一種無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞及利用其生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞及利用其生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的方法；無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法為：將豬睪丸細(xì)胞用含10%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含5%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含10%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；重復(fù)上述步驟，逐步將血清含量從10%減至5%、2%、1%直到無血清培養(yǎng)；最后利用絕跡稀釋法篩選純系的細(xì)胞系。本發(fā)明無血清馴化培養(yǎng)得到豬睪丸細(xì)胞，該細(xì)胞可較好的使豬瘟病毒增殖并應(yīng)用于豬瘟細(xì)胞疫苗生產(chǎn)，不僅避免了動(dòng)物血清的使用帶來的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)使培養(yǎng)基成分明確、提高了批次間同一性、簡(jiǎn)化了下游純化加工過程。
【專利說明】一種無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞及利用其生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗制備【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞及利用其生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬瘟(classical swine fever, CSF)，是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性熱性傳染病。1984年世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入A類傳染病，我國(guó)目前也將其定為一類傳染病。豬瘟除可引起敗血癥以外，還可引起一系列其它臨床表現(xiàn)，如妊娠母豬流產(chǎn)、胎兒畸變、慢性營(yíng)養(yǎng)性消耗、淋巴細(xì)胞和血小板減少等。目前，世界大部分國(guó)家都采取了嚴(yán)格的衛(wèi)生防疫措施和剔除豬瘟感染豬凈化豬群來控制和消滅豬瘟，一些發(fā)達(dá)國(guó)家通過防疫和防控手段已經(jīng)徹底根除了豬瘟。所以，免疫接種是豬瘟防控的重要措施，而且對(duì)無豬瘟國(guó)家爆發(fā)豬瘟?xí)r根除本病和阻止野毒傳向無豬瘟豬群也很有必要。因此，各國(guó)學(xué)者一直沒有放棄對(duì)豬瘟疫苗的研制和開發(fā)。
[0003]至今為止，豬瘟疫苗在研發(fā)及臨床應(yīng)用上主要有豬瘟滅活苗、豬瘟弱毒苗、豬瘟基因工程疫苗、豬瘟標(biāo)記疫苗、以及豬瘟DNA疫苗等幾類。其中豬瘟滅活苗是在上世紀(jì)中頁由Dorest等首先利用結(jié)晶紫制備的，但由于其低免疫原性、低保護(hù)力等因素已退出市場(chǎng)。豬瘟弱毒苗主要有兔弱化苗及低溫細(xì)胞苗，兩種疫苗都是由弱毒制備，是目前市場(chǎng)上主要應(yīng)用的產(chǎn)品。豬痕基因工程苗主要有由Hulst、Bouma、及Tsibezov等分別制備的亞單位疫苗；以及由Dong等制備的多肽疫；還包括Rumenapf、Konig、Peeter等分別制備的活病毒載體疫苗，但都由于免疫源性或安全性等因素沒有取得良好的實(shí)用效果，甚至沒有上市應(yīng)用。豬瘟標(biāo)記疫苗的本質(zhì)仍是亞單位疫苗，是在研發(fā)時(shí)去掉保護(hù)性抗原的某一表位，在臨床應(yīng)用后，可根據(jù)動(dòng)物體所產(chǎn)生的特異性抗體種類而區(qū)分動(dòng)物是自然感染還是經(jīng)過免疫。標(biāo)記疫苗從上世紀(jì)末期至今都有報(bào)道，雖然有著較好的安全性及臨床應(yīng)用的便捷，但由于免疫源性等原因，目前還沒有較好的產(chǎn)品問世。而DNA疫苗作為疫苗研發(fā)領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)重要部分，每年都有針對(duì)各種病原體的DNA疫苗的報(bào)道，但是由于DNA疫苗涉及轉(zhuǎn)基因問題，在全世界對(duì)轉(zhuǎn)基因問題的看法不會(huì)改變時(shí)，DNA疫苗仍無法實(shí)際應(yīng)用。
[0004]綜上所述，目前市場(chǎng)上所應(yīng)用的豬瘟疫苗仍舊以兔弱化苗及由細(xì)胞培養(yǎng)而來的細(xì)胞苗為主。其中我國(guó)主要應(yīng)用的兔弱化苗是1954年成功培育出并制成疫苗的CLS株病毒，也叫“C株”或“K株”。疫苗病毒的復(fù)制主要在淋巴樣組織，該毒株雖然可以通過懷孕豬的胎盤屏障，但不感染胎兒引起任何畸變，同時(shí)毒力不返強(qiáng)，對(duì)乳豬和種豬無殘余毒性。而細(xì)胞苗主要應(yīng)用毒株有GPE株及Thiverval株，此弱毒株都是由強(qiáng)毒株在豬睪丸或豬腎細(xì)胞上通過傳代，隨后用終點(diǎn)稀釋法選出純系毒株，再通過牛睪丸細(xì)胞及豚鼠腎細(xì)胞傳代，最終篩選出純系毒株，該毒株能很好的在30°C溫度中增殖。在生產(chǎn)及應(yīng)用上與兔弱化苗相比，細(xì)胞苗是用細(xì)胞培養(yǎng)，都是以種子批系統(tǒng)為基礎(chǔ)，每批種子在同一性、無菌性、純度、安全性、非傳染性、穩(wěn)定性和免疫原性等方面都是一致的，以確保同批疫苗的均一性。但在疫苗生產(chǎn)過程中動(dòng)物血清的使用會(huì)產(chǎn)生成本增加、引入外源蛋白、引入其他病毒及病原體的風(fēng)險(xiǎn)，是細(xì)胞苗在生產(chǎn)過程種面臨的一個(gè)棘手問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞及利用其生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的方法，無血清馴化培養(yǎng)得到的豬睪丸細(xì)胞，可較好的使豬瘟病毒增殖并應(yīng)用于豬瘟細(xì)胞疫苗生產(chǎn)，并且避免動(dòng)物血清的使用帶來的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
