一種用于分子標(biāo)記輔助育種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法，該方法包括：（1）將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；（2）將浸泡后的種子種植于病圃中；（3）選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；（4）分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進行PCR擴增，得到第一擴增產(chǎn)物和第二擴增產(chǎn)物；第一引物對如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示，第二引物對如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示；如果第一擴增產(chǎn)物中具有SEQ?ID?NO:5所示的核酸且第二擴增產(chǎn)物中具有SEQ?ID?NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。本發(fā)明對黃萎病菌的抗性進行預(yù)測和篩選，淘汰病圃篩選過程中雖不發(fā)病但仍為感病的植株，減少人力物力的浪費，提高育種效率。
【專利說明】一種用于分子標(biāo)記輔助育種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]棉花黃萎病是世界性的重大植物病害，常年給棉花生產(chǎn)造成10-15%的產(chǎn)量損失，嚴重年份超過全國植棉面積的60%，給棉花生產(chǎn)造成沉重打擊。其病原菌隨種子、殘枝敗葉和土壤傳播，菌核在土壤中可存活多年，化學(xué)藥物、耕作栽培等手段對其無效，被植物病理界稱為棉花的“癌癥”，成為長期以來懸而未決的世界性難題。培育抗病品種被公認為是解決棉花黃萎病最經(jīng)濟有效的手段，究其一直未能成功的原因是棉花黃萎病的抗性受多個主效基因共同控制的多基因控制遺傳模式，遺傳機制較為復(fù)雜(祁偉彥，張永軍，張?zhí)煺?，陳捷胤，戴小?基于人工病圃篩選和分子標(biāo)記輔助的棉花抗黃萎病育種方法研究與應(yīng)用.分子植物育種，2012，10(5):607-612;蔣鋒，趙君，周雷，郭旺珍， 張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病基因的分子標(biāo)記定位.中國科學(xué)，2009，39(9):849-861;葛海燕，汪業(yè)春，郭旺珍，張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病性狀的遺傳及分子標(biāo)記研究.棉花學(xué)報，2008, 20(I):19-22;Jiang F，Zhao J, Zhou L, Guo WZ, Zhang TZ.Molecular mapping of Verticillium wilt resistance QTL on chromosomes D7and D9in upland cotton.Science China SerC-Life Science, 2009，52 (9):872-884;楊扼，郭旺珍，張?zhí)煺?陸地棉抗黃萎病、纖維品質(zhì)和產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀的QTL定位.分子植物育種，2007,5(6):797-805)， 缺乏有效的可用于穩(wěn)定篩選和準確跟蹤其抗性基因的分子標(biāo)記，鑒定十分困難，導(dǎo)致棉花抗黃萎病育種進展緩慢。 [0003]早在20世紀40年代我國就開始棉花育種，50年代后開展雜交育種，當(dāng)時棉田病害輕，基本上根據(jù)產(chǎn)量表現(xiàn)選育品種。70年代后棉花枯萎病的發(fā)生逐漸加重，開始了抗枯萎病育種，但育種技術(shù)基本上采用自然感病試驗田進行抗病性鑒定，由于病原菌不足，田間發(fā)病不均勻，年份間差異大，育種親本和雜交后代材料鑒定結(jié)果不準確，材料當(dāng)選或淘汰盲目性較大。90年代后黃萎病發(fā)生漸趨嚴重，迫切需要培育抗黃萎病品種，但抗病性鑒定與選育仍然采用與抗枯萎病類似的方法，育種效率低，后代材料選擇不準確，育成品種抗病性差，且抗病品種產(chǎn)量較低。
[0004]棉花抗黃萎病分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)已經(jīng)在纖維品種改良、不育系改良等得到應(yīng)用，但在抗黃萎病品種選育上由于缺乏穩(wěn)定可靠、緊密連鎖的分子標(biāo)記，尚未應(yīng)用與生產(chǎn)實際。雷蒙德氏棉是對黃萎病高抗的野生棉種，也是栽培棉種陸地棉和海島棉的D染色體組的共同祖先，通過對雷蒙德氏棉基因組抗病基因的分析及其SSR標(biāo)記的系統(tǒng)開發(fā)，可以獲得在栽培棉種中穩(wěn)定遺傳的抗黃萎病基因簇及其連鎖的SSR標(biāo)記，進而對棉花育種過程中不同的材料、品系、品種進行早期世代篩選，淘汰不抗病的植株，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高育種和選擇效率，由此建立高效準確的棉花抗黃萎病選育技術(shù)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法，該方法包括:
[0007](I)將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過濾得到的菌懸液；
[0008](2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構(gòu)建的；
