于葡球藻)等方法來降低生長率。這些方法實際上不能最終提高脂產(chǎn)率。為了提高其含脂率，我們用魚腥藻7120作材料，在基因水平上調(diào)控磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的表達。PEPC主要在四碳光合固碳途徑中起重要作用。有趣的是近20多年來證明它在進行非四碳光合的40多種藍藻中存在；用油脂植物還證明它在調(diào)控油脂和蛋白的合成中起關(guān)鍵作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是用基因操作構(gòu)建一種工程藍藻作為微藻生物柴油和生產(chǎn)必需脂肪酸較理想的原料。
[0005]技術(shù)方案為，用基因操作調(diào)控藍藻中pepc基因的表達，具體用反向載體法調(diào)控P印C基因在絲狀體魚腥藻7120 (Anabaena sp PCC 7120)的表達。作為生物柴油和生產(chǎn)必需脂肪酸的原料，我們的工程藍藻是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶pepc基因反向表達的轉(zhuǎn)基因藍藻，所述藍藻為魚腥藻。通過構(gòu)建P印c基因反向表達載體，并用三親結(jié)合法轉(zhuǎn)化魚腥操，抑制pepc基因表達，在不降低生長速率的如提下，提聞含脂率。
[0006]這種絲狀體工程藍藻的構(gòu)建方法步驟如下:
[0007](a)基于魚腥藻7120的p印c基因序列，設(shè)計和合成引物；
[0008]所用的引物序列為:
[0009]上游5’ -GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3’ ；
[0010]下游5 ’ -AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3，
[0011]以魚腥藻7120的基因組為模板，釣取P印c基因；用PCR法擴增獲得p印c基因；[0012]釣出的pepc編碼基因連接到pMD-18-T載體上,測序鑒定；與在GenBank中的pepc基因(編號為NP_488901)比對序列的準確率；
[0013](b)選用在藍藻和大腸桿菌中都可擴增和表達的質(zhì)粒載體pRL-489，將p印c基因與pRL-489質(zhì)粒連接,構(gòu)建反向穿梭表達載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌；優(yōu)選的，所述大腸桿菌為DH5 α或Τρ107 ;鑒定反向穿梭表達載體的方法為:將所連接的載體用XbaI酶切后電泳，出現(xiàn)4個電泳條帶的為反向穿梭表達載體。
[0014](C)將含有輔助質(zhì)粒和結(jié)合質(zhì)粒的大腸桿菌、步驟(b)獲得的帶有反向穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻培養(yǎng)到對數(shù)生長中期，按照4.5~5.5:4.5~5.5:1的細胞數(shù)量比混合，通過三親接合轉(zhuǎn)移法用帶pepc基因的載體轉(zhuǎn)化藍藻；優(yōu)選的，含有輔助質(zhì)粒和結(jié)合質(zhì)粒的大腸桿菌、步驟(b)獲得的帶有反向穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻細胞數(shù)量比為5:5:1 ;
[0015]Cd)用含抗生素的無氮BGll培養(yǎng)基或培養(yǎng)液篩選藍藻轉(zhuǎn)化子，用接種針把平板上的單藻落挑出，接種到液體培養(yǎng)液中生長，逐步提高抗生素濃度，能成活的就是轉(zhuǎn)化子；所述的抗生素為卡那霉素或硫酸新霉素。具體為:
[0016](I)將混合后的細胞均勻涂在濾膜上，在無抗生素的BGll培養(yǎng)基上培養(yǎng)6~8天直至藍藻生長；
[0017](2)然后在含抗生素濃度為15~30 μ g/mL的BGll培養(yǎng)基上培養(yǎng)18~24天篩選出對抗生素有抗性的藍藻 單藻落；
[0018](3)挑選生長較好的魚腥藻7120單藻落，置于抗生素濃度20~50 μ g/mL的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5~8天；