本發(fā)明公開了一種無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
1)將豬睪丸細(xì)胞用含10%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含5%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含10%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；
2)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含5%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含2%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含5%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；
3)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含2%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含1%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含2%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；
4)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含1%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換無血清培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含1%小牛血清的培養(yǎng)基傳 代培養(yǎng)3-5代；
5)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；
6)利用絕跡稀釋法篩選純系的細(xì)胞系。
[0007]進(jìn)一步，所述步驟6)中，利用絕跡稀釋法篩選純系的細(xì)胞系的具體步驟為:
①將細(xì)胞傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)；
②當(dāng)細(xì)胞貼壁后，留下只含有一個(gè)細(xì)胞的孔，拋棄其他孔；
③持續(xù)培養(yǎng)直至單細(xì)胞生長(zhǎng)成集落并布滿60%孔底，消化細(xì)胞并按對(duì)應(yīng)位置將一半細(xì)胞傳入另一 96孔板中；
④繼續(xù)培養(yǎng)，將其中一個(gè)96孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并保存細(xì)胞，另一個(gè)96孔板待細(xì)胞長(zhǎng)滿后接入豬瘟病毒，37 C吸附Ih后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
⑤在接毒后24h、36h、72h分別通過ELISA方法檢測(cè)病毒滴度，篩選出具有較好產(chǎn)毒能力的細(xì)胞系。
[0008]進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基或1640培養(yǎng)基。
[0009]進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基中加入2_10(^g/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖為硫酸肝素、硫酸軟骨素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素。
[0010]進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基中加入lOPg/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖為肝素。
[0011]進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基中加入1%_10%的外源蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白和胰蛋白胨。[0012]進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基中加入1%的牛血清白蛋白和5%胰蛋白胨。
[0013]本發(fā)明還公開了一種利用無血清培養(yǎng)的豬睪丸細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的方法，將豬瘟病毒接種于無血清培養(yǎng)的豬睪丸細(xì)胞并按常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
[0014]進(jìn)一步，所述豬瘟病毒為CLS株、GPE株或Thiverval株。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明無血清馴化培養(yǎng)得到豬睪丸細(xì)胞，該細(xì)胞可較好的使豬瘟病毒增殖并應(yīng)用于豬瘟細(xì)胞疫苗生產(chǎn),不僅避免了動(dòng)物血清的使用帶來的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)使培養(yǎng)基成分明確、提高了批次間同一性、簡(jiǎn)化了下游純化加工過程。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0017]實(shí)施例1:無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞
1)將豬睪丸細(xì)胞用含10%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含5%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含10%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；
2)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含5%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含2%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含5%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；
