一種產(chǎn)精氨酸酶工程菌的構建及應用該菌生產(chǎn)l-鳥氨酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明闡述了一種產(chǎn)精氨酸酶工程菌的構建方法及應用該菌轉化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸，屬于生物工程【技術領域】。本發(fā)明通過分子生物學手段從嗜熱菌Bacillus?caldovelox(DSM411)中克隆獲得精氨酸酶基因，將構建好的表達質(zhì)粒導入E.coli?BL21(DE3)，通過卡那霉素抗性平板篩選獲得表達載體高拷貝重組的含精氨酸酶工程菌pET28a-ARG。該酶在大腸桿菌內(nèi)誘導表達后，仍表現(xiàn)出很高的活力。發(fā)酵得到的菌體無需破碎，即可直接用于轉化，在60℃條件下，工程菌具有較高的透性，更有利于底物的吸收和產(chǎn)物的釋放，反應速度得到極大的提高，轉化周期僅需2-4h，鳥氨酸產(chǎn)量可達120.1g/L，轉化率為98.9％。
【專利說明】一種產(chǎn)精氨酸酶工程菌的構建及應用該菌生產(chǎn)L-鳥氨酸
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)精氨酸酶工程菌的構建方法及如何應用該菌生產(chǎn)L-鳥氨酸，屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002]一、L-鳥氨酸的醫(yī)療價值及其生理功能
[0003]L-鳥氨酸是生物體內(nèi)普遍存在的氨基酸之一，鳥氨酸是一種非蛋白氨基酸，是合成脯氨酸、精氨酸等蛋白質(zhì)氨基酸的前體物質(zhì)。在動物體內(nèi)鳥氨酸主要參與尿素循環(huán)(見圖1)。
[0004]L-鳥氨酸是細胞內(nèi)重要代謝化合物，對體內(nèi)集聚的氨具有解毒作用。L-鳥氨酸可刺激腦垂體分泌生長激素，促進蛋白質(zhì)合成及糖與脂肪的分解代謝。此外，L-鳥氨酸能增加聚乙烯胺的合成，促進細胞增殖，在提高免疫功能和抗癌功能上有一定作用；以鳥氨酸為原料制備的依氟鳥氨酸，能抑制多胺合成，延緩腫瘤細胞生長，是頗具前景的新型抗癌藥物。L-鳥氨酸除了在醫(yī)藥上通常作為試劑與注射液，還被用于配制解毒、強身、保肝的營養(yǎng)劑和生產(chǎn)消除疲勞的發(fā)泡飲料。L-鳥氨酸因其多功能的醫(yī)藥保健作用而引起世人的關注，市場前景看好。
[0005]二、L-鳥氨酸 的生產(chǎn)方法
[0006]L-鳥氨酸的生產(chǎn)方法主要有:化學合成法、發(fā)酵法以及酶法。國內(nèi)外生產(chǎn)鳥氨酸主要還是以發(fā)酵法為主，鳥氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)也以日本為主，生產(chǎn)廠家主要有味之素、田道制藥和協(xié)和發(fā)酵3家。
[0007](I)化學合成法是以丙烯醛、氰化氫、氨氣等為原料，經(jīng)過多步化合和分解作用得到鳥氨酸；但是生產(chǎn)過程中涉及到有毒試劑，且產(chǎn)物為DL型混合物，故化學法并未得到普及。
[0008](2)發(fā)酵法是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸，常用于鳥氨酸發(fā)酵的菌株主要有谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌和檸檬酸節(jié)桿菌等，鳥氨酸產(chǎn)量最高可達53g/L。發(fā)酵法生產(chǎn)鳥氨酸原料成本低廉，但產(chǎn)量不高，同時由于發(fā)酵液中的成分復雜，后續(xù)分離較為困難，且平均發(fā)酵周期長達50h以上。
[0009](3)酶法是利用精氨酸酶將底物L-精氨酸轉化為L-鳥氨酸和尿素(見圖2)。張鵬等利用糞腸球菌作為酶源生產(chǎn)L-鳥氨酸，在48h的轉化周期內(nèi)，鳥氨酸產(chǎn)量可達112g/L(CN1908177A)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)精氨酸酶工程菌的構建方法及如何應用該菌轉化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸。
[0011]本發(fā)明的技術方案:
[0012]通過分子生物學手段從微生物中克隆獲得精氨酸酶基因；構建含精氨酸酶基因的表達載體。將構建好的表達質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)，通過卡那霉素抗性平板篩選獲得表達載體高拷貝重組的含精氨酸酶工程菌。通過表達和分泌獲得的精氨酸酶轉化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸。
[0013]具體實施步驟:
[0014]1、一種產(chǎn)精氨酸酶基因工程菌的構建
