新型合成的ebv共識dna序列分子及由此組成的疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是三種合成的Epstein-Barr病毒（EBV）DNA序列，分別編碼三種共識（concensus）氨基酸序列EBNA1、LMP1和LMP2，這三種序列分別構(gòu)建于表達載體質(zhì)粒上以表達相應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明同時也提供了將一種或多種表達質(zhì)粒用于產(chǎn)生對抗相應(yīng)Epstein-Barr病毒（EBV）蛋白抗原免疫反應(yīng)的不同方法。
【專利說明】新型合成的EBV共識DNA序列分子及由此組成的疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)和免疫學【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及到EBV病毒表達蛋白EBNAULMPI和LMP2的共識序列克隆、密碼子優(yōu)化表達、以及注射并進入哺乳動物組織細胞內(nèi)的免疫方法，以達到誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)。產(chǎn)生細胞和體液免疫對抗EBV病毒感染或清除已感染的細胞或含EBV病毒蛋白的癌變細胞。
【背景技術(shù)】
[0002]在發(fā)達國家Epstein-Barr病毒(EBV)引起超過90%的傳染性單核細胞增多癥(IM)0 EBV通常通過口腔分泌物傳播，感染在咽喉部的B細胞，感染初期通常無癥狀或非特異性癥狀。然而，感染青少年或青年可導(dǎo)致頂，最新血清學研究顯示7596EBV陽性患者可導(dǎo)致IM0 [0003]EBV感染與多種腫瘤有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有84000例EBV相關(guān)的胃癌，78000例EBV相關(guān)的鼻咽癌，28000例EBV相關(guān)的霍杰金淋巴瘤(Fukayama M.Pathol Int60:337-50，2010.Parkin DM.1nt J Cancer 118:3030-44，2006)。在中國南部地區(qū)50 歲男人患鼻咽癌的幾率是 50/100，000 (de-The G.Epidemiology and control.NewYork: Plenum Medical Book C0.; p.935-67，1997)，鼻咽癌在北非也很普遍。EBV 也與其它腫瘤相關(guān)，比如鼻部NK/T細胞淋巴瘤和外周T細胞淋巴瘤。
[0004]EBV與免疫抑制病人的多種腫瘤發(fā)生相關(guān)，在器官移植病人中EBV淋巴瘤是繼皮膚癌后最常見的腫瘤。
[0005]EBV具有高度種屬特異性，僅感染人類。初步試驗研究發(fā)現(xiàn)狨猴也易于感染EBV患EBV淋巴瘤。以EBV主要糖蛋白gp350免疫狨猴可保護狨猴在EBV接種挑戰(zhàn)后不患EBV B細胞淋巴瘤。
[0006]EBV的gp350具有抗原性，可用來作為疫苗預(yù)防EBV感染和IM。EBV編碼多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)也可作為⑶4和⑶8 T細胞的靶標。目前仍不十分清楚哪幾種EBV病毒蛋白作為抗原(疫苗)可用來預(yù)防和治療EBV相關(guān)的腫瘤。在EBV相關(guān)的腫瘤中，可檢測到三種EBV蛋白質(zhì)的表達，它們分別是EBNA1、LMP1 和LMP2(Cohen JI et al.Sci Transl Med,3: 107fs7, 2011)。最近研究證明，利用來源于這三種蛋白的不同多肽或多肽重疊作為抗原誘導(dǎo)動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而篩選抗原簇用來作為鼻咽癌的免疫治療。
[0007]基因(DNA)疫苗是一種新型疫苗，由含編碼病原體或癌癥抗原片段的質(zhì)粒所組成，能使機體不但產(chǎn)生體液免疫(抗體)反應(yīng)，而且能產(chǎn)生細胞(T細胞)免疫細胞，具有預(yù)防和治療效果。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗有如下優(yōu)點:1)良好的安全性；2)易于生產(chǎn)，大大縮短了生產(chǎn)時間和降低了生產(chǎn)成本；3)優(yōu)越的穩(wěn)定性，易于分銷和長期貯存。目前有上百種DNA疫苗正在臨床試驗，比如宮頸癌DNA疫苗和通用大流感DNA疫苗均在臨床二期。