3)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含2%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含1%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含2%小牛血清的培養(yǎng)基`傳代培養(yǎng)3-5代；
4)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含1%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換無血清培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含1%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；
5)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代；
6)利用絕跡稀釋法篩選純系的細(xì)胞系:
①將細(xì)胞傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)；
②當(dāng)細(xì)胞貼壁后，留下只含有一個(gè)細(xì)胞的孔，拋棄其他孔；
③持續(xù)培養(yǎng)直至單細(xì)胞生長(zhǎng)成集落并布滿60%孔底，消化細(xì)胞并按對(duì)應(yīng)位置將一半細(xì)胞傳入另一 96孔板中；
④繼續(xù)培養(yǎng)，將其中一個(gè)96孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并保存細(xì)胞，另一個(gè)96孔板待細(xì)胞長(zhǎng)滿后接入豬瘟病毒，37 C吸附Ih后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
⑤在接毒后24h、36h、72h分別通過ELISA方法檢測(cè)病毒滴度，篩選出具有較好產(chǎn)毒能力的細(xì)胞系。
[0018]所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入了 lOPg/mL的肝素、1%的牛血清白蛋白和5%胰蛋白胨。
[0019]實(shí)施例2:細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞批庫建立
所馴化并篩選的無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞采DMEM培養(yǎng)基，添加慶大霉素，在細(xì)胞工廠或細(xì)胞發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，建立細(xì)胞工作種子批庫，并及對(duì)傳代后的外援源因子、致瘤性及穩(wěn)定性等全面檢定，細(xì)胞使用代數(shù)控制在40代以內(nèi)，均符合疫苗生產(chǎn)介質(zhì)的要求。
[0020]實(shí)施例3:細(xì)胞形態(tài)學(xué)及穩(wěn)定性鑒定
豬睪丸細(xì)胞無血清條件下37°C培養(yǎng)并連續(xù)傳代，每間隔24h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一次觀察，其貼壁情況及細(xì)胞形態(tài)都未發(fā)生改變。
[0021]實(shí)施例4:細(xì)胞無雜菌鑒定
將實(shí)施例2制備的豬睪丸細(xì)胞種子庫接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無菌生理鹽水做陰性對(duì)照，培養(yǎng)溫度為25 C、35 C。結(jié)果顯示細(xì)胞種子庫未見細(xì)菌生長(zhǎng)。將豬睪丸細(xì)胞種子庫分別用半流體和肉湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21天，次代培養(yǎng)21天，無菌生理鹽水做陰性對(duì)照，結(jié)果顯示細(xì)胞種子庫無支原體生長(zhǎng)。
[0022]實(shí)施例5:豬睪丸細(xì)胞豬瘟病毒增殖鑒定
將實(shí)施例2所制備的豬睪丸細(xì)胞連續(xù)傳代16次以上，按常規(guī)方法接入豬瘟病毒并按常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)，通過ELISA方法檢測(cè)其產(chǎn)毒能力沒有發(fā)生改變。所述豬瘟病毒為CLS株、GPE 株或 Thiverval 株。
[0023]實(shí)施例6:豬瘟病毒原液鑒定
將實(shí)施例5無血清條件下培養(yǎng)的豬瘟病毒通過Lorry法測(cè)定蛋白含量均在理論范圍；通過電鏡觀察豬瘟病毒顆粒直徑約40-45nm ;通過SDS-PAGE和WB檢測(cè)抗原蛋白成分存在，且無外源雜蛋白；通過免疫Balb/C小鼠I次血清中和抗體效價(jià)在3200以上；通過目測(cè)病毒原液的外觀為澄清液體；PH值為7.0-7.2 ;通過血平板進(jìn)行雜菌鑒定結(jié)果為陰性；通過半流體和肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行支原體鑒定結(jié)果為陰性。
[0024]實(shí)施例7:豬瘟病毒安全性鑒定
溶血性試驗(yàn):選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌3次，再將血細(xì)胞體積恢復(fù)并稀釋10倍。用注射用水將病毒原液分別做2倍、4倍、8倍稀釋，將豚鼠血細(xì)胞加入到稀釋的病毒液中,8小時(shí)后,評(píng)價(jià)血球溶解以目測(cè)或者上清濃度檢測(cè)為準(zhǔn)，并在570nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，沒有發(fā)生血球破裂，無溶血現(xiàn)象。說明無血清條件下生產(chǎn)的豬瘟病毒原液及所制備的疫苗無溶血反應(yīng)。
[0025]急性毒性試驗(yàn):取無血清培養(yǎng)的豬瘟病毒原液0.5ml腹腔注射體重為12~18gBalb/C小鼠，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、體重變化和存活率。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，沒有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行動(dòng)遲緩等不良癥狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明無血清培養(yǎng)的豬瘟病毒及制備的疫苗在試驗(yàn)的濃度下對(duì)動(dòng)物是安全的，且14天后處死進(jìn)行大體解剖檢查，未見臟器有病理改變。