[0019](4)再經(jīng)過2~4次逐級提高抗生素濃度的篩選培養(yǎng)，每次培養(yǎng)時間為5~8天，直至抗生素濃度提高到280~300 μ g/mL ；
[0020](5)用PCR技術(shù)檢測工程藍藻中的P印c基因，并用RT-qPCR法檢測藍藻中P印c基因表達。
[0021]上述方法所制備的絲狀體工程藍藻可應(yīng)用于生產(chǎn)脂肪酸或生物柴油。工藝包括:
[0022]( I)培養(yǎng)上述絲狀體工程藍藻；
[0023](2)收集絲狀體工程藍藻并洗滌、冷凍干燥得到干藻粉，并從干藻粉中抽提脂類物質(zhì)。
[0024]步驟(1)所述培養(yǎng)條件為:
[0025]培養(yǎng)液:無氮的BGll培養(yǎng)液或培養(yǎng)基，pH=8.3~8.6，優(yōu)選的，pH=8.5 ；
[0026]溫度30±1°C,以白光或者白光與藍光和紅光混合作為光源，攪拌條件下培養(yǎng)5~
8天；光照強度為 50-80 μ mo I.m_2.s_1 ；
[0027]攪拌的方式為振蕩培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)；振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為120~150rpm ;通氣培養(yǎng)為通入含1%~2%體積比CO2的空氣。
[0028]轉(zhuǎn)基因工程藍藻的培養(yǎng)和檢測。在液體BGll中篩選轉(zhuǎn)基因藍藻時，體積從2mL(試管中)擴展到30mL (在50mL錐形瓶中)，再擴大到150mL (在250mL錐形瓶中)。在250mL錐形瓶中培養(yǎng)時可開始作分子檢測:用RT-qPCR法檢測P印c基因的表達。還可作生理檢測，即用氧電極測定不同光強、不同溫度、不同pH、不同鹽度等環(huán)境因子對轉(zhuǎn)基因藍藻細胞凈光合的影響。從而，可推斷轉(zhuǎn)基因藻的最適生長條件。這些生理學(xué)參數(shù)，可作為進一步用光反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因藻的依據(jù)。
[0029]本發(fā)明構(gòu)建高油脂及高含量必需脂肪酸的絲狀體藍藻，其主要優(yōu)點有:(1)高光合作用效率；(2)高油脂產(chǎn)率；(3)容易收獲；(4)適應(yīng)脅迫環(huán)境能力強；(5)能生長在無氮的培養(yǎng)液里，避免需結(jié)合態(tài)氮植物污染；(6)能適應(yīng)各種碳源(如自養(yǎng)、異養(yǎng)和混合養(yǎng))；(7)基因組序列已測序；(8)基因操作成熟；(9)無毒；(10)既可生產(chǎn)生物燃料，又可生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。
[0030]本發(fā)明提供了一種既能提高含脂率，又不降低生長的途徑來生成生物柴油或脂肪酸。用反向載體法(Reverse Vector Method, RVM)構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體藍藻。
[0031]本發(fā)明所用的絲狀體藍藻是魚腥藻7120 (Anabaena sp PCC 7120)，它能固氮，可生長在無氮營養(yǎng)液中，不易受其它藻類和植物干擾；不通氣或不攪拌，易沉淀便于采收；較耐高溫，30~35°C是最適生長溫度；基因水平操作較成熟，基因組序列測定已完成。選的基因是編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因P印C。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)除了在C4途徑中能濃縮CO2外，還證明它還有非光合功能，本發(fā)明以魚腥藻7120 (Anabaenasp PCC 7120)作材料，構(gòu)建了含磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)編碼基因(p^)C)(包含2段保守序列，F(xiàn)a和Fb)的正向和反向兩種表達載體，后用三親接合法轉(zhuǎn)化魚腥藻7120并進行分子檢測、生化檢測和生理檢測。
