提高HepGL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶表達(dá)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種提高HepGL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶表達(dá)的方法，包括步驟：將HepGL肝癌細(xì)胞中提取的CPS1基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理；對根據(jù)處理后DNA擴(kuò)增的CPS1啟動子區(qū)域進(jìn)行甲基化特異性基因擴(kuò)增；將擴(kuò)增出的甲基化序列進(jìn)行測序；根據(jù)甲基化位點(diǎn)周圍的堿基序列構(gòu)建TALENs表達(dá)質(zhì)粒及與甲基化位點(diǎn)同源的非甲基化同源質(zhì)粒，其中，同源質(zhì)粒中同源非甲基化序列為CG突變?yōu)镃A的突變序列；將TALENs表達(dá)質(zhì)粒和同源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepGL肝癌細(xì)胞中；篩選發(fā)生轉(zhuǎn)染的HepGL肝癌細(xì)胞，并對其進(jìn)行Q-PCR和蛋白質(zhì)印跡法處理，以檢測細(xì)胞中CPS1的mRNA及蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明方法能夠增強(qiáng)HepGL肝癌細(xì)胞代謝氨的能力。
【專利說明】提高HepGL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種提高H印GL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前肝性腦病的治療，主要在于降低患者的血氨含量，以減少或避免有毒物質(zhì)未經(jīng)肝臟處理而進(jìn)入血液循環(huán)。原因?yàn)檠焙扛邥鹬袠猩窠?jīng)系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致以中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝紊亂為特點(diǎn)并出現(xiàn)意識行為改變或昏迷的臨床綜合征。
[0003]現(xiàn)有肝性腦病的治療方式主要有藥物控制、肝移植和生物人工肝。但此三種治療方式都有其局限性，如:藥物控制需考慮患者自身機(jī)體是否能承受藥物治療所導(dǎo)致的其他機(jī)體器官功能的衰竭，當(dāng)出現(xiàn)多器官功能衰竭時(shí)，是否還能進(jìn)行藥物治療；目前供體肝臟數(shù)量有限，且每年供肝量無明顯增長的情況下，肝移植的治療范圍相對有限；生物人工肝雖無限制，但由于人工肝種子細(xì)胞相較于原代肝細(xì)胞在清除氨和合成尿素方面有明顯的功能差距，故目前該治療方法主要集中在如何提高種子細(xì)胞功能。
[0004]氨基甲酸憐酸合成酶I (carbamyl phosphate synthetaseI,CPSl)是尿素循環(huán)的第一個(gè)限速酶，其功能是結(jié)合ATP、碳酸氫鹽及氨基甲酰磷酸參與到鳥氨酸循環(huán)，使得氨最終代謝為尿素，經(jīng)腎臟排泄出，以降低血氨。CPSl主要位于肝細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞的線粒體嵴，其中，乙酰谷氨酸為其變構(gòu)輔助因子。CPSl的編碼基因位于2號染色體長臂第35號染色區(qū)間，其cDNA長度為4503bp。
[0005]以肝細(xì)胞為例，研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中有很多功能蛋白的編碼基因及抑癌基因出現(xiàn)異常的甲基化，尤其在這些基因的啟動子區(qū)域，異常甲基化的情況更為明顯。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞在CPSl的編碼基因完整的情況下，出現(xiàn)CPSl表達(dá)缺失。
`[0006]如何提高H印GL肝癌細(xì)胞CPSl的表達(dá)，進(jìn)而提高生物人工肝中種子細(xì)胞的除氨能力，是目前亟待解決的問題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種提高H印GL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶表達(dá)的方法，能夠增強(qiáng)HepGL肝癌細(xì)胞代謝氨的能力。