[0015](I)通過分子生物學手段用引物 1:5 ' -CATGCCATGGCAATGAAGCCAATTTCAATTAT-3 '和引物 2:5 ' -CCCAAGCTTTTACATGAGTTTTTCACC-3 '將來自于 Bacilluscaldovelox(DSM411)的精氨酸酶基因(GenBank登錄號:U48226.1)進行PCR擴增:體系中加入 LA taq 酶，94°C預變性 3min，94°C變性 30s，55。。退火 30s，72。。延伸 1.2min,30 個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；
[0016](2)用限制性內(nèi)切酶Nco I和HindIII將目的基因和表達載體pET28a37°C酶切2h ；
[0017](3)用T4連接酶分別將酶切并膠回收后的目的基因和質(zhì)粒pET20b和pET28al6°C連接IOh ；
[0018](4)將構建好的表達質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)，在含有卡納霉素的LB平板中培養(yǎng) 12h ；
[0019](5)將平板中長出的菌落進行PCR及酶切驗證，將含有目的基因的質(zhì)粒進行測序驗證，選出目的基因完全正確的菌株，獲得表達載體高拷貝的精氨酸酶基因工程菌。
[0020]2、通過表達和分泌獲得精氨酸酶轉化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸
[0021](I)將構建的基因工程菌接入LB斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)12h ；
[0022](2)接一環(huán)斜面種子到LB培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)6h ；
[0023](3)將種子液接入LB發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)至OD6tltl為0.6，加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG進行誘導，6h后收集菌體，無菌生理鹽水洗滌菌體兩次；
[0024](4)將菌體投入轉化液中進行轉化，其轉化條件為:底物精氨酸濃度為160g/L，轉化溫度為50-70°C，轉化時間2-4h，搖床轉速150rpm。
[0025]3、轉化產(chǎn)物驗證及L-鳥氨酸產(chǎn)量檢測
[0026]取轉化液1000Orpm離心2min，收集上清液，并以L-鳥氨酸鹽酸鹽作為標準品，配制標準溶液。將適度稀釋后的上清液和標準溶液分別與2，4- 二硝基氟苯衍生，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后，用液質(zhì)聯(lián)用法驗證產(chǎn)物是否為L-鳥氨酸，用高效液相色譜法測定L-鳥氨酸的含量。
[0027]標準品和轉化產(chǎn)物液質(zhì)聯(lián)用圖譜見圖3
[0028]高效液相色譜條件:
[0029]色譜柱:C180DSHYPERS IL ；
[0030]流動相:磷酸鹽緩沖液(PH7.0)-乙腈-水(體積比為70:20:10)，用0.22 μ m濾膜過濾；
[0031]柱溫:35°C;
[0032]檢測波長:360nm；
[0033]進樣量:10μ1;
[0034]流速:lml/min。[0035]標準曲線在200_800mg/L之間呈現(xiàn)良好的線性關系(見圖4)，回歸方程:y =
0.5319x-103.5203，R2 = 0.9990。鳥氨酸標樣和轉化液高效液相色譜圖見圖5。
[0036]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0037]1、本發(fā)明是國內(nèi)外第一次使用來源于嗜熱菌內(nèi)的精氨酸酶轉化L-將氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸，該酶在大腸桿菌內(nèi)表達后，仍表現(xiàn)出很高的活力，可以滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的需求。
[0038]2、發(fā)酵得到的菌體無需破碎，即可直接用于轉化，在酶的最適溫度60°C下，工程菌具有較高的透性，更有利于底物的吸收和產(chǎn)物的釋放，反應速度得到極大的提高，在轉化過程的前30min生產(chǎn)強度可達180g/L/h，僅需2_4h的轉化周期即可達到轉化終點。
[0039]3、目前轉化法使用的精氨酸酶主要提取自高等動物的肝臟，手續(xù)復雜，成本昂貴。用微生物來源的精氨酸酶，代替動物來源的酶，降低了生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1尿素循環(huán)示意圖
[0041]圖2酶法轉化L-精氨酸生產(chǎn)鳥氨酸示意圖
[0042]圖3標準品和轉化產(chǎn)物液質(zhì)聯(lián)用圖譜，A標準品，B轉化產(chǎn)物
[0043]圖4L-鳥氨酸標準品曲線
[0044]圖5L-鳥氨酸標準品和轉化產(chǎn)物高效液相色譜圖，A標準品，B轉化產(chǎn)物【具體實施方式】
[0045]以下是含精氨酸酶基因表達框架工程菌的構建和應用該工程菌轉化生產(chǎn)L-鳥氨酸的實施例。
[0046]實施例1
[0047]含精氨酸酶基因工程菌的構建
