一種啟動(dòng)子OsP003、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種啟動(dòng)子OsP003、制備方法及其應(yīng)用，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列為Seq?ID?No.1所示的核苷酸序列或?yàn)榕cSeq?ID?No.1互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控單子葉植物中目的基因的表達(dá)，為研究單子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種啟動(dòng)子0sP003、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種啟動(dòng)子，以及該啟動(dòng)子的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]啟動(dòng)子是指基因中一段可與RNA聚合酶及其它一些影響轉(zhuǎn)錄的反式因子結(jié)合實(shí)現(xiàn)精確有效起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列。植物基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度受啟動(dòng)子的控制，啟動(dòng)子的克隆及功能分析是植物基因表達(dá)調(diào)控研究的重要內(nèi)容，也是植物基因工程研究的一個(gè)重要方面。 [0003]根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類(lèi):組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒(méi)有明顯差異，因而稱(chēng)之組成型啟動(dòng)子。雙子葉植物中最常使用的組成型啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子。，雙子葉植物中的一些強(qiáng)效啟動(dòng)子如CsVMV(Cassava VeinMosaic Virus)啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動(dòng)子等高效啟動(dòng)子，在單子葉植物中也有很強(qiáng)的基因調(diào)控作用。
[0004]人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動(dòng)子。例如肌動(dòng)蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的啟動(dòng)子已被克隆。用這些啟動(dòng)子代替CaMV35S啟動(dòng)子，可以更有效地在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶P亞基基因和植物光敏色素基因中克隆了相應(yīng)啟動(dòng)子，用其代替CaMV35S啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也取得了很好的表達(dá)效果(Plant biotechnology, 2002,19 (I):19-26)。
[0005]單子葉植物基因中常見(jiàn)的啟動(dòng)子有:Ubi啟動(dòng)子(Plant ubiquitinpromoter)、Actin 啟動(dòng)子(Plant Actin promoter)和 Adh-1 啟動(dòng)子(Maize alcoholdehydrogenaselpromoter)。Ubi啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動(dòng)子序列，包括玉米基因組中的Ub1-1啟動(dòng)子、水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子、擬南芥泛素啟動(dòng)子、向日葵泛素UbBl啟動(dòng)子、煙草泛素Ub1.U4啟動(dòng)子、馬鈴薯泛素Ubi7啟動(dòng)子、番爺泛素Ubil-1啟動(dòng)子,大麥泛素Mubl啟動(dòng)子。玉米泛素Ub1-1啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動(dòng)子在水稻和甘蔗中也有較多的應(yīng)用。Actin啟動(dòng)子1990年由康奈爾大學(xué)的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn),屬于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子。Actin啟動(dòng)子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過(guò)其他單子葉植物尋找Actin啟動(dòng)子,并成功在香蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動(dòng)子由于對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)調(diào)控作用，在單子葉植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。Adh-1啟動(dòng)子調(diào)控ADH(alcohol dehydrogenase)基因,對(duì)植物在缺氧環(huán)境下乙醇脫氫酶的表達(dá)至關(guān)重要。Adh-1啟動(dòng)子對(duì)單子葉植物特別是谷類(lèi)植物如水稻、燕麥和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比CaMV (花椰菜花葉病毒CaMV) 35S啟動(dòng)子提高10-50倍。Adh-1啟動(dòng)子主要應(yīng)用于單子葉植物，對(duì)絕大部分雙子葉植物基因表達(dá)的調(diào)控效果都很有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明通過(guò)對(duì)水稻基因組的深入研究，提供了一種新的啟動(dòng)子0sP003，所述啟動(dòng)子能夠用于調(diào)控單子葉植物中目的基因的表達(dá)，同時(shí)為研究單子葉植物中目的基因表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種新的啟動(dòng)子，能夠在植物中調(diào)控基因的表達(dá)。
[0008]本發(fā)明的又一目的是提供一種含有上述啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞及植物愈傷組織、植物外植體或植物。
[0009]本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述啟動(dòng)子的引物、制備方法，以及利用該啟動(dòng)子調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法。
[0010]本發(fā)明的再一目的是提供一種轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，以及上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞、或植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途。