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種提高H印GL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶(carbamyl phosphate synthetase,CPS)表達(dá)的方法,包括步驟:提取IfepGL肝癌細(xì)胞的CPSl基因組DNA，并將DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理；以處理后的DNA為模板，擴(kuò)增CPSl的啟動子區(qū)域序列；以啟動子區(qū)域序列為模板，進(jìn)行甲基化特異性基因擴(kuò)增；將擴(kuò)增出的甲基化序列進(jìn)行測序，并與正常肝細(xì)胞的CPSl的啟動子區(qū)域序列進(jìn)行比對；根據(jù)甲基化序列中甲基化位點(diǎn)周圍的喊基序列構(gòu)建TALENs表達(dá)質(zhì)粒及與所述甲基化位點(diǎn)同源的非甲基化同源質(zhì)粒，其中，同源質(zhì)粒中同源非甲基化序列為CG突變?yōu)镃A的突變序列；將TALENs表達(dá)質(zhì)粒與同源質(zhì)粒分別導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，并進(jìn)行單克隆培養(yǎng)以獲取較多的TALENs表達(dá)質(zhì)粒和同源質(zhì)粒；將TALENs表達(dá)質(zhì)粒和同源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H印GL肝癌細(xì)胞中；篩選發(fā)生轉(zhuǎn)染的H印GL肝癌細(xì)胞；設(shè)等量的2組H印GL肝癌細(xì)胞進(jìn)行Q-PCR和蛋白質(zhì)印跡法處理，以比較各組細(xì)胞中CPSl的mRNA及蛋白的表達(dá)差異，具體為設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組2組處理，其中，實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染后的IfepGL肝癌細(xì)胞，陰性對照組為加入PBS的H印GL肝癌細(xì)胞。
[0009]其中，CPSl的啟動子區(qū)域的引物序列為 5’ -GGAAAITTAAAG-3’，5’ -ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3，。
[0010]其中，以啟動子區(qū)域序列為模板，進(jìn)行甲基化特異性基因擴(kuò)增的引物包括針對甲基化DNA的弓丨物和針對非甲基化DNA的引物。
[0011 ]針對甲基化 DNA 的弓丨物序列為 5 ’ -ATGGAAATTTAAAGATCGTTG TGTA-3 ’，5 ’ -TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3，。
[0012]針對非甲基化DNA 的引物序列為 5’ -GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3’，5’ -AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3’。
[0013]其中，提高H印GL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶表達(dá)的方法在生物人工肝種子細(xì)胞中用于提高CPSl表達(dá)的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明根據(jù)CPSl啟動子區(qū)域甲基化位點(diǎn)周圍的堿基序列構(gòu)建TALENs表達(dá)質(zhì)粒，并將TALENs表達(dá)質(zhì)粒及與甲基化位點(diǎn)同源的非甲基化序列轉(zhuǎn)染至HepGL肝癌細(xì)胞中，其中，同源非甲基化序列為CG突變?yōu)镃A的突變序列。通過上述方法，可將甲基化位點(diǎn)切除，然后切除端口重組同源性的非甲基化序列，由于該同源非甲基化序列為CG突變?yōu)镃A的突變序列，因此可使CPSl啟動子區(qū)域異常甲基化的基礎(chǔ)消失，從而提高CPSl的啟動子活性，使CPSl的mRNA及蛋白表達(dá)水平提高，最終提高HepGL肝癌細(xì)胞對氨的清除能力。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
[0016]本實(shí)施例的研究材料為IfepGL肝癌細(xì)胞。
[0017]在本實(shí)施例中，首先驗(yàn)證CPSl的甲基化是否對其mRNA和蛋白的表達(dá)存在影響，具體驗(yàn)證方法如下:
[0018]將HepGL肝癌細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，在實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中加入地西他濱(5umol/ml)，對照組中加入與地西他濱等量的PBS，每24小時(shí)換一次液，連續(xù)培養(yǎng)3天后，進(jìn)行Q-PCR、蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測，以確認(rèn)對照組與實(shí)驗(yàn)組之間CPSl的mRNA及蛋白是否存在表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)證明，CPSl的甲基化對其mRNA和蛋白的表達(dá)存在影響，具體為，對照組CPSlmRNA和蛋白的表達(dá)低于實(shí)驗(yàn)組。
[0019]因此，消除CPSl的甲基化，提高H印GL肝癌細(xì)胞CPSl的表達(dá)，進(jìn)而提高IfepGL肝癌細(xì)胞代謝氨的能力，對肝癌細(xì)胞的治療具有重要作用。
[0020]在本實(shí)施例中，提高H印GL肝癌細(xì)胞CPSl表達(dá)的方法，包括以下步驟:
[0021]1、提取H印GL肝癌細(xì)胞的CPSl基因組DNA。
[0022]利用Wizard Genomic DNA 分離試劑盒(Promega Madison WI)提取 HepGL 肝癌細(xì)胞的CPSl基因組 DNA。[0023]2、將提取的DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。
[0024]米用試劑盒(EZDNA Methylation Direct Kit; Zymo Research, Orange, CA)對提取的DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。具體方法如下:
[0025]a.取I μ gDNA溶解于36 μ I的ddH20中，加入新鮮配制的4 μ 13M NaOH,且使NaOH的最終濃度為0.3Μ，37°C水浴15分鐘，對DNA進(jìn)行變性。
[0026]b.新鮮配制的IOmM對苯二酚30 μ I和3.6Μ (ΡΗ5.0)重亞硫酸鈉520 μ I加入上述變性后的溶液中，輕輕搖勻，55°C水浴16小時(shí)。
[0027]c.修飾后的DNA用脫鹽柱(Wizard DNA clean-up system)進(jìn)行脫鹽,具體為首先把滅菌的3ml注射器活塞拔出，注射器桶接上脫鹽柱。取Iml Wizard脫鹽樹脂加入含有已修飾的DNA的1.5ml離心管中，輕柔倒置進(jìn)行混合。
[0028]然后用微量移液管吸取離心管中的混合液到已滅菌的3ml注射器桶內(nèi)，插入注射器活塞緩慢而輕柔地把混合液推入脫鹽柱中。從脫鹽柱取下注射器，拔出活塞，再把注射器桶接上脫鹽柱，吸取80%的異丙醇2ml加入到注射器桶中，插入活塞把異丙醇溶液推入脫鹽柱中清洗脫鹽柱。取下注射器，把脫鹽柱放在1.5ml離心管中，10000 X g，離心2分鐘，甩干樹脂。
[0029]最后把離心后的脫鹽柱放入另一個(gè)已滅菌的1.5ml離心管，在脫鹽柱中加入70°C滅菌的雙蒸水50μ 1，等待I分鐘，10000 X g，離心20秒，洗提DNA。
[0030]3、以處理后的DNA為模板，擴(kuò)增CPSl的啟動子區(qū)域序列。
[0031]針對重亞硫酸鹽處理后的DNA，設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增CPSl啟動子區(qū)域序列。其中，設(shè)計(jì)的弓 I 物為序列 5 ’ -GGAAATTTAAAG-3 ’，5 ’ -ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3 ’。
[0032]擴(kuò)增出的CPSl啟動子序列再經(jīng)QIAquick膠抽提試劑盒進(jìn)行膠純化。
[0033]4、以啟動子區(qū)域序列為模板，進(jìn)行甲基化特異性基因擴(kuò)增。
[0034]針對甲基化DNA 的弓丨物序列為:5 ’ -ATGGAAATTTAAAGATCGTTGTGTA-3 ’，5 ’ -TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3，。
[0035]針對非甲基化DNA 的引物序列為:5’ -GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3’，5’ -AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3’。
[0036]若針對甲基化DNA的引物擴(kuò)增出片段，則說明被檢測的位點(diǎn)存在甲基化，若針對非甲基化DNA的引物擴(kuò)增出片段，則說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化。
[0037]擴(kuò)增出片段后測序，并以原代肝細(xì)胞CPSl啟動子基因作為對照組進(jìn)行比對。在本實(shí)施例中，針對甲基化DNA的引物擴(kuò)增出甲基化序列，對擴(kuò)出的甲基化序列進(jìn)行測序。
[0038]5、根據(jù)甲基化序列中甲基化位點(diǎn)周圍的堿基序列構(gòu)建TALENs表達(dá)質(zhì)粒及與所述甲基化位點(diǎn)同源的非甲基化同源質(zhì)粒。
[0039]在本實(shí)施例中，甲基化位點(diǎn)周圍的堿基序列為，L:agttgctttcttagga,R:catgaatttgatgaggtο
[0040] 本實(shí)施例構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的試劑盒為上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TALEN試劑盒(TALEN-kit)。利用該試劑盒構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的方法如下:
[0041]a.從試劑盒中取出相應(yīng)編號的模塊,每個(gè)模塊取1.5μ I,加入同一 PCR管中。
[0042]b.將試劑盒中標(biāo)有溶液1、溶液2的EP管從_20°C冰箱里取出置于冰盒上，溶液3放置于37°C水浴鍋中溶解。[0043]c.在步驟a的PCR管中加入相應(yīng)的TALEN骨架載體，然后再依次加入溶液3、溶液I和溶液2，最后加水補(bǔ)至20 μ 1，短暫離心混勻。
