具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列，屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域。根據(jù)本發(fā)明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以從海蚯蚓的消化道組織中克隆該蛋白酶的編碼基因。該編碼基因通過基因重組技術(shù)，可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)。本發(fā)明的重組海蚯蚓蛋白酶能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，具有研究開發(fā)前景。
【專利說明】具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種海蚯蚓蛋白酶，具體地說是一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列，屬于醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蚯蚓，又名地龍，作為中國(guó)傳統(tǒng)藥物已應(yīng)用2000多年。蚯蚓具有活血化瘀、清熱解毒、提高機(jī)體免疫功能的作用，長(zhǎng)期以來可用于細(xì)菌、病毒感染性疾病、免疫性疾病的治療。近年來蚯蚓提取物的抑制血小板凝聚、溶解血栓的作用使其用于心血管疾病的臨床治療。另外，從蚯蚓中還提取到抗腫瘤活性的物質(zhì)，多為蛋白酶組分，它能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并且作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，具有輻射增效和化學(xué)增效作用。實(shí)驗(yàn)及臨床研究證明蚯蚓提取物可以從多個(gè)方面抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望成為新型抗腫瘤藥物.海洋生物海艇蝴(Arenicola cristata)與艇蝴同屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門，但綱目科不同。海蚯蚓為多毛綱小頭蟲目沙蠣科，形似蚯蝴，生活于潮間帶多沙地帶，營(yíng)管居生活，故名海蚯蚓，主要分布于我國(guó)渤海、黃海沿岸。海蚯蚓始載于《中國(guó)藥用動(dòng)物志》，用于癰瘡腫毒，有清熱解毒之功效。目前對(duì)海蚯蚓的研究方向主要集中在其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝、營(yíng)養(yǎng)成分分析等方面。根據(jù)蚯蚓目前的研究狀況，我們推測(cè)在海蚯蚓體內(nèi)也存在多種蛋白酶，充分研究這些蛋白酶具有廣闊的應(yīng)用前景。但除了我們實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一個(gè)基因序列(ZL201210236225.8)外，尚沒有其他海蚯蚓蛋白酶新基因序列的報(bào)道。我們對(duì)已報(bào)道的環(huán)節(jié)動(dòng)物門Jfe丘蝴fetida DQ836917.Eisenia fetidaY^AVMSA八、Lumbricusrubellus U25647.1)和單環(huán)刺婦(CrecAi1S unicinctus HM623463.1) cDNA 序列進(jìn)行多重比對(duì)，采用同源序列克隆法，通過3' RACE、5' RACE技術(shù)，獲得了一種編碼具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
以來自海蚯蚓消化道上皮細(xì)胞的mRNA為模板，采用同源序列克隆法，通過3' RACE、5' RACE技術(shù)，獲得了一種編碼具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。將該序列表達(dá)活性肽的部分克隆到表達(dá)載體上，在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的重組海蚯蚓蛋白酶。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，可作為新型的基因工程藥物。
[0005]海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆:
(I)設(shè)計(jì)引物:根據(jù)環(huán)節(jié)動(dòng)物門蚯蚓和單環(huán)刺縊的蛋白酶較保守序列設(shè)計(jì)引物。
[0006](2)目的基因cDNA 3'端序列擴(kuò)增及測(cè)序:由步驟(1)得到引物，和來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，通過3' RACE (cDNA3/末端快速擴(kuò)增技術(shù))擴(kuò)增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3'端序列。PCR產(chǎn)物膠回收后分別連TA克隆載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌E.coli DH5 α，測(cè)序。