[0011]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0012]本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列:
[0013]a、Seq ID N0.1所示的核苷酸序 列；
[0014]b、與Seq ID N0.1互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0015]C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
[0016]d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；
[0017]e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90 %同一性的核苷酸序列。
[0018]本發(fā)明還公開(kāi)了一種核酸構(gòu)建體，包含上述啟動(dòng)子，以及與啟動(dòng)子可操作連接的基因序列，上述啟動(dòng)子與基因序列來(lái)源相同或者不同。
[0019]本發(fā)明還公開(kāi)了一種載體，該載體含有上述啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體，優(yōu)選地，該載體為上述啟動(dòng)子或上述的核酸構(gòu)建體與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
[0020]本發(fā)明還公開(kāi)了一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞含有上述的啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體或載體，優(yōu)選地，該重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
[0021]本發(fā)明還公開(kāi)了含有上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞的植物愈傷組織、植物外植體或植物，該植物優(yōu)選為單子葉植物，再優(yōu)選為稻屬，更優(yōu)選為水稻，進(jìn)一步優(yōu)選為水稻日本晴。
[0022]本發(fā)明還公開(kāi)了一組引物對(duì)，用于擴(kuò)增得到上述啟動(dòng)子，該引物對(duì)的兩條引物分別含有Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列，優(yōu)選地，該兩條引物在5’端還分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基，更優(yōu)選地，該引物對(duì)的兩條引物分別具有Seq ID No:4和Seq ID No:5所不的序列。
[0023]本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備Seq ID N0.1啟動(dòng)子的方法，該方法包括，以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，該擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO:1在水稻日本晴基因組gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)，擴(kuò)增引物為上述技術(shù)方案所述的引物對(duì)。[0024]本發(fā)明還公開(kāi)了一種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，該方法為，將上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞；優(yōu)選導(dǎo)入植物愈傷組織；優(yōu)選地，植物愈傷組織是通過(guò)上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體或載體的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的；優(yōu)選地，植物為單子葉植物，再優(yōu)選為稻屬，更優(yōu)選為水稻，進(jìn)一步優(yōu)選為水稻日本晴。
[0025]本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，為:在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞或植物愈傷組織或植物外植體或植物；優(yōu)選地，植物愈傷組織或植物外植體或植物含有上述啟動(dòng)子或核酸構(gòu)建體或載體或重組細(xì)胞；該植物優(yōu)選為單子葉植物，再優(yōu)選為稻屬，更優(yōu)選為水稻，更優(yōu)選為粳稻，進(jìn)一步優(yōu)選為水稻日本晴。
[0026]本發(fā)明還公開(kāi)了上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體、重組細(xì)胞或植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途，優(yōu)選植物是單子葉植物，再優(yōu)選的植物為稻屬，更優(yōu)選植物為水稻，進(jìn)一步優(yōu)選植物為水稻日本晴。
[0027]由于采用了以上技術(shù)方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于:
[0028]本發(fā)明提供的新的啟動(dòng)子能夠在植物中調(diào)控基因表達(dá)，并且，在單子葉植物如水稻幼苗的根、幼苗等中具有啟動(dòng)子功能，而在成熟植株中沒(méi)有檢測(cè)出啟動(dòng)子的功能，能夠調(diào)控外源基因的表達(dá)，從而為研究單子葉植物中目的基因的表達(dá)提供了一種新的工具和選擇。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為用于 構(gòu)建p8質(zhì)粒的pGAMBIA-1301質(zhì)粒示意圖；
[0030]圖2為p8質(zhì)粒示意圖；
[0031]圖3為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的⑶S染色結(jié)果；3_a:帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P003序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P003轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織；3-b:不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻愈傷組織；