[0032]結(jié)果證明，與野生型相比，P印c基因反向表達的魚腥藻含脂率提高了 93%，從野生型的11.5%提高到22. 2%，已達到真核藻的平均含脂水平；但它的光合和生長，要比絕大多數(shù)真核藻高得多。與野生型的相比，反向突變體的生長還略快，脂產(chǎn)率(lipidproductivity)高了一倍。GC-MS分析表明，反向魚腥藻的脂肪酸成分主要包括:壬酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，包括了 5種生物柴油的重要組分，尤其是亞油酸和亞麻酸分別達到106.86mg/L和53.04mg/L，含量比野生型增加55.4%和75.6%。它們也是人體必需的脂肪酸，其中亞麻酸可作為治療心血管病的藥物。因此，pepc基因反向表達的魚腥藻不僅具備作為生物柴油的原料，還可成為人類補充必需脂肪酸的重要來源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為構(gòu)建反向穿梭表達載體(pRL-reve pepc)和正向穿梭表達載體pRL-forwpepc的示意圖
[0034]圖2為反向穿梭表達載體和正向穿梭表達載體的酶切鑒定電泳圖譜，其中泳道I和2分別為正向和反向穿梭表達載體為模板的P印c PCR產(chǎn)物，3為DNA AHindIII Marker,
4和5分別為正向和反向穿梭表達載體，6和7分別為正向和反向穿梭表達載體的Bam HI酶切產(chǎn)物，8和9為正向和反向穿梭表達載體的XbaI酶切產(chǎn)物。
[0035]圖3為反向穿梭表達載體和正向穿梭表達載體分別用XBaI酶切鑒定電泳圖譜，其中泳道I為DNA λ Hind III Marker，2、3、4、5為反向穿梭表達載體的XbaI酶切產(chǎn)物，6、7、8為正向穿梭表達載體的XbaI酶切產(chǎn)物。
[0036]圖4為野生型及反向pepc表達的魚腥藻顯微照片(a和b)和熒光照片(c和d)。
[0037]圖5為野生型、突變P印c表達(正向、反向和空白表達載體)魚腥藻的總脂含量?！揪唧w實施方式】
[0038]為了具體了解本發(fā)明實現(xiàn)的創(chuàng)新特征和技術(shù)手段，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。
[0039]實施例1釣出目的基因和構(gòu)建載體
[0040](I)確定pepc基因序列,可在GenBank中查到,其編號為NP_488901 ;按這序列設(shè)計引物，用PCR技術(shù)釣pepc基因；引物序列為:
[0041]上游5，-GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3，，如 SEQ ID N0.2 ； [0042]下游5，-AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3，，如 SEQ ID N0.3 ；
[0043]純培養(yǎng)魚腥藻7120，從中提取基因組DNA作為釣P印c基因的模板，用PCR技術(shù)，利用上述引物獲取目的基因，長度約為2300bp，如SEQ ID N0.1序列。
[0044](2)選pRL-489質(zhì)粒與目的基因相連，構(gòu)建正向和反向2種穿梭表達載體，正向載體按常規(guī)基因工程中基因過表達載體構(gòu)建的操作進行，即把基因片段順著表達調(diào)控方向連接到載體上；反向載體則是逆著表達調(diào)控方向連接目的基因。構(gòu)建方法如圖1所示。
[0045]通過以下方法鑒定和區(qū)分正向載體和反向載體:
[0046]將連接的載體用XbaI酶切并電泳鑒定，出現(xiàn)四個較大片段的是正向載體，出現(xiàn)三個片段的是反向載體。如圖2所示和圖3所示。
[0047]如圖2，其中泳道I和2分別為以正向和反向穿梭表達載體為模板的P印c PCR產(chǎn)物(2300bp)，3為DNA λ HindIII Marker, 4和5分別為正向和反向穿梭表達載體，6和7分別為正向和反向穿梭表達載體的Bam HI酶切產(chǎn)物，8和9為正向和反向穿梭表達載體的XbaI酶切產(chǎn)物。
[0048]圖3中，泳道I為DNA λ Hind III Marker，2、3、4、5為反向穿梭表達載體的XbaI酶切產(chǎn)物，6、7、8為正向穿梭表達載體的XbaI酶切產(chǎn)物。