[0007](3)目的基因cDNA 5'端序列擴(kuò)增及測(cè)序:根據(jù)獲得的目的基因cDNA 3'端序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，以來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，采用5' RACECcDNA 5'末端快速擴(kuò)增技術(shù))，進(jìn)行套式PCR，擴(kuò)增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5'端序列。PCR產(chǎn)物膠回收后分別連TA克隆載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌E.coli DH5a，測(cè)序。 [0008](4)拼接:應(yīng)用contigexpress軟件對(duì)步驟(2)和(3)得到的目的基因cDNA 3'端和5'端序列進(jìn)行拼接，獲得本發(fā)明的海蚯蚓蛋白酶編碼基因的DNA (mRNA)序列。
[0009](5)根據(jù)上述步驟(4)得到的DNA (mRNA)序列，使用DNAMAN軟件，獲得該海蚯蚓蛋白酶cDNA編碼的氨基酸序列。
[0010]一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的編碼基因序列，該序列如下:
IGGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGGGGGGGG GGGGGGATCT TGCTGGATTG TTGACAACCA
61JGCTGAGGGC TGTTGTTTTC TCCTTGGTCC TGATCGGCAC CCTTGCCGAG GACAAATATG
121 CATACCAGAC CCGTTGGGAC TCAGATTGCG GTTATAGTCA GTTTGCTGAT GCTGGCCGTG 181 AACTGCCAGA CCCAGGTCCA GTCTGCCCAG GAAGGACTCC AGGAGAATAC ATTGTTTGTG 241 GGTGGGAGGC CCGAGTCCAT GAGTTCCCCT ACCAGGGACT GCTGTACTAT TTTGGAAGCC 301 TGAGATGTGG AGCTGTGCTG ATCACCCCTG ACTATGTTCT GACTGCTGCT CACTGCACCA 361 GTAATATTGG TGCCAGCAGC CTCCAGATTG GAATTGGTGA GCACCAAAGG AATTCTCCTC 421 CTAGTGAGAG GCAAATCTAC CAAGTTGCCC AGGTTATCAA CCACCCTAAC TACAGCCCCA 481 GCACCATCCA GCATGATATT GCTGTCCTCC GTCTCACCAC CAGTGTTGTT TATGGAGACC 541 ATGCAAACCC TGCCTGCCAA CCTGGTGGTG GTGGCAATGA GTATGCTGGT CAMCTTGCC 601 ATGTCAGTGG ATGGGGCAGC ACCCGCTCTG GAGGCTCTGT CACTCAGGAG CTTCGCTACA 661 CCAACMGCC AGTTATGAGC TATGCTGCCT GTCAAGCCTC TCAGTCTGGC ATCTTGTCTG 721 GTATGTTGTG TGCTGGAGAA CCCCCATATT ACAGGGATGC CTGCCAGGGT GACTCTGGTG 781 GCCCATTGGC TGTGAAAGTT AACGGAAAAC TGGAGGTTGT TGGTCTGGTG TCTTGGGGCT 841 ATGGCTGTGC TGGCTCTACT CCCGGAGTCT ACAATGAGGT CTACTCATAT GTTGACTGGG 901 TTAATAGCGT AATCGGTTAACATGGCAATG TTAACATGGC AATAAATGAA CTGCTGATCA 961 TGTAAAAAAA AAAAAAAAAA GTACTAGTCG ACGCGTGGCC 序列中劃線黑體標(biāo)示的ATG為起始密碼子，劃線黑體標(biāo)示的TAA為終止密碼子。
[0011]以上序列為編碼海蚯蚓蛋白酶的原始cDNA序列，通過基因工程的方法可對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的衍生序列。該衍生序列包括新分離的具有與以上所述結(jié)構(gòu)同樣基本結(jié)構(gòu)的基因序列以及使用體外DNA操作技術(shù)通過堿基的置換、插入、缺失獲得的該基因序列的各種突變體。
[0012]根據(jù)海蚯蚓蛋白酶的原始cDNA序列，得到一種具有溶栓活性的海蚯蚓蛋白酶的氨基酸序列。該序列如下:
IMLRAVVFSLV LIGTLAEDKY AYQTRffDSDC GYSQFADAGR ELPDPGPVCP GRTPGEYIVC