[0008]DNA疫苗的關(guān)鍵是如何使DNA分子大量進入細胞內(nèi)，從而表達抗原蛋白，誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞和體液免疫反應(yīng)。人們一直在尋找新的方法使其順利導(dǎo)入細胞。這些方法包括使用病毒或細菌載體、各種化學制劑如脂質(zhì)體、物理方法如超聲、激光、和電脈沖導(dǎo)入等。以病毒或細菌作為載體的轉(zhuǎn)染導(dǎo)入方法，雖然效率高，但會使機體產(chǎn)生對載體的免疫反應(yīng)，從而使再次轉(zhuǎn)染導(dǎo)入降低?；瘜W制劑脂質(zhì)體的導(dǎo)入效率有限，超聲和激光方法，目前仍然不夠成熟。體內(nèi)電脈沖導(dǎo)入是目前使用較為廣泛的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]在EBV相關(guān)的腫瘤細胞中，可檢測到EBV的三種蛋白質(zhì):EBNA1、LMP1和LMP2。來源于這三種蛋白的多肽或蛋白片段可誘導(dǎo)T細胞和B細胞免疫反應(yīng)(Cohen JI et al.SciTransl Med 3:107fs7, 2011; Li W et al.Protein Pept Lett 20:1136-43, 2013; JonesK et al.Blood 116:2245-52,2010)。本發(fā)明利用不同 EBV 病毒株的 EBNA1、LMP1 和 LMP2蛋白質(zhì)序列找出每一種蛋白質(zhì)的共識序列作為抗原誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)來對抗來自不同EBV病毒株的感染或消滅不同EBV病毒株相關(guān)的腫瘤細胞。
[0010]EBNAl的共識序列cEBNA中富含甘氨酸和丙氨酸的GGA區(qū)影響免疫遞呈(Lutzky VP et al.J Virol 84:407-417,2010; Levitskaya JM et al.Nature375:685-688, 1995)，在我們構(gòu)建的cEBNAl序列中不但去除了 GGA區(qū)，而且也去除了緊接其后的富含甘氨酸和精氨酸的GR區(qū)(90到366AA)，即cEBNAl AGGA&GR。
[0011]LMPl與EBV導(dǎo)致B細胞的轉(zhuǎn)化密切有關(guān)，表達在大多數(shù)EBV相關(guān)的腫瘤細胞中，它的C-末端含有兩個信號區(qū)CTARl和CTAR2，通過這兩個區(qū)，LMPl可調(diào)節(jié)多個基因的表達(Mosialos GM et al.Cell 80:389-399，1995 ;Thornburg NJ et al.J Virol 81:12954-961，2007)。LMPl 共識序列中我們?nèi)コ?CTARl 和 CTAR2 區(qū)，即cLMPl ACTAR1&CTAR2。
[0012]LMP2與LMPl —樣表達在大多數(shù)EBV相關(guān)的腫瘤細胞中，但發(fā)現(xiàn)LMP2與EBV導(dǎo)致B 細胞的轉(zhuǎn)化無關(guān)(Kathy HY et al.J Virol 86:5352-5365,2012)。LMP2 共識序列為全長序列，即cLMP2。
[0013]以上三種新的共識序列的N-末端與IgE或IgG的先導(dǎo)序列相連，共識序列的C-末端與HA標簽相連。再構(gòu)建到表達質(zhì)粒載體pVax (Life technology Co)上,在哺乳動物細胞中表達。
[0014]為了預(yù)防不同EBV病毒株的感染或治療不同EBV病毒株相關(guān)的腫瘤等疾病，我們所構(gòu)建的三種新的共識DNA疫苗可以以任何I種或2種或所有3種的組合方式進行免疫。免疫的方法有多種形式，包括基因槍、脂質(zhì)體、超聲波、紅外照射和體內(nèi)電脈沖等。
[0015]【具體實施方式】:
DNA疫苗的第一步是構(gòu)建高度表達的DNA質(zhì)粒，有效表達目標抗原蛋白。我們利用不同EBV病毒株EBNA1、LMPl和LMP2蛋白質(zhì)序列，找出每一種蛋白的共識新序列。這個新序列與原有的不同株蛋白序列有高度同源性，其同源性高于95%。我們得到的共識新序列分別為 cEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2 和 cLMP2。
[0016]共識新序列的N-末端與IgE先導(dǎo)序列相連，C-末端與HA標簽相連，其DNA編碼序列需進一步進行密碼子優(yōu)化，使其在哺乳動物細胞中高度表達。我們優(yōu)化后的序列經(jīng)DNA合成后，克隆到真核表達載體上(如pVax)。得到的質(zhì)粒表達載體進一步作酶切鑒證和在真核細胞中的目標蛋白表達鑒定。
[0017]如構(gòu)建的質(zhì)粒載體高度表達目標抗原蛋白，即我們可用這些質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫動物進行免疫反應(yīng)有效性驗證。將構(gòu)建的cEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2表達質(zhì)粒免疫小鼠，經(jīng)3次免疫后，檢測抗體(體液)免疫反應(yīng)和T細胞免疫反應(yīng)。用ELISA方法檢測針對EBNAl的抗體反應(yīng)，用ELISpot檢測針對LMPl和LMP2的CTL細胞免疫反應(yīng)。
[0018]實驗結(jié)果證實，三種共識序列DNA質(zhì)粒疫苗免疫動物后產(chǎn)生顯著的細胞和體液免疫，用來對抗EBV病毒感染或清除已感染的細胞或含EBV病毒蛋白的癌變細胞。這3種DNA疫苗可在猴身上做進一步的EBV挑戰(zhàn)實驗，為臨床試驗-EBV DNA疫苗預(yù)防EBV感染和治療EBV相關(guān)的癌癥如鼻咽癌等提供實驗數(shù)據(jù)。
[0019]實例1:共識序列cEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2表達載體的構(gòu)建和
表達鑒定。
[0020]根據(jù)不同EBV病毒株EBNA1、LMPl和LMP2蛋白質(zhì)的序列，找出每一種蛋白質(zhì)的共識序列，EBNAl和LMP2的共識序列均來源于EBV病毒株B95-8、AG876和⑶I ;LMP1的共識序列來源于病毒株B95-8、AG876、Cao,⑶I和Raji。在EBNAl共識序列中去除GGA和GR區(qū)域，即cEBNAl A GGA&GR。在LMPl共識序列中去除C-末端的CTARl和CTAR2區(qū)域，即cLMPl ACTAR1&2。cLMP2為全長共識序列。這三種蛋白的序列見說明書核苷酸和氨基酸序列表。
[0021]每一個蛋白質(zhì)的N-末端連接IgE的先導(dǎo)序列，C-末端連一個HA標簽序列。整個編碼核苷酸序列再進行密碼子優(yōu)化，然后全序列堿基合成(GeneArt, Germany),再連在表達載體PVax上，得到表達載體pcEBNAl A GGA&GR、pcLMPl A CTAR1&2和pcLMP2,見圖一和圖二。質(zhì)粒在大腸桿菌中大量擴 增后，進行大抽，將得到的質(zhì)粒DNA經(jīng)電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，經(jīng)過夜培養(yǎng)，制備細胞裂解物。裂解物經(jīng)SDS-PAGE分離后，用HA標簽抗體(CellSignaling Technology, USA)免疫印跡檢測蛋白質(zhì)的表達,如圖三所示,構(gòu)建的三種表達載體均表達相應(yīng)的目標蛋白。
[0022]實例2:三種質(zhì)粒 pcEBNAl A GGA&GR、pcLMPl A CTAR1&2 和 pcLMP2 免疫動物產(chǎn)生的
免疫應(yīng)答反應(yīng)。
[0023]Balb/c小鼠(六周齡)隨機分為三組(n =10)。兩組動物吸入異氟醚鎮(zhèn)靜，剃去背腹側(cè)毛，皮內(nèi)注射 DNA 疫苗(pcEBNAl A GGA&GR、pcLMPl A CTAR1&2 和 pcLMP2，各 IOug 在40ul IxPBS中)，其中一組注射后不作任何其它處理；另一組在注射后，緊接著用瞬息電脈沖處理注射 DNA 部位，100V/cm，2 次脈沖波(BTX ECM830, Harvard Apparatus, USA)。初次免疫后，再加強免疫2次，每次免疫的間隔為3周。分別在每次免疫前取血樣，分離血清，用于ELISA檢測抗體免疫反應(yīng)。最后一次免疫后I周，殺死小鼠，取脾臟分離脾單核細胞做ELISpot檢測細胞免疫反應(yīng)。