[0009](3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；
[0010](4)分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進行PCR擴增， 得到第一擴增產(chǎn)物和第二擴增產(chǎn)物；第一引物對如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物對如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；
[0011]如果第一擴增產(chǎn)物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二擴增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。
[0012]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對棉花植株對黃萎病菌抗性進行方便、快速地檢測。
[0013]本發(fā)明的其他 特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0015]圖1是品種名稱海島棉7124和軍棉I號的棉花植株的第一擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0016]圖2是品種名稱海島棉7124和軍棉I號的棉花植株的第二擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0017]圖3是12個初篩棉花植株的第一擴增產(chǎn)物電泳圖。
[0018]圖4是12個初篩棉花植株的第二擴增產(chǎn)物電泳圖。
【具體實施方式】
[0019]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0020]本發(fā)明提供了一種檢測棉花植株對黃萎病菌抗性的方法，該方法包括:
[0021](I)將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過濾得到的菌懸液；
[0022](2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構(gòu)建的；
[0023](3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；
[0024](4)分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進行PCR擴增， 得到第一擴增產(chǎn)物和第二擴增產(chǎn)物；第一引物對如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物對如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；[0025]如果第一擴增產(chǎn)物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二擴增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。
[0026]其中，如果第一擴增產(chǎn)物中不具有SEQ ID NO: 5所示的核酸或者第二擴增產(chǎn)物中不具有SEQ ID N0:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為感黃萎病植株。
[0027]其中，所述PCR擴增的條件可以包括:變性溫度為93.5-94.5°C ;退火溫度為 54.5-55.5。。。
[0028]其中，所述PCR擴增的條件還可以包括:PCR循環(huán)數(shù)為28-32輪。
[0029]其中，制備浸種液時，相對于每重量份的死于黃萎病的棉花植株的組織，水的用量可以為5重量份。
[0030]其中，用浸種液浸泡種子時，相對于每重量份的種子，浸種液的用量可以為2重量份。
[0031]其中，用浸種液浸泡種子的時間可以為6小時。
[0032]其中，構(gòu)建病圃時，相對于每平方米的土壤，死于黃萎病的棉花植株的組織的摻入量可以為3kg。
[0033]其中，待測棉花植株的基因組DNA可以通過常規(guī)的DNA提取方法從待測棉花植株中提取得到。
[0034]本發(fā)明可通過檢測分子標(biāo)記對棉花植株對黃萎病菌的抗性進行預(yù)測和篩選，淘汰病圃篩選過程中雖不發(fā)病但仍為感病的植株，減少人力物力的浪費，提高育種效率。
[0035]以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。
[0036]實施例1
[0037]I)收集31種棉種材`料，按照文獻(張興華，棉花抗枯、黃萎病研究進展及其抗性鑒定方法，江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，鑒定它們的抗病性，結(jié)果如表1中所列，其中，抗病種質(zhì)3份，在表1的抗黃萎病材料一欄表示為“R”；感病種質(zhì)28 份，在表1的感黃萎病材料一欄表不為“S”。
[0038](2)按照《分子克隆實驗指南》中的方法，分離每份種質(zhì)的基因組DNA。
[0039]以每份種質(zhì)的基因組DNA為模板，采用正向引物如SEQ ID NO:1所示(5' -AAACAA TMTAAACGAGTTGAATTA-3')且反向引物如SEQ ID NO:2所示(5' -TTGTTTCATAATTTTAAAGTA TGTA-3')的第一引物對進行PCR擴增，變性溫度為94°C ;退火溫度為55°C:PCR循環(huán)數(shù)為 30輪；分別得到每份材料的第一擴增產(chǎn)物。