[0044]d.將混勻后的PCR管放入PCR儀中進(jìn)行連接反應(yīng)。
[0045]e.連接反應(yīng)后，取出PCR管并加入1μ I溶液4、0.5μ I溶液5，溶液5需37°C預(yù)先融化，混勻，在PCR儀或水浴鍋中37°C孵育I小時(shí)。
[0046]f.取孵育后的產(chǎn)物20μ I加入含感受態(tài)細(xì)胞(預(yù)先融化)的EP管中，混勻，在冰上放置30min，然后放入42°C水浴鍋中熱激45s，再迅速放置于冰上3min。
[0047]g.在超凈工作臺中向步驟f的EP管中加入500 μ I SOC溶液，然后將EP管置于37°C、250rpm的搖床中培養(yǎng)30min。
[0048]h.培養(yǎng)完成后取出EP管，將其在4000rpm的離心機(jī)中離心5min。
[0049]1.在超凈工作臺中棄去EP管中的大部分上清，留下約100 μ I上清，并將沉淀輕輕吹打混勻，然后均勻涂布于卡納霉素抗性(Ka+)的平板中，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)。
[0050]j.培養(yǎng)后挑取24個(gè)單克隆，將單克隆接種于裝有5ml LB培養(yǎng)液(含Ka+)的15ml離心管中，然后置于37°C、250rpm的搖床中培養(yǎng)16h左右。
[0051]g.培養(yǎng)后，提取TALENs表達(dá)質(zhì)粒。
[0052]同時(shí)，構(gòu)建的同源質(zhì)粒也導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，以獲得較多的同源質(zhì)粒。·
[0053]6、將TALENs表達(dá)質(zhì)粒和同源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H印GL肝癌細(xì)胞中，其中，同源質(zhì)粒中同源的非甲基化序列為CG突變?yōu)镃A的突變序列。
[0054]在本實(shí)施例中，轉(zhuǎn)染至H印GL肝癌細(xì)胞中的TALENs表達(dá)質(zhì)粒特異性結(jié)合于CPSl轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-9位的左邊和125位的右邊，用于使用核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，使得DNA雙鏈斷裂。同時(shí)，結(jié)合轉(zhuǎn)染至HepGL肝癌細(xì)胞中的與切割的甲基化位點(diǎn)同源的非甲基化序列，誘使DNA出現(xiàn)同源性重組。DNA同源重組使異常甲基化的基礎(chǔ)消失，從而提高CPSl的啟動子活性，使CPSl的mRNA及蛋白表達(dá)水平提高，最終提高該細(xì)胞對氨的清除能力。
[0055]轉(zhuǎn)染的具體步驟如下:
[0056]a.轉(zhuǎn)染前I天將0.5~2X IO5個(gè)H印GL肝癌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生素的完全培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90~95%。
[0057]b.復(fù)合物的制備
[0058]①將0.8ugTALENs表達(dá)質(zhì)粒和同源質(zhì)粒稀釋于50ul無血清、無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕混勻。
[0059]②將2ul Lipofectamine2000稀釋于50ul無血清、無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5min。此過程在25min內(nèi)進(jìn)行。
[0060]③步驟①和步驟②中混勻的液體,5min后混合,室溫孵育20min。
[0061]c.吸去24孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或無血清培養(yǎng)基清洗IfepGL肝癌細(xì)胞2次。
[0062]d.將步驟b制備的復(fù)合物IOOul加入24孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，前后搖動培養(yǎng)板使復(fù)合物分布均勻。
[0063]e.將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱孵育4~6h后，更換含血清培養(yǎng)基以去除復(fù)合物。[0064]f.換含血清培養(yǎng)基24h后，將H印GL肝癌細(xì)胞以1:10的比例傳代，I天后更換篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，具體為吸出含血清培養(yǎng)基，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋H印GL肝癌細(xì)胞，進(jìn)行篩選。
[0065]g.將篩選的發(fā)生轉(zhuǎn)染的IfepGL肝癌細(xì)胞進(jìn)行克隆。
[0066]此方法處理得到的HepGL肝癌細(xì)胞可置于含氯化銨20mmol/ml或50mmol/ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過MTT法或臺盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增值或凋亡情況，也可抽取隔日培養(yǎng)基檢測培養(yǎng)基中氨的濃度以檢測細(xì)胞對于氨的清除能力。