[0049]由圖2和圖3可見，正向穿梭表達載體經(jīng)XbaI酶切后出現(xiàn)3個片段，其中兩個片段較大，分別為4361bp和5839bp，一個較小，約IlOObp左右；反向穿梭表達載體經(jīng)XbaI酶切后出現(xiàn)4個片段，其中三個片段較大，分別為4361bp、3519bp和2320bp 個較小，約IlOObp 左右。
[0050](3)把上述2種載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌(DH5ci品系，ToplO品系等)為轉(zhuǎn)化藍藻作準備。
[0051]選用pRL-489質(zhì)粒來連接pepc基因，這是由于pRL-489既能在大腸桿菌中復(fù)制和表達基因，又能在藍藻中復(fù)制和表達基因。為了把由PCR得到的P印c基因與pRL-489連接，在設(shè)計引物時要按pRL-489上酶切位點加上連接位點。連接位點的序列為GGATCC。
[0052]實施例2轉(zhuǎn)化藍藻和篩選轉(zhuǎn)化子。
[0053]這個實施例中包括:
[0054](I)純化和保存所需的藍藻野生型品系；(2)測定已選擇的藍藻的生長曲線，并把藍藻培養(yǎng)到對數(shù)生長中期，用作三親接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)化的材料；(3)把帶有上述穿梭表達載體的大腸桿菌突變體培養(yǎng)到對數(shù)生長中期(培養(yǎng)4~5小時)，用作三親接合轉(zhuǎn)移；(4)把含有助手質(zhì)粒(Helper質(zhì)粒)和結(jié)合質(zhì)粒(Conjugative質(zhì)粒)的大腸桿菌培養(yǎng)到對數(shù)生長中期(培養(yǎng)約4~5小時)，用于三親接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)化藍藻；(5)通過三親接合轉(zhuǎn)移法用帶P印c的載體轉(zhuǎn)化藍藻；(6)用含抗生素的培養(yǎng)基(液)篩選藍藻的轉(zhuǎn)化子。
[0055] 這6步中的大部分操作，文獻中已有些介紹，但是都沒講清楚，按其操作，難以成功。這里按我們經(jīng)驗建議3點注意事項:
[0056](I)三親接合轉(zhuǎn)移法中的“三親”，即純化的藍藻、帶穿梭表達載體的大腸桿菌(El)和帶Helper質(zhì)粒和Conjunctive質(zhì)粒的大腸桿菌(E2)都要培養(yǎng)到生長周期中的對數(shù)生長期中期，進行三親接合轉(zhuǎn)移藍藻的轉(zhuǎn)化率較高。為此必須預(yù)先測定它們的生長曲線，確切弄清對數(shù)生長期中期在哪幾天。
[0057](2)這三親要按比例混合。藍藻:大腸桿菌El:大腸桿菌E2=l:5:5。這是經(jīng)驗數(shù)值。根據(jù)這三親的生理狀態(tài)，還可以在1:4.5~5.5:4.5~5.5的范圍內(nèi)變化，如生長差的大腸桿菌數(shù)可適量增加，生長好的大腸桿菌可適量減少。
[0058](3)三親混合后均勻涂在濾膜上，開始幾天放在無抗生素的固體BG-1l培養(yǎng)基上。待濾膜上的藍藻長起來后才移到有抗生素的固體BG-1l培養(yǎng)基上。文獻上介紹在無抗生素培養(yǎng)基上放置24小時即可，實際上不行。我們的經(jīng)驗是I周左右，才能移到有抗生素的培
養(yǎng)基上。
[0059]實施例3轉(zhuǎn)基因工程藍藻的培養(yǎng)和檢測
[0060]這個實施例中包括(I)在平板上經(jīng)抗生素篩選3周左右，可挑選藻落大、葉綠素濃的工程藻，取藻落的1/3，在小管中用BG-1l培養(yǎng)液懸浮。取樣鑒別是否為魚腥藻；
[0061](2)確定藻種后，把藻落取出在含2mL左右含有25 μ g/mL培養(yǎng)液的試管中無菌培養(yǎng)；1周后轉(zhuǎn)入含30mL含有25~50 μ g/mL抗生素的BG-1l培養(yǎng)液(50mL錐形瓶)中培養(yǎng)。一周后擴大到含150mL培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中培養(yǎng)，并可逐步提高抗生素(卡那霉素或硫新霉素)的濃度，從 25 μ g/mL 經(jīng)過 50、75、100、150、200、250 提高到 300 μ g/mL ；