[0048](1)通過分子生物學手段用引物 1:5' -CATGCCATGGCAATGAAGCCAATTTCAATTAT-3 '和引物 2:5 ' -CCCAAGCTTTTACATGAGTTTTTCACC-3 '將來自于 Bacilluscaldovelox(DSM411)的精氨酸酶基因(GenBank登錄號:U48226.1)進行PCR擴增:體系中加入LAtaq酶，94°C預變性3min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸1.2min, 30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin ；
[0049](2)用限制性內(nèi)切酶Nco I和HindIII將目的基因和表達載體pET28a37°C酶切2h ；
[0050](3)用T4連接酶分別將酶切并膠回收后的目的基因和質(zhì)粒pET20b和pET28al6°C連接IOh ；
[0051](4)將構建好的表達質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)，在含有卡納霉素的LB平板中培養(yǎng) 12h ；
[0052](5)將平板中長出的菌落進行PCR及酶切驗證，將含有目的基因的質(zhì)粒進行測序驗證，選出目的基因完全正確的菌株，獲得表達載體高拷貝的精氨酸酶基因工程菌。
[0053]實施例2
[0054]通過表達和分泌獲得精氨酸酶轉化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸[0055](I)將構建的基因工程菌接入LB斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)12h ；
[0056](2)接一環(huán)斜面種子到LB培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)6h ；
[0057](3)將種子液接入LB發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)至OD6tltl為0.6，加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG進行誘導，6h后收集菌體，無菌生理鹽水洗滌菌體兩次；
[0058](4)將菌體投入轉化液中進行轉化，其轉化條件為:底物精氨酸濃度為160g/L，轉化溫度為50-70°C，轉化時間2-4h，搖床轉速150rpm ；
[0059](5)取適量轉化液進行檢測分析
[0060]實施例3
[0061]取轉化液1000Orpm離心2min，收集上清液，并以L-鳥氨酸鹽酸鹽作為標準品，配制標準溶液。將適度稀釋后的上清液和標準溶液分別與2，4- 二硝基氟苯衍生，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后，用液質(zhì)聯(lián)用法驗證產(chǎn)物是否為L-鳥氨酸，用高效液相色譜法測定L-鳥氨酸的含量。
[0062]由液質(zhì)聯(lián)用法測得發(fā)酵產(chǎn)物與標準樣品相對分子質(zhì)量相同(見圖3)，可證明轉化產(chǎn)物即為L-鳥氨酸。
[0063]用高效液相色譜法測定轉化液中L-鳥氨酸的含量，可知4h后，L-鳥氨酸的產(chǎn)量達到120.lg/L，轉化率 為98.9%。
【權利要求】
1.一種產(chǎn)精氨酸酶工程菌的構建及應用該菌生產(chǎn)L-鳥氨酸，其特征為: 通過分子生物學手段從微生物中克隆獲得精氨酸酶基因，構建含精氨酸酶基因的表達載體，將構建好的表達質(zhì)粒導入E.coli BL21 (DE3)，通過卡那霉素抗性平板篩選獲得表達載體高拷貝重組的含精氨酸酶工程菌，并通過表達和分泌獲得的精氨酸酶轉化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸。
2.根據(jù)權利要求1所述一種產(chǎn)精氨酸酶工程菌的構建及應用該菌生產(chǎn)L-鳥氨酸，其轉化步驟為: (1)將構建的基因工程菌接入斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)； (2)將斜面菌種擴大培養(yǎng)作為種子液； (3)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至0D_為0.6，加入終濃度為0.4mmol/L的IPTG進行誘導，6h后收集菌體，無菌生理鹽水洗滌菌體兩次； (4)將菌體投入轉化液中進行轉化，其轉化條件為:底物精氨酸濃度為160g/L，轉化溫度為50-70°C，轉化時間2-4h，搖床轉速150rpm，鳥氨酸可達120.lg/L，轉化率為98.9% ; (5)產(chǎn)物驗證及鳥氨酸產(chǎn)量檢測。
3.根據(jù)權利要求2所述，轉化液緩沖體系為Tris-HCl(pH9.07Mn2+濃度為10 μ mol/L)。
4.根據(jù)權利要求2所述，其轉化過程前30min生產(chǎn)強度可達180g/L/h。
【文檔編號】C12N1/21GK103923936SQ201310658955
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權日:2013年12月5日
【發(fā)明者】劉立明, 宋偉, 王鴻江 申請人:江南大學