[0026]過敏試驗(yàn)研究:取無血清培養(yǎng)的豬瘟病毒皮下接種體重為250~350g Hartley豚鼠，每個(gè)樣品接種豚鼠5只，每只接種0.5ml，隔日一次，共3次，同時(shí)做陰性對(duì)照。連續(xù)3周觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果表明豚鼠無死亡，且無鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過敏癥狀。因此，無血清培養(yǎng)的豬瘟病毒及所制備的疫苗在動(dòng)物體內(nèi)無過敏反應(yīng)。
[0027]最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)將豬睪丸細(xì)胞用含10%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含5%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含10%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代； 2)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含5%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含2%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含5%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代； 3)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含2%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換含1%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含2%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代； 4)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換含1%小牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)更換無血清培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)培養(yǎng)并且當(dāng)有細(xì)胞死亡并懸浮時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)用含1%小牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代； 5)當(dāng)細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)3-5代； 6)利用絕跡稀釋法篩選純系的細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法，其特征在于:所述步驟6)中，利用絕跡稀釋法篩選純系的細(xì)胞系的具體步驟為: ①將細(xì)胞傳入96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)； ②當(dāng)細(xì)胞貼壁后，留下只含有一個(gè)細(xì)胞的孔，拋棄其他孔； ③持續(xù)培養(yǎng)直至單細(xì)胞生長(zhǎng)成集落并布滿60%孔底，消化細(xì)胞并按對(duì)應(yīng)位置將一半細(xì)胞傳入另一 96孔板中； ④繼續(xù)培養(yǎng)，將其中一個(gè)96孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并保存細(xì)胞，另一個(gè)96孔板待細(xì)胞長(zhǎng)滿后接入豬瘟病毒，37 C吸附Ih后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)； ⑤在接毒后24h、36h、72h分別通過ELISA方法檢測(cè)病毒滴度，篩選出具有較好產(chǎn)毒能力的細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基為MEM培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基或1640培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基中加入2-10(^g/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖為硫酸肝素、硫酸軟骨素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基中加入lOPg/mL的糖胺聚糖，所述糖胺聚糖為肝素。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基中加入1%-10%的外源蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白和胰蛋白胨。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無血清培養(yǎng)豬睪丸細(xì)胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基中加入1%的牛血清白蛋白和5%胰蛋白胨。
8.一種利用權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)所述的方法得到的無血清培養(yǎng)的豬睪丸細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于:將豬瘟病毒接種于無血清培養(yǎng)的豬睪丸細(xì)胞并按常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的利用無血清培養(yǎng)的豬睪丸細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于:所述豬瘟病 毒為CLS株、GPE株或Thiverval株。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103602629SQ201310598989
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】李陽春, 曹政, 岳秀陽, 李春燕 申請(qǐng)人:重慶澳龍生物制品有限公司