[0067]7、設(shè)等量的2組H印GL肝癌細(xì)胞進(jìn)行Q-PCR和蛋白質(zhì)印跡法處理，以比較各組細(xì)胞中CPSl的mRNA及蛋白的表達(dá)差異，具體設(shè)有實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組，實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染后的HepGL肝癌細(xì)胞，陰性對照組為加入磷酸鹽緩沖液的IfepGL肝癌細(xì)胞。
[0068]在本實(shí)施例中，還可在上述2組IfepGL肝癌細(xì)胞中分別加入20mmol/L的氨，以檢測其除氨能力。
[0069]本發(fā)明方法耗時(shí)較短，轉(zhuǎn)入DNA序列短，且成功率高，同時(shí)DNA轉(zhuǎn)入后可整合入細(xì)胞染色體中形成穩(wěn)定表達(dá)，利于推廣使用。
[0070]本發(fā)明提高H印GL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶表達(dá)的方法可應(yīng)用于生物人工肝種子細(xì)胞，使生物人工肝種子細(xì)胞中CPSl的表達(dá)提高，增強(qiáng)種子細(xì)胞的除氨能力。
[0071]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)`范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種提高H印GL肝癌細(xì)胞氨基甲酰磷酸合成酶表達(dá)的方法，其特征在于，包括以下步驟: 提取H印GL肝癌細(xì)胞CPSl基因組DNA序列，并將所述DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理； 以所述處理后的DNA為模板，擴(kuò)增CPSl的啟動子區(qū)域序列； 以所述啟動子區(qū)域序列為模板，進(jìn)行甲基化特異性基因擴(kuò)增； 將擴(kuò)增出的甲基化序列進(jìn)行測序，并與正常肝細(xì)胞的CPSl的啟動子區(qū)域序列進(jìn)行比對； 根據(jù)所述甲基化序列中甲基化位點(diǎn)周圍的堿基序列構(gòu)建TALENs表達(dá)質(zhì)粒及與所述甲基化位點(diǎn)同源的非甲基化同源質(zhì)粒，其中，所述同源質(zhì)粒中同源非甲基化序列為CG突變?yōu)镃A的突變序列； 將所述TALENs表達(dá)質(zhì)粒與同源質(zhì)粒分別導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，并進(jìn)行單克隆培養(yǎng)以獲取較多的TALENs表達(dá)質(zhì)粒和同源質(zhì)粒； 將所述TALENs表達(dá)質(zhì)粒和同源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H印GL肝癌細(xì)胞中； 篩選發(fā)生轉(zhuǎn)染的IfepGL肝癌細(xì)胞； 設(shè)等量的2組H印GL肝癌細(xì)胞進(jìn)行Q-PCR和蛋白質(zhì)印跡法處理，以比較各組細(xì)胞中CPSl的mRNA及蛋白的表達(dá)差異，具體為設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組2組處理，其中，實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染后的IfepGL肝癌細(xì)胞，陰性對照組為加入PBS的IfepGL肝癌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的方法，其特征在于，擴(kuò)增所述CPSl的啟動子區(qū)域的引物序列為 5，-GGAAATTTAAAG-3，，5，-ACCACTTTAAAAACTATCAAAATC-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以所述啟動子區(qū)域序列為模板，進(jìn)行甲基化特異性基因擴(kuò)增的引物包括針對甲基化DNA的引物和針對非甲基化DNA的引物； 所述針對甲基化 DNA 的弓丨物序列為 5 ’ -ATGGAAATTTAAAGATCGTTGTGTA-3 ’，5 ’ -TCAAAATCCTCGTCATTTTAATAAT-3，； 所述針對非甲基化DNA的引物序列為5’ -GAATGGAAATTTA-AAGATTTGTT-3’，5’ -AAATCCTCATCATTTTAATAAT-3’。
4.權(quán)利要求1所述的方法在生物人工肝種子細(xì)胞中用于提高CPSl表達(dá)的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/10GK103710360SQ201310643626
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】高毅, 姜錫男, 李陽 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院