[0062](3)抗生素濃度提高到100 μ g/mL后，可進行分子檢測，即用PCR技術(shù)檢查工程藍操中目的基因的存在和表達；
[0063](4)然后作生理檢測，即用氧電極測定工程藻光合放氧速率隨光強、溫度、pH、鹽度等環(huán)境因子的變化。由此可推測工程藻的最適生長條件；
[0064](5)把工程藻培養(yǎng)在最適生長條件下，檢測其生長曲線和生物量的變化。
[0065]這5步中大部分操作在文獻中已有些介紹，但細節(jié)很少講清楚。下面按我們的經(jīng)驗，提出兩點建議:
[0066](I)逐步提高抗生素濃度篩選轉(zhuǎn)基因藻到高濃度(100 μ g/mL以上)時，藻細胞分裂較慢。為此在提高抗生素濃度前，先將工程藻轉(zhuǎn)入低濃度(25~50μ g/mL)下生長I周左右，然后再放入含高濃度抗生素的培養(yǎng)液中，這樣才能有效地除去野生型細胞。如果不這樣，即使提高抗生素濃度，篩選也會失效。
[0067](2)藍藻的生理狀態(tài)，對光強變化響應(yīng)很快，不需適應(yīng)；但對其他環(huán)境因子響應(yīng)需要一段時間。在氧電極測定溫度、pH、鹽度等因素對工程藻光合影響時，每改變一個溫度、PH或鹽度時，都需讓工程藻對新環(huán)境適應(yīng)時間至少I小時。不然測得的數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，重復(fù)性差。
[0068]實施例4工程藍藻的制備與分析將實施例3篩選得到的轉(zhuǎn)基因絲狀體工程藍藻的藻種逐步活化放大，在100L光反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。以白光為光源，或者白光與藍光、紅光混合作為光源(24小時連續(xù)光照)，用BG-1l (無N)培養(yǎng)液，pH為8.5、攪拌條件下、30± 1°C下培養(yǎng)7天后收獲，沉淀、離心，收集轉(zhuǎn)基因藍藻并洗滌、冷凍干燥和粉碎得到干藻粉。光照強度條件為80~150 μ mo I.m 2.s 1O
[0069]攪拌的方式為振蕩或通氣，振蕩的速度為135rpm ;通氣方式為:通入含1%~2%體積比CO2的空氣。
[0070]BG-1l (無 N)培養(yǎng)液的組成為=NaCl (-N) 1.03g/L ；K2HPO4.3H20 0.04g/L,Na2CO3 0.02g/L，檸檬酸 0.006g/L，檸檬酸鐵銨 0.006g/L, Na2-EDTA 0.001g/L, CaCl2.2H200.036g/L, MgSO4.7H20 0.075g/L, H3BO4 2.86mg/L, MnCl2.4H20 1.81mg/L, ZnSO4.7H200.222mg/L, NaMoO4.2H20 0.39mg/L, CuSO4.5H20 0.079mg/L, Co (NO3) 2.6H20 0.0494mg/L,用 Tris 調(diào)節(jié) pH8.5。
[0071]BG-1l培養(yǎng)液已普遍應(yīng)用于微藻培養(yǎng)，但配制時易產(chǎn)生沉淀。我們改進了配法，而未改變?nèi)魏位衔?，可明顯減少沉淀。主要做法是2方面:(I)按下表中化合物的組合制備母液；(2)按下表順序取母液配成工作液。
[0072]表1.BG-1l (—N)培養(yǎng)液的配制
[0073]
【權(quán)利要求】
1.構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，用反向載體法調(diào)控P印C基因在絲狀體魚腥藻7120的表達，步驟包括: Ca)以魚腥藻7120的基因組為模板釣取P印c基因；用PCR法擴增獲得P印c基因； 所用的引物序列為:
上游 5’ -GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3’ ；