[0032]圖4為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻幼苗的GUS染色結(jié)果；4_a:帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P003序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P003轉(zhuǎn)化的水稻幼苗；4-b:不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8質(zhì)粒的水稻幼苗；
[0033]圖5為經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻根的GUS染色結(jié)果；5_a:帶有本發(fā)明所述啟動(dòng)子P003序列的重組根癌農(nóng)桿菌P8+P003轉(zhuǎn)化的水稻根；5-b:不帶有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻根。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0035]本發(fā)明提供一種能夠在植物中調(diào)控基因表達(dá)的啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列:
[0036]a、Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0037]b、與Seq ID N0.1互補(bǔ)的核苷酸序列；
[0038]C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
[0039]d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；[0040]e、與上述a或b所不核苷酸序列具有至少90%同一丨丨生的核苷酸序列。
[0041]本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“單子葉植物”具體地可以為稻屬植物例如水稻，包括但不限于日本晴、中花10、中花11、丹江8號(hào)、云稻2號(hào)、皖稻90、皖稻92、皖稻201、津原101、汕優(yōu)608
坐寸o
[0042]在本發(fā)明中，所述的高等嚴(yán)緊條件下與Seq ID N0.1所示或與其互補(bǔ)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其具有與Seq ID N0.1所示核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。
[0043]在本發(fā)明中，所述對(duì)Seq ID N0.1或與其互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5 '端和/或3 ’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過(guò)2-45個(gè)，或不超過(guò)3-20個(gè)，或不超過(guò)4-15個(gè)，或不超過(guò)5-10個(gè)，或不超過(guò)6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。
[0044]在本發(fā)明中，所述對(duì)Seq ID N0.1或與其互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行如上述行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，具有與Seq ID N0.1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。
[0045]通過(guò)一種多核苷酸進(jìn)行說(shuō)明，其所具有的核苷酸序列，例如與Seq ID N0.1的參考核苷酸序列至少90%同一性是指:在Seq ID N0.1的參考核苷酸序列的每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)10個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同。即為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少90%相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)10%的核苷酸可以被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列總核苷酸的10% ;或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合。
[0046]在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法，以BLAST和BLAST2.0 算法為例，它們分別描述在 Altschul 等(1977) Nucl.Acid.Res.25:3389-3402和Altschul等(1990) J.Mol.Bi`0.215:403-410。采用文獻(xiàn)中所述或默認(rèn)參數(shù)，BLAST和BLAST2.0可用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。
[0047]在本發(fā)明中，所述與Seq ID N0.1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列，包括與Seq ID N0.1或與其互補(bǔ)的核苷酸序列所公開(kāi)序列基本同一的多核苷酸序列，例如，當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性，優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與Seq ID N0.1所示核苷酸序列或與其互補(bǔ)的核苷酸序列具有至少90%同一丨丨生的核苷酸序列具有與Seq ID N0.1所不核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。
[0048]本發(fā)明還公開(kāi)了一種核酸構(gòu)建體，包括上述啟動(dòng)子，以及與該啟動(dòng)子可操作連接的基因序列。“可操作連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸區(qū)域或核苷酸序列的功能性空間排列。在本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體中，啟動(dòng)子被置于基因核酸序列的某個(gè)特定位置，所述基因一般是需要提高轉(zhuǎn)錄水平的任何核酸序列，或者，可設(shè)計(jì)本發(fā)明所述啟動(dòng)子和基因以便下調(diào)特定核酸序列。即通過(guò)將啟動(dòng)子與反義方向基因相連來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所屬基因優(yōu)選為GUS基因。
[0049]本發(fā)明還涉及一種含有上述啟動(dòng)子或上述核酸構(gòu)建體的載體。本發(fā)明的載體可以是通過(guò)將上述啟動(dòng)子或上述核酸構(gòu)建體插入到克隆載體或表達(dá)載體而得到的重組載體。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的表達(dá)載體。在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明含有所述啟動(dòng)子的載體為上述啟動(dòng)子與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體，優(yōu)選的，本發(fā)明的重組載體為PMD18-T+P003重組載體或者p8+P003重組載體。