[0040]以每份種質(zhì)的基因組DNA為模板，采用正向引物如SEQ ID N0:3所示(5' -AAGGGT AAGTAATAAATCATAGMC-3')且反向引物如SEQ ID N0:4所示(5' -GCATTTATCCATTTCTTTACT TTTC-3')的第二引物對進行PCR擴增，變性溫度為94°C ;退火溫度為55°C:PCR循環(huán)數(shù)為 30輪；分別得到每份材料的第二擴增產(chǎn)物。
[0041](3)按照《分子克隆實驗指南》中的方法，將步驟(2)中的第一擴增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測；圖1是品種名稱海島棉7124和軍棉I號的棉花植株的第一擴增產(chǎn)物電泳圖；與海島棉7124帶型一致的在表1的分子標(biāo)記檢測結(jié)果一欄中表示為“ + ” ；與軍棉I號帶型一致的在表1的分子標(biāo)記檢測結(jié)果一欄中表示為在海島棉7124的電泳圖中(圖1左泳道)，自上而下第3條帶的大小為185bp，經(jīng)測序的序列為SEQ ID NO: 5(AAAC AATMTAAACGAGTTGAATTAAAATGCTTTTGTAATTAMTGGGCATAAAAAGATAGACATTTTGCGAATCAACAAGACCATAAAATATATGAMATTTTMTATATATATATATGTATGTGTATGTACATAAAATATGAAAMAATATGTAGGTA TACATACTTTAAAATTATGAAACAA)，是相對于軍棉I號的差異條帶。
[0042]按照《分子克隆實驗指南》中的方法，將步驟(2)中的第二擴增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測；圖2是品種名稱海島棉7124和軍棉I號的棉花植株的第二擴增產(chǎn)物電泳圖；與海島棉7124帶型一致的在表1的分子標(biāo)記檢測結(jié)果一欄中表示為“ + ” ；與軍棉 I號帶型一致的在表1的分子標(biāo)記檢測結(jié)果一欄中表示為在海島棉7124的電泳圖中 (圖2左泳道)，自上而下第I條帶的大小為249bp，經(jīng)測序的序列為SEQ ID N0:6(5’_AAGGG TAAGTAATAMTCATAGAACACAATAATAATGACGTAATTATAATAATAATCACCAAATAATAATAACAATGACCATA TTAATTACTATTCTAATACTAAAAATATAAAAATGAATTMACACTMTAAAAATGATAATAATAAAATAATAATAAT AGTGATAATAATAATGAAATGTATAAATAAAGGAATAAATAACAATATAAATTCTAAACACAAGAAAAGTAAAGAAA TGGATAAATGC-3’)，是相對于軍棉I號的差異條帶。
[0043]表1
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測棉花植株對黃萎病抗性的方法，其特征在于，該方法包括:(1)將待測棉花植株的種子用浸種液浸泡；所述浸種液是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎，用水浸泡，過濾得到的菌懸液；(2)將浸泡后的種子種植于病圃中；所述病圃是將死于黃萎病的棉花植株的組織粉碎摻入土壤之后構(gòu)建的；(3)選擇能夠在病圃中存活的棉花植株作為初篩棉花植株；(4)分別使用第一引物對和第二引物對初篩棉花植株的基因組DNA進行PCR擴增，得到第一擴增產(chǎn)物和第二擴增產(chǎn)物；第一引物對如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物對如 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4 所示；如果第一擴增產(chǎn)物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二擴增產(chǎn)物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，則指示待測棉花植株為抗黃萎病植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述PCR擴增的條件包括:變性溫度為 93.5-94.50C ;退火溫度為 54.5-55.5°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述PCR擴增的條件還包括:PCR循環(huán)數(shù)為28-32輪。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，制備浸種液時，相對于每重量份的死于黃萎病的棉花植株的組織，水的用量為5重量份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中，用浸種液浸泡種子時，相對于每重量份的種子，浸種液的用量為2重量份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，用浸種液浸泡種子的時間為6小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的方法，其中，構(gòu)建病圃時，相對于每平方米的土壤，死于黃萎病的棉花植株的組織的摻入量為3kg。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602743SQ201310588981
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】戴小楓, 陳捷胤, 李蕾, 馬雪峰, 桂月晶, 孔志強, 包郁明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所