[0024]用免疫的小鼠血清進行ELISA檢測抗EBNAl的抗體反應(yīng)。Costar 96孔EIA / RIA板包被重組EBNAl蛋白(2ug/ml in PBS)，4°C過夜。洗滌后，用1.0%小牛血清白蛋白(BSA)在37°C封閉I小時，阻止非特異性結(jié)合。洗滌后，加入200 ul的用稀釋液1:50稀釋的血清樣品(稀釋緩沖液:0.2 % BSA和0.05%吐溫20的PBS )，然后從第一行中的每個樣品進打系列稀釋(1:3)，在37 C鮮育2小時后。隨后洗漆，在每孔中加入1:10，000稀釋的抗小鼠IgG -生物素(目錄號B9904，Sigma-Aldrich)，在37°C孵育I小時。洗滌后加入50ul的1:2000稀釋的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)(中杉金橋，北京)。在37°C孵育2小時。洗滌后，加入50ul的HRP底物(P9187，Sigma-Aldrich公司)，然后在黑暗中在室溫下溫育10分鐘，終止反應(yīng)，在450nm處讀取光密度(OD)。如果OD值高于免疫前血清的OD平均值X3+SD，被看作陽性，將陽性滴度繪制終點滴度圖。
[0025]最后一次免疫后I周，各組取三只小鼠，分離脾細胞。用紅細胞裂解緩沖液清除紅血細胞。得到單細胞懸液。酶聯(lián)免疫斑點檢測試劑盒購自R & D系統(tǒng)(明尼阿波利斯，明尼蘇達州)。酶聯(lián)免疫斑點板(96孔；Millipore公司，MA )包被捕獲抗小鼠干擾素Y抗體。在4 °C過夜孵育后，用封閉緩沖液封閉。洗滌后，將單核細胞按試劑盒要求加入到孔中，每一孔加入細胞2x105，并加入10 ug/ ml濃度的LMPl CTL多肽:TLLVDLLWL (DuraiswamyJ et al.Blood 101:3150-3156，2003)，LMP2 CTL 多肽:APYLFffLAA (Lutzky VP et al.J Virol 84:407-417, 2010; Pan JQ et al.Mol Cancer Ther 8:2754-2761，2009)。經(jīng)過夜培養(yǎng)后，洗滌96孔板，加入檢測干擾素Y抗體，室溫孵育2小時，洗滌，再加Avidin-HRP，室溫孵育I小時，加入底物顯色。室溫空氣干燥96孔板，利用ELISpot讀孔板讀取每孔斑點數(shù)目。
[0026]ELISA結(jié)果顯示，單純注射三種DNA疫苗不能有效的誘導(dǎo)EBNAl的抗體免疫反應(yīng)，而注射DNA疫苗后，立即應(yīng)用瞬息電脈沖，可導(dǎo)致DNA大量進入細胞內(nèi)表達，有效顯著誘導(dǎo)抗體免疫反應(yīng)見圖四。[0027]ELISpot結(jié)果進一步證實，利用瞬息電脈沖的DNA免疫，不但有效的誘導(dǎo)抗體(體液)免疫反應(yīng)，而且可有效誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)。免疫三次后DNA疫苗+瞬息電脈沖誘導(dǎo)針對cLMPl和cLMP2特異性的CTL細胞斑點數(shù)顯著高于單獨的DNA疫苗免疫組，見圖五。以上結(jié)果證明，EBV共識序列DNA疫苗借助瞬息電脈沖免疫能夠產(chǎn)生良好的細胞和體液免疫反應(yīng)，可用來預(yù)防和治療EBV的感染和EBV相關(guān)的鼻咽癌等疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1是表達共識序列cEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖(合成的DNA片段經(jīng)退火后連接在經(jīng)BamHI和xhol酶切的PVax載體上)
圖2是質(zhì)粒pcEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2的酶切鑒定圖(圖中1:沒經(jīng)酶切消化的pcEBNAl A GGA&GR ；2:經(jīng)BamHI和xhol酶切消化的pcEBNAl A GGA&GR片段；3和4:經(jīng) BamHI 和 xhol 酶切消化的 pcLMP2 和 pcLMPl A CTAR1&2)