[0050]本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明所述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體或載體的重組細(xì)胞。本發(fā)明的重組細(xì)胞可以通過(guò)將上述含有本發(fā)明所述啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到的。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞包括但不限于，例如:大腸桿菌細(xì)胞，根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞等。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述重組細(xì)胞為重組根癌農(nóng)桿菌。
[0051]本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種植物愈傷組織或植物外植體或植物，所述愈傷組織、植物外植體或植物含有本發(fā)明的上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞。本發(fā)明的植物愈傷組織是單子葉植物愈傷組織，如水稻愈傷組織。
[0052]本發(fā)明還進(jìn)一步涉及用于PCR擴(kuò)增得到本發(fā)明所述啟動(dòng)子的一組引物對(duì)，該組引物對(duì)含有序列表中Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列。為了便于操作，通常優(yōu)選在引物的5’端還設(shè)計(jì)連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基。在本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中，所述引物對(duì)的兩條引物分別具有Seq ID No:4和Seq ID No:5所示的序列。
[0053]采用上述引物，以水稻日本晴基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠制備得到本發(fā)明的啟動(dòng)子。
[0054]本發(fā)明還進(jìn)一步公開(kāi)了一種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，該方法包括:將上述啟動(dòng)子、核酸構(gòu)建體、載體或重組細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞。優(yōu)選的是通過(guò)將同時(shí)含有外源基因以及本發(fā)明啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞來(lái)達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。所述核酸構(gòu)建體中，外源基因與本發(fā)明所述的啟動(dòng)子可操作地連接。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，可利用含有目的外源基因與本發(fā)明啟動(dòng)子的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，再將得到的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物愈傷組織，從而實(shí)現(xiàn)將所述外源基因與本發(fā)明啟動(dòng)子一起導(dǎo)入植物細(xì)胞的目的。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方式中，外源基因優(yōu)選為GUS基因。本發(fā)明的植物為單子葉植物。
`[0055]在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因及所述啟動(dòng)子插入到植物基因中，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周知，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其轉(zhuǎn)化技術(shù)也可用于本發(fā)明啟動(dòng)子和外源基因的導(dǎo)入。當(dāng)然，適于本發(fā)明的啟動(dòng)子和外源基因?qū)氲牧硪环N方法是粒子轟擊，(即顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開(kāi)發(fā)。另外，還可以采用的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。金銀轉(zhuǎn)化后，采用通用的方法來(lái)篩選和再生整合有表達(dá)單元的植株。
[0056]本發(fā)明的啟動(dòng)子及調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，可以應(yīng)用于植物品種的選育。例如，可用于水稻的育種。在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述水稻為日本晴。
[0057]本發(fā)明所述的啟動(dòng)子可稱(chēng)為一種新的啟動(dòng)子，作為植物(特別是單子葉植物)轉(zhuǎn)基因的工具啟動(dòng)子，為開(kāi)展低表達(dá)基因轉(zhuǎn)化苗篩選、植物花器官敗育等分子育種研究提供便利，從而極大地縮短優(yōu)良品種的選育時(shí)間。
[0058]本發(fā)明中，單子葉植物具體可以為禾本科植物，更具體的，可為稻屬植物，例如水稻，包括但不限于日本晴。
[0059]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明范圍的限定。實(shí)施例中未注明的具體技術(shù)或條件，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如，參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)，或按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商的，均為可通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0060]實(shí)施例1:P003啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增和pMD18-T+P003重組載體的構(gòu)建。
[0061]一、P003啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增:
[0062]使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目錄號(hào):DP320-02)提取水稻日本晴(已在申請(qǐng)?zhí)枮?00910238992.0、發(fā)明名稱(chēng)為“一種啟動(dòng)子Bg1sP587、其制備方法及用途”的發(fā)明申請(qǐng)中保藏，并于2010年9月22日公開(kāi)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:P200910)的基因組DNA，根據(jù)該啟動(dòng)子在水稻日本晴gDNA中的序列，分別在首尾設(shè)計(jì)一對(duì)PCR特異性擴(kuò)增引物(上游引物F1，加限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和保護(hù)堿基，下游引物R1，加限制性酶切位點(diǎn)SbfI和保護(hù)堿基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA為模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa, DRR100B)聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如表1所示。
[0063]表1基因啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR體系
【權(quán)利要求】
1.一種啟動(dòng)子，其特征在于，所述啟動(dòng)子含有選自以下任意一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列: a、SeqID N0.1所示的核苷酸序列； b、與SeqID N0.1互補(bǔ)的核苷酸序列； C、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列； d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列； e、與上述a或b所不核苷酸序列具有至少90%同一丨丨生的核苷酸序列。
2.—種核酸構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，以及與啟動(dòng)子可操作連接的基因序列，所述啟動(dòng)子與所述基因序列來(lái)源相同或者不同。
3.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體；優(yōu)選地，所述載體為權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體與pMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體。
4.一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述的載體；所述重組細(xì)胞為重組大腸桿菌細(xì)胞或重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。
5.一種含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子、權(quán)利要求2所述核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求3所述載體、權(quán)利要求4所述重組細(xì)胞的植物愈傷組織、植物外植體或植物；所述植物為單子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為稻屬；優(yōu)選地，所述植物為水稻；優(yōu)選地，所述植物為水稻日本晴。
6.一組引物對(duì)，所述引物對(duì)用于擴(kuò)增得到權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于，所述引物對(duì)的兩條引物分別含有Seq ID No:2和Seq ID No:3所示的序列；所述的兩條引物在5’端分別連接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基；優(yōu)選地，所述引物對(duì)的兩條引物分別具有Seq ID No:4和Seq IDNo:5所示的序列。
7.一種制備權(quán)利要求1中所述Seq ID N0.1啟動(dòng)子的方法，其特征在于，該方法包括，以水稻日本晴基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ IDNO:1在在水稻日本晴gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)；優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物為權(quán)利要求6所述的引物對(duì)。
8.—種調(diào)控植物中基因表達(dá)的方法，其特征在于，該方法包括，將權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述的載體或權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞；所述植物為植物愈傷組織；優(yōu)選地，所述植物愈傷組織是通過(guò)具有權(quán)利要求I所述啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述載體的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的；優(yōu)選地，所述植物為單子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為稻屬；優(yōu)選地，所述植物為水稻；優(yōu)選地，所述植物為水稻日本晴。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞或植物愈傷組織或植物外植體或植物；優(yōu)選地，所述植物愈傷組織或植物外植體或植物含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述的載體或權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞；優(yōu)選地，所述植物為單子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為稻屬；優(yōu)選地，所述植物為水稻；優(yōu)選地，所述植物為水稻日本晴。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子或權(quán)利要求2所述核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求3所述載體或權(quán)利要求4所述重組細(xì)胞或權(quán)利要求5所述植物愈傷組織或植物外植體或植物在調(diào)控植物中目的基因表達(dá)或植物育種中的用途；優(yōu)選地，所述植物為單子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為稻屬；優(yōu)選地， 所述植物為水稻；優(yōu)選地，所述植物為水稻日本晴。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103614376SQ201310521304
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】汪杰, 黃剛, 焦偉剛, 閆智慧, 辛宜, 廖加濤, 張厚寶, 拓慶榮, 楊爽 申請(qǐng)人:華大基因楊凌創(chuàng)新研究院有限公司