61GWEARVHEFP YQGLLYYFGS LRCGAVLITP DYVLTAAHCT SNIGASSLQI GIGEHQRNSP
121 PSERQIYQVA QVINHPNYSP STIQHDIAVL RLTTSVVYGD HANPACQPGG GGNEYAGQTC 181 HVSGffGSTRS GGSVTQELRY TNKPVMSYAA CQASQSGILS GMLCAGEPPY YRDACQGDSG241 GPLAVKVNGK LEVVGLVSffG YGCAGSTPGV YNEVYSYVDff VNSVIG劃線標(biāo)示部分(MLRAVVFSLV LIGTLA)為該蛋白酶的信號(hào)肽序列。黑體⑶SGGP為絲氨酸蛋白酶家族的高度保守序列。
[0013]該序列為海蚯蚓蛋白酶的原始氨基酸序列，通過改構(gòu)可得到一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的氨基酸序列的衍生序列，包括在原始氨基酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、插入、缺失等形成的各種變構(gòu)體。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:根據(jù)本發(fā)明的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，可以從海蚯蚓消化道組織總cDNA中克隆該酶的編碼基因。通過基因重組技術(shù)，使該酶的編碼基因在原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)或真核表達(dá)系統(tǒng)(如酵母細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)。重組海蚯蚓蛋白酶具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性，可作為潛在的新型抗腫瘤藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為海艇蚓蛋白酶全長(zhǎng)cDNA序列克隆的實(shí)驗(yàn)步驟流程圖。
[0016]圖2為環(huán)節(jié)動(dòng)物門蚯蚓和單環(huán)刺縊蛋白酶的較保守序列一引物設(shè)計(jì)區(qū)。
[0017]圖3為海蚯蚓蛋白酶重組蛋白表達(dá)純化及活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)步驟流程圖。
[0018]圖4為海蚯蚓蛋白酶編碼序列在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE分析圖。
[0019]圖5為純化的重組海蚯蚓蛋白酶的SDS-PAGE分析圖。
[0020]圖6為表1重組海蚯蚓蛋白酶的抗腫瘤活性測(cè)定。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1
海蚯蚓蛋白酶全長(zhǎng)cDNA的克隆及序列測(cè)定。
[0023]實(shí)驗(yàn)材料:
1.海蚯蚓，采自煙臺(tái)市近海；
2.Trizol試劑、3' RACE試劑盒、5 ' RACE試劑盒(北京吉百特)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(fermentas 公司)，T_A Easy 試劑盒、Wizard 純化 DNA 試劑盒、DNase、Rnase H (Promega公司)，高保真Taq酶(大連寶生物)。
[0024]實(shí)驗(yàn)方法:如圖1所示，包括以下步驟:
1.設(shè)計(jì)引物序列:3R為含接頭引物序列的反轉(zhuǎn)錄引物；3R1為3'端接頭引物；3F1是根據(jù)環(huán)節(jié)動(dòng)物門蚯蚓和單環(huán)刺縊蛋白酶的較保守序列(如圖2:1，2，3，4分秘% Eiseniafetida DQ836917.\、Eisenia /e^io{3DQ418454.1Xumbricus rubellus U25647.\、Urechisunicinctus HM623463.1)設(shè)計(jì)的引物。5R為 oligodT 反轉(zhuǎn)錄引物。5R1、5R2 是根據(jù):V RACE獲得的3'端序列設(shè)計(jì)的特異性引物；5F1為含5'端接頭引物序列的引物；5F2為5'端接頭引物。
【權(quán)利要求】
1.一種具有抗腫瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，其特征在于，此序列由1000個(gè)堿基對(duì)組成，此核苷酸序列為:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列，其編碼蛋白質(zhì)的特征在于:由286個(gè)氨基酸組成，其氨基酸序列如下:
【文檔編號(hào)】C12N9/64GK103525845SQ201310521130
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】鞠吉雨 申請(qǐng)人:濰坊醫(yī)學(xué)院