下游 5’ -AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3’ (b)pepc基因與pRL-489質(zhì)粒連接,構(gòu)建反向穿梭表達載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌； (c)將含有輔助質(zhì)粒和結(jié)合質(zhì)粒的大腸桿菌、步驟(b)獲得的帶有反向穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻培養(yǎng)到對數(shù)生長中期，按照4.5~5.5:4.5~5.5:1的細胞數(shù)量比混合，通過三親接合轉(zhuǎn)移法用帶P印c基因的載體轉(zhuǎn)化藍藻； Cd)用含抗生素的無氮BGll培養(yǎng)基或培養(yǎng)液篩選藍藻轉(zhuǎn)化子。
2.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟(c)中，含有輔助質(zhì)粒和結(jié)合質(zhì)粒的大腸桿菌、步驟(b)獲得的帶有反向穿梭表達載體的大腸桿菌及純化后的野生型藍藻細胞數(shù)量比為5:5:1。
3.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟(a)中，所述的pepc基因序列如SEQ ID N0.1所示。
4.權(quán)利要求1所 述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟(d)所述抗生素為卡那霉素或硫新霉素，所述的篩選藍藻轉(zhuǎn)化子的方法為: (1)將混合后的細胞均勻涂在濾膜上，在無抗生素的BGll培養(yǎng)基上培養(yǎng)6~8天直至能看到藍藻生長； (2)然后在含抗生素濃度為15~30μ g/mL的BGll培養(yǎng)基上培養(yǎng)18~24天篩選出對抗生素有抗性的藍藻單藻落； (3)挑選生長較好的魚腥藻7120單藻落，置于抗生素濃度20~50μ g/mL的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5-8天； (4)再經(jīng)過2~4次逐級提高抗生素濃度的篩選培養(yǎng)，每次培養(yǎng)時間為5~8天，直至抗生素濃度提高到280~300 μ g/mL ； (5)用PCR技術(shù)檢測工程藍藻中的P印c基因，并用RT-qPCR法檢測藍藻中p印c基因表達。
5.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟(b)中，鑒定反向穿梭表達載體的方法為:將所連接的載體用XbaI酶切后電泳，出現(xiàn)3個電泳條帶的為反向穿梭表達載體。
6.權(quán)利要求1所述構(gòu)建高油脂及高必需脂肪酸的絲狀體工程藍藻的方法，其特征在于，步驟(b)中，所述大腸桿菌為DH5a或Tp 107。
7.權(quán)利要求1~6所述方法構(gòu)建的絲狀體工程藍藻在生產(chǎn)脂肪酸或生物柴油方面的應(yīng)用。
8.生產(chǎn)脂肪酸或生物柴油的方法，其特征在于，步驟包括: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求1~6所述方法構(gòu)建的絲狀體工程藍藻； (2)收集絲狀體工程藍藻并洗滌、冷凍干燥得到干藻粉，并從干藻粉中抽提脂類物質(zhì)。
9.權(quán)利要求8所述生產(chǎn)脂肪酸或生物柴油的方法，其特征在于，步驟(1)所述培養(yǎng)條件為: 培養(yǎng)液:無氮的BGll培養(yǎng)液或培養(yǎng)基，pH=8.3~8.6 ; 溫度30± 1°C,以白光或者白光與藍光和紅光混合作為光源，攪拌條件下培養(yǎng)5~8天；光照強度為 50-80 μ mo I.π 2.s_1 ； 攪拌的方式為振蕩培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)；振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為120~150rpm ;通氣培養(yǎng)為通入含1%~2%體積比CO2的空氣。
【文檔編號】C12P7/64GK103642830SQ201310658994
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月8日
【發(fā)明者】賈曉會, 施定基, 候李君, 米華玲, 胡文利, 陳宇清, 王曉燕, 田琪琳, 黃希文, 何培民 申請人:上海海洋大學(xué)