圖3是質(zhì)粒表達鑒定圖(質(zhì)粒pcEBNAl A GGA&GR、pcLMP2和pcLMPl A CTAR1&2經(jīng)體外電轉(zhuǎn)到HEK293T細胞中，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，制備細胞裂解物，經(jīng)Western Blot用HA抗體驗證質(zhì)粒表達的蛋白質(zhì)。圖中的每一個箭頭表示相應(yīng)的共識蛋白表達)
圖4是小鼠抗-EBNAl抗體反應(yīng)的滴度檢測圖(編碼共識序列cEBNAl A GGA&GR、cLMP2和cLMPl A CTAR1&2的質(zhì)粒小鼠皮內(nèi)注射，一組是單獨的質(zhì)粒注射(單獨注射)，另外一組在注射后加以電脈沖處理(注射+電脈沖)。初次免疫后，在周3和周6再加強免疫2次。在時間點周0、3、6、8取血樣做ELISA檢測)
圖5是檢測針對LMPl和LMP2多肽的細胞免疫反應(yīng)圖(用編碼共識序列cEBNAl A GGA&GR、cLMP2和cLMPl A CTAR1&2的質(zhì)粒小鼠皮內(nèi)注射進行免疫3次，最后一次免疫后的第7天，取3只免疫的小鼠脾臟，同時取相同數(shù)量無處理的小鼠脾臟作為對照，制備脾單核細胞做ELISpot檢測。細胞培養(yǎng)中分別加入LMPl多肽:TLLVDLLWL和LMP2 CTL多肽:APYLFWLAA。按ELISpot說明書操作取得斑點數(shù)目結(jié)果)。
【權(quán)利要求】
1.三種新型共識DNA序列分別來源于EBV不同病毒株，這些病毒株主要包括B95-8、AG876、⑶l、Cao和Raji等等，這些序列經(jīng)密碼子優(yōu)化和合成后，構(gòu)建于表達載體中，在哺乳動物細胞中以表達相應(yīng)的新型共識(concensus)蛋白EBNA1、LMPl和LMP2 (簡稱cEBNAl、cLMPl和cLMP2)，以其中一種或多種質(zhì)粒免疫哺乳動物，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以對抗不同的EBV病毒株感染，或?qū)BV感染的細胞產(chǎn)生免疫殺傷作用。
2.權(quán)利要求1中cEBNAl、cLMPl和cLMP2質(zhì)粒編碼序列的N-末端與IgE或IgG的先導(dǎo)序列相連，再連在載體的啟動子后，編碼序列的C-末端連于PolyA序列。
3.權(quán)利要求2中每一DNA編碼序列均進行了密碼子優(yōu)化，以便使其易于高度表達。
4.權(quán)利要求2中cEBNAl序列來源于EBV不同病毒株如B95-8、AG876和⑶I等。
5.權(quán)利要求4中cEBNAl序列去除了GGA (甘氨酸-丙氨酸重復(fù)區(qū))區(qū)域，即cEBNAl AGGA。
6.權(quán)利要求5中cEBNAlA GGA序列進一步去除了 GR區(qū)序列(氨基酸-精氨酸區(qū)域)，即cEBNAlAGGA&GR。
7.權(quán)利要求2中 cLMPl序列來源于EBV不同病毒株，如B95-8、AG876、⑶l、Cao和Raji坐寸。
8.權(quán)利要求7中cLMPl序列中去除了C-末端CTARl和CTAR2區(qū)域，即cLMPl A CTAR1&2。
9.權(quán)利要求2中cLMP2序列來源于B95-8、AG876、⑶I等不同EBV病毒株。
10.表達質(zhì)粒cEBNAlA GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2，以一種或多種混合方式注射到皮內(nèi)或肌肉。
11.權(quán)利要求10中DNA質(zhì)?？梢砸运⑸睇}水、PBS或其他的化學制劑如脂質(zhì)體 為溶劑或載體注射到組織內(nèi)。
12.權(quán)利要求11中，注射組織內(nèi)質(zhì)粒DNA可借助超聲波、紅外照射、電脈電等物理方式增加組織細胞對DNA的吸收。
【文檔編號】C12N15/38GK103627714SQ201310588797
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】林峰, 吳炯 申請人:眾森源生物技術(shù)（江蘇）有限公司