一種生產(chǎn)低聚果糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括（1）固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)，（2）固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，包括以下步驟：選取能分泌葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的酵母菌種，（3）通過(guò)分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶、固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)先進(jìn)，果糖基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)過(guò)固定化后，可以提高其利用率，采用分批反應(yīng)法時(shí)，可以反復(fù)使用70次以上。柱式反應(yīng)法，每公斤酶可以生產(chǎn)白砂糖濃度（Brix）≥50的FOS糖漿1T以上，含量≥55%的FOS糖漿。過(guò)濾液經(jīng)再次稀釋，經(jīng)過(guò)固定化酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可以得到含量60—90%的FOS糖漿。而且FOS產(chǎn)品不必經(jīng)過(guò)活性炭脫色，不需離子交換脫鹽，直接經(jīng)過(guò)濃縮獲得Brix≥75，整個(gè)工藝簡(jiǎn)便，操作便利，生產(chǎn)成本明顯下降。
【專利說(shuō)明】一種生產(chǎn)低聚果糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種功能性食品配料的制備方法，具體說(shuō)是一種基于離子交換樹脂固定果糖基轉(zhuǎn)移酶法和固定化酵母細(xì)胞，以蔗糖為原料，工業(yè)化生產(chǎn)高純度蔗果低聚糖(低聚果糖)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]低聚果糖(Fructo — oligosaccharides,簡(jiǎn)稱F0S),又稱寡果糖或鹿果低聚糖,分子式為G-F-Fn，η = I?3 (其中G為葡萄糖基，F(xiàn)為果糖基)，是由蔗糖和I?3個(gè)果糖基通過(guò)β 2，I鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合而成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖(分別簡(jiǎn)稱為GF2、GF3、GF4)及其混合物。
[0003]作為甜味劑和食品添加劑，低聚果糖是第一個(gè)通過(guò)FDA審核作為公認(rèn)安全級(jí)(GRAS)的功能性低聚糖，其低齲齒性、難消化性及雙歧桿菌增殖性已得到證實(shí)，在非消化性功能食品中，低聚果糖是符合益生元標(biāo)準(zhǔn)(即雙歧桿菌促生素)的典型雙歧因子，具有雙向調(diào)節(jié)體內(nèi)菌群、降低血脂、促進(jìn)維生素的合成、保護(hù)肝臟、促進(jìn)Ca、Mg、Fe等礦物質(zhì)吸收、防止肥胖、防止齲齒和美容的作用，是近10年來(lái)國(guó)際市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用的功能性食品配料。
[0004]目前國(guó)內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)FOS的現(xiàn)有技術(shù)只有液體深層發(fā)酵法。即用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)黑曲霉，這種微生物能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶，從培養(yǎng)液分離收集黑曲霉菌體后，不經(jīng)任何處理，直接投入蔗糖溶液中，使其轉(zhuǎn)化為F0S。該法的缺點(diǎn)是產(chǎn)酶菌絲體只能利用一次，在FOS生產(chǎn)過(guò)程中，由于菌絲體及其培養(yǎng)基成分的存在并參與反應(yīng)，使產(chǎn)品色度及鹽分過(guò)高，需要活性炭脫色和離子交換樹脂脫鹽等后處理工序，使整個(gè)工藝復(fù)雜，成本提高。而菌體細(xì)胞的代謝物就只能作為雜質(zhì)留在FOS產(chǎn)品中，無(wú)法除去，影響產(chǎn)品質(zhì)量。
[0005]目前，雖有固定化酶法生產(chǎn)低聚果糖的專利報(bào)導(dǎo)(CN1335402A)，但此法只注重了低含量的低聚果糖生產(chǎn)，且指標(biāo)含量只能維持在57%以下，載體使用成本偏高，處理過(guò)程需要先做出載體，然后再進(jìn)行酶液交聯(lián)，過(guò)程工藝復(fù)雜。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種工藝簡(jiǎn)單，成本低，生產(chǎn)的FOS產(chǎn)品雜質(zhì)少，低聚果糖含量高的生產(chǎn)方法。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一種生產(chǎn)低聚果糖的方法，包括以下步驟:
(I)固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)，包括以下步驟:選取具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法等將酶分離純化，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶液經(jīng)HPLC測(cè)定酶活力之后，按照每100-150U酶液加入0.5-1.5g的大孔陰離子交換樹脂載體，攪拌混勻，加入0.08-0.15%的戊二醛溶液，后再加入0.02-0.04%的氯化鈣溶液，調(diào)ph6.5-7.2，30°C下交聯(lián)反應(yīng)8_12h，后過(guò)濾，洗滌，既得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0008](2)固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，包括以下步驟:選取能分泌葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的酵母菌種，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)的酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)離心制得酵母細(xì)胞濕菌體，將海藻酸鈉配成6 — 8%的溶液，經(jīng)消毒處理后，與濕菌體按比例在真空條件下混勻，然后利用壓力噴霧法使混合液通過(guò)孔徑為0.6mm的噴嘴,均勻落入10%的氯化I丐溶液中，形成直徑為2_3_范圍內(nèi)的凝膠珠，硬化20-30分鐘后，過(guò)濾分離得到固定化酵母細(xì)胞。
[0009](3)通過(guò)分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶、固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖，包括以下步驟:按照分批反應(yīng)法，在反應(yīng)罐中，按55%蔗糖溶液加入3%的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，控制反應(yīng)液ph5-6，溫度48 °C -55 °C，反應(yīng)1h左右，進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾液稀釋25%，加入8%的固定化酵母細(xì)胞，控制反應(yīng)液ph5-6，溫度28 V -35 °C，反應(yīng)1h左右，即可獲得含量70% — 90%的FOS產(chǎn)品，反應(yīng)結(jié)束，用篩網(wǎng)過(guò)濾反應(yīng)液，可以分離回收固定化酶，用于下一批原料的生產(chǎn)；按照柱式反應(yīng)法，將固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶裝入柱中，以20% — 60%(w/w)的蔗糖溶液在ph4.5-7.5，溫度30— 55°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)蔗糖溶液的流量0.1_3m3/h下通過(guò)此柱，反應(yīng)8—48h，過(guò)濾，得到過(guò)濾溶液；將固定化酵母細(xì)胞裝入柱中，以10% — 40%(w/w)的過(guò)濾溶液在ph4.5-7.5，溫度20— 35°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)溶液的流量0.1_3m3/h下通過(guò)此柱，反應(yīng)8 — 48h，，可控制FOS成分達(dá)到60— 90%的要求。
[0010]作為對(duì)本技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)，所述的合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)包括以下步驟:
A.斜面培養(yǎng)基
土豆200 g/L、瓊脂15 g/L、蔗糖20 g/L，30°C下培養(yǎng)5天。
[0011]B.種子培養(yǎng)基
鹿糖5%—20%、?柏粉1%—10%、玉米衆(zhòng)0.1%—5%、玉米粉0.1%—5%、硫酸續(xù)0.01% 一 1%，磷酸氫二鉀 0.01% 一 1%、消泡劑 0.03%，30°C發(fā)酵 16h。
[0012]C.發(fā)酵培養(yǎng)基
蔗糖5% — 25%、豆柏粉1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、玉米粉0.1% — 5%、硫酸鎂0.01%一 1%，磷酸氫二鉀 0.01% 一 1%、消泡劑 0.03%，30°C發(fā)酵 24h。
[0013]作為對(duì)本技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，所述的合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)包括以下步驟:
A.斜面培養(yǎng)基
麥芽汁12 g/L、瓊脂15 g/L，30°C下培養(yǎng)2天。
[0014]B.種子培養(yǎng)基
葡萄糖1% —20%、蛋白胨0.1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、硫酸鎂0.01% —1%，磷酸氫二鈉 0.01% 一 1%、消泡劑 0.02%，30°C發(fā)酵 16-20h。
[0015]C.發(fā)酵培養(yǎng)基
葡萄糖1% — 20%、蛋白胨0.1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、硫酸鎂0.01% 一 1%，磷酸氫二鈉 0.01%—1%、消泡劑 0.02%, 30°C發(fā)酵 30-35h。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)先進(jìn)，果糖基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)過(guò)固定化后，可以提高其利用率，采用分批反應(yīng)法時(shí)，可以反復(fù)使用70次以上。柱式反應(yīng)法，每公斤酶可以生產(chǎn)白砂糖濃度(Brix)S 50的FOS糖漿IT以上，含量> 55%的FOS糖漿。過(guò)濾液經(jīng)再次稀釋，經(jīng)過(guò)固定化酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可以得到含量60— 90%的FOS糖漿。而且FOS產(chǎn)品不必經(jīng)過(guò)活性炭脫色，不需離子交換脫鹽，直接經(jīng)過(guò)濃縮獲得Brix ^ 75，整個(gè)工藝簡(jiǎn)便，操作便利，生產(chǎn)成本明顯下降。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是本發(fā)明的的工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018]一種生產(chǎn)低聚果糖的方法，其特征在于包括以下步驟:
(I)固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)，包括以下步驟:選取具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株，固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)，培養(yǎng)包括以下步驟。
[0019]A.斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，土豆200 g/L、瓊脂15 g/L、蔗糖20 g/L，30°C下培養(yǎng)5天。
[0020]B.種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，鹿糖5%—20%、?柏粉1%—10%、玉米衆(zhòng)0.1%一5%、玉米粉0.1% — 5%、硫酸鎂 0.01% 一 1%，磷酸氫二鉀 0.01% 一 1%、消泡劑 0.03%，30°C發(fā)酵 16h。
[0021]C.發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，鹿糖5%—25%、?柏粉1%—10%、玉米衆(zhòng)0.1%—5%、玉米粉0.1% — 5%、硫酸鎂 0.01% 一 1%，磷酸氫二鉀 0.01% 一 1%、消泡劑 0.03%，30°C發(fā)酵 24h。
[0022]然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法等將酶分離純化，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶液經(jīng)HPLC測(cè)定酶活力之后，按照每100-150U酶液加入0.5-1.5g的大孔陰離子交換樹脂載體，攪拌混勻，加入0.08-0.15%的戊二醛溶液，后再加入0.02-0.04%的氯化鈣溶液，調(diào)ph6.5-7.2，30°C下交聯(lián)反應(yīng)8_12h，后過(guò)濾，洗滌，既得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0023](2)固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，包括以下步驟:選取能分泌葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的酵母菌種，所述的合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)包括以下步驟:
A.斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，麥芽汁12 g/L、瓊脂15 g/L，30°C下培養(yǎng)2天。
[0024]B.種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖1% — 20%、蛋白胨0.1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、硫酸鎂 0.01% 一 1%，磷酸氫二鈉 0.01% 一 1%、消泡劑 0.02%，30°C發(fā)酵 16_20h。
[0025]C.發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖1% — 20%、蛋白胨0.1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、硫酸鎂 0.01% 一 1%，磷酸氫二鈉 0.01%—1%、消泡劑 0.02%，30°C發(fā)酵 30_35h。
[0026]將發(fā)酵培養(yǎng)的酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)離心制得酵母細(xì)胞濕菌體，將海藻酸鈉配成6 — 8%的溶液，經(jīng)消毒處理后，與濕菌體按比例在真空條件下混勻，然后利用壓力噴霧法使混合液通過(guò)孔徑為0.6mm的噴嘴，均勻落入10%的氯化鈣溶液中，形成直徑為2_3mm范圍內(nèi)的凝膠珠，硬化20-30分鐘后，過(guò)濾分離得到固定化酵母細(xì)胞。
[0027](3)通過(guò)分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶、固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖，包括以下步驟:按照分批反應(yīng)法，在反應(yīng)罐中，按55%蔗糖溶液加入3%的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，控制反應(yīng)液ph5-6，溫度48 °C -55 °C，反應(yīng)1h左右，進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾液稀釋25%，加入8%的固定化酵母細(xì)胞，控制反應(yīng)液ph5-6，溫度28 V -35 °C，反應(yīng)1h左右，即可獲得含量70% — 90%的FOS產(chǎn)品，反應(yīng)結(jié)束，用篩網(wǎng)過(guò)濾反應(yīng)液，可以分離回收固定化酶，用于下一批原料的生產(chǎn)；按照柱式反應(yīng)法，將固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶裝入柱中，以20% — 60%(w/w)的蔗糖溶液在ph4.5-7.5，溫度30— 55°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)蔗糖溶液的流量0.1-3m3/h下通過(guò)此柱，反應(yīng)8—48h，過(guò)濾，得到過(guò)濾溶液；將固定化酵母細(xì)胞裝入柱中，以10% — 40%(w/w)的過(guò)濾溶液在ph4.5-7.5，溫度20— 35°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)溶液的流量0.l_3m3/h下通過(guò)此柱，反應(yīng)8 — 48h，，可控制FOS成分達(dá)到60— 90%的要求。
[0028]實(shí)施例1
(I)選取黑曲霉(A.niger)菌種，進(jìn)行固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)。
[0029]A.斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，土豆200 g/L、瓊脂15 g/L、蔗糖20 g/L，30°C下培養(yǎng)5天。
[0030]B.種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，蔗糖5%、豆柏粉1%，玉米漿0.1%，玉米粉0.1%，硫酸鎂
0.01%，磷酸氫二鉀0.01%，消泡劑0.03%，30°C發(fā)酵16h。
[0031]C.發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，蔗糖5%、豆柏粉1%、玉米漿0.1%、玉米粉0.1%、硫酸鎂
0.01%，磷酸氫二鉀0.01%、消泡劑0.03%，30°C發(fā)酵24h。
[0032]然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法等將酶分離純化，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶液經(jīng)HPLC測(cè)定酶活力之后，按照每100U酶液加入0.5g的大孔陰離子交換樹脂載體，攪拌混勻，加入0.08%的戊二醛溶液，后再加入0.02%的氯化鈣溶液，調(diào)ph6.5，30°C下交聯(lián)反應(yīng)8h，后過(guò)濾，洗滌，既得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0033](2)固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，包括以下步驟:選取能分泌葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的酵母菌種， A.斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，麥芽汁12 g/L、瓊脂15 g/L，30°C下培養(yǎng)2天。
[0034]B.種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，硫酸鎂0.01%，磷酸氫二鈉 0.01%,消泡劑 0.02%, 30°C發(fā)酵 16h。
[0035]C.發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖1%，蛋白胨0.1%，玉米漿0.1%，硫酸鎂0.01%,磷酸氫二鈉 0.01%,消泡劑 0.02%, 30°C發(fā)酵 30h。
[0036]將發(fā)酵培養(yǎng)的酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)離心制得酵母細(xì)胞濕菌體，將海藻酸鈉配成6%的溶液，經(jīng)消毒處理后，與濕菌體按比例在真空條件下混勻，然后利用壓力噴霧法使混合液通過(guò)孔徑為0.6mm的噴嘴，均勻落入10%的氯化鈣溶液中，形成直徑為2_3_范圍內(nèi)的凝膠珠，硬化20分鐘后，過(guò)濾分離得到固定化酵母細(xì)胞。
[0037](3)通過(guò)分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶、固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖，包括以下步驟:按照分批反應(yīng)法，在反應(yīng)罐中，按55%蔗糖溶液加入3%的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，控制反應(yīng)液ph5，溫度48V，反應(yīng)1h左右，進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾液稀釋25%，加入8%的固定化酵母細(xì)胞，控制反應(yīng)液ph5，溫度28 °C，反應(yīng)1h左右，即可獲得含量70%的FOS產(chǎn)品，反應(yīng)結(jié)束，用篩網(wǎng)過(guò)濾反應(yīng)液，可以分離回收固定化酶，用于下一批原料的生產(chǎn)；按照柱式反應(yīng)法，將固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶裝入柱中，以20% (w/w)的蔗糖溶液在ph4.5，溫度30°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)蔗糖溶液的流量0.1mVh下通過(guò)此柱，反應(yīng)8h，過(guò)濾，得到過(guò)濾溶液；將固定化酵母細(xì)胞裝入柱中，以10%% (w/w)的過(guò)濾溶液在ph4.5，溫度20°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)溶液的流量0.1m3A下通過(guò)此柱，反應(yīng)8h,,可控制FOS成分達(dá)到60%的要求。
[0038]實(shí)施例2
(I)選取黑曲霉(A.niger)菌種，進(jìn)行固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)；
A.斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，土豆200 g/L、瓊脂15 g/L、蔗糖20 g/L，30°C下培養(yǎng)5天。
[0039]B.種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，蔗糖20%、豆柏粉10%、玉米漿5%、玉米粉5%、硫酸鎂1%，磷酸氫二鉀1%、消泡劑0.03%，30°C發(fā)酵16h。
[0040]C.發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，蔗糖25%、豆柏粉10%、玉米漿5%、玉米粉5%、硫酸鎂1%，磷酸氫二鉀1%、消泡劑0.03%，30°C發(fā)酵24h。
[0041]然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法等將酶分離純化，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶液經(jīng)HPLC測(cè)定酶活力之后，按照每150U酶液加入1.5g的大孔陰離子交換樹脂載體，攪拌混勻，加入0.15%的戊二醛溶液，后再加入0.04%的氯化鈣溶液，調(diào)ph7.2，30°C下交聯(lián)反應(yīng)12h，后過(guò)濾，洗滌，既得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0042](2)固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，包括以下步驟:選取能分泌葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的酵母菌種， A.斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，麥芽汁12 g/L、瓊脂15 g/L，30°C下培養(yǎng)2天。
[0043]B.種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖20%、蛋白胨10%、玉米漿5%、硫酸鎂1%，磷酸氫二鈉1%、消泡劑 0.02%, 30°C發(fā)酵 20h。
[0044]C.發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖20%、蛋白胨10%、玉米漿5%、硫酸鎂01%，磷酸氫二鈉1%、消泡劑 0.02%, 30°C發(fā)酵 35h。
[0045]將發(fā)酵培養(yǎng)的酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)離心制得酵母細(xì)胞濕菌體，將海藻酸鈉配成6 — 8%的溶液，經(jīng)消毒處理后，與濕菌體按比例在真空條件下混勻，然后利用壓力噴霧法使混合液通過(guò)孔徑為0.6mm的噴嘴，均勻落入10%的氯化鈣溶液中，形成直徑為2_3mm范圍內(nèi)的凝膠珠，硬化30分鐘后，過(guò)濾分離得到固定化酵母細(xì)胞。
[0046](3)通過(guò)分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶、固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖，包括以下步驟:按照分批反應(yīng)法，在反應(yīng)罐中，按55%蔗糖溶液加入3%的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，控制反應(yīng)液ph6，溫度55°C，反應(yīng)1h左右，進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾液稀釋25%，加入8%的固定化酵母細(xì)胞，控制反應(yīng)液ph6，溫度35°C，反應(yīng)1h左右，即可獲得含量90%的FOS產(chǎn)品，反應(yīng)結(jié)束，用篩網(wǎng)過(guò)濾反應(yīng)液，可以分離回收固定化酶，用于下一批原料的生產(chǎn)；按照柱式反應(yīng)法，將固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶裝入柱中，以60% (w/w)的鹿糖溶液在ph7.5,溫度55°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)蔗糖溶液的流量3mVh下通過(guò)此柱，反應(yīng)48h，過(guò)濾，得到過(guò)濾溶液；將固定化酵母細(xì)胞裝入柱中，以40% (w/w)的過(guò)濾溶液在7.5，溫度35°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)溶液的流量3m3/h下通過(guò)此柱,反應(yīng)48h,,可控制FOS成分達(dá)到90%的要求。
[0047]實(shí)施例3
(I)選取點(diǎn)青霉(A.Penicillium notatum )菌種,進(jìn)行固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)；
A.斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，土豆200 g/L、瓊脂15 g/L、蔗糖20 g/L，30°C下培養(yǎng)5天。
[0048]B.種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，蔗糖15%、豆柏粉6%、玉米漿3%、玉米粉4%、硫酸鎂0.6%，磷酸氫二鉀0.5%、消泡劑0.03%，30°C發(fā)酵16h。
[0049]C.發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，蔗糖15%、豆柏粉6%、玉米漿3%、玉米粉3%、硫酸鎂0.6%，磷酸氫二鉀0.6%、消泡劑0.03%, 30°C發(fā)酵24h。
[0050]然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法等將酶分離純化，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶液經(jīng)HPLC測(cè)定酶活力之后，按照每130U酶液加入Ig的大孔陰離子交換樹脂載體，攪拌混勻，加入0.11%的戊二醛溶液，后再加入0.03%的氯化鈣溶液，調(diào)ph7.0，30°C下交聯(lián)反應(yīng)10h，后過(guò)濾，洗滌，既得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0051](2)固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，包括以下步驟:選取能分泌葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的酵母菌種， A.斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，麥芽汁12 g/L、瓊脂15 g/L，30°C下培養(yǎng)2天。
[0052]B.種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖15%、蛋白胨6%、玉米漿3%、硫酸鎂0.6%，磷酸氫二鈉 0.6%、消泡劑 0.02%，30°C發(fā)酵 16-20h。
[0053]C.發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，葡萄糖15%、蛋白胨6%、玉米漿3%、硫酸鎂0.5%，磷酸氫二鈉0.5%、消泡劑 0.02%, 30°C發(fā)酵 32h。
[0054]將發(fā)酵培養(yǎng)的酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)離心制得酵母細(xì)胞濕菌體，將海藻酸鈉配成7%的溶液，經(jīng)消毒處理后，與濕菌體按比例在真空條件下混勻，然后利用壓力噴霧法使混合液通過(guò)孔徑為0.6mm的噴嘴，均勻落入10%的氯化鈣溶液中，形成直徑為2_3_范圍內(nèi)的凝膠珠，硬化25分鐘后，過(guò)濾分離得到固定化酵母細(xì)胞。
[0055](3)通過(guò)分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶、固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖，包括以下步驟:按照分批反應(yīng)法，在反應(yīng)罐中，按55%蔗糖溶液加入3%的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，控制反應(yīng)液ph5.5，溫度52°C，反應(yīng)1h左右，進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾液稀釋25%，加入8%的固定化酵母細(xì)胞，控制反應(yīng)液ph5.5，溫度32°C，反應(yīng)1h左右，即可獲得含量78.5%的FOS產(chǎn)品，反應(yīng)結(jié)束，用篩網(wǎng)過(guò)濾反應(yīng)液，可以分離回收固定化酶,用于下一批原料的生產(chǎn)；按照柱式反應(yīng)法，將固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶裝入柱中，以40% (w/w)的蔗糖溶液在ph5.5，溫度42°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)蔗糖溶液的流量1.5m3/h下通過(guò)此柱，反應(yīng)25h，過(guò)濾，得到過(guò)濾溶液；將固定化酵母細(xì)胞裝入柱中，以25% (w/w)的過(guò)濾溶液在ph5.5，溫度28°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)溶液的流量1.5m3/h下通過(guò)此柱，反應(yīng)20h，，可控制FOS成分達(dá)到86.1%的要求。
[0056]上文所列出的一系列的詳細(xì)說(shuō)明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施例的具體說(shuō)明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施例或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)低聚果糖的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)，包括以下步驟:選取具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法等將酶分離純化，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶液經(jīng)HPLC測(cè)定酶活力之后，按照每100-150U酶液加入0.5-1.5g的大孔陰離子交換樹脂載體，攪拌混勻，加入0.08-0.15%的戊二醛溶液，后再加入0.02-0.04%的氯化鈣溶液，調(diào)ph6.5-7.2，30°C下交聯(lián)反應(yīng)8_12h，后過(guò)濾，洗滌，既得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶； (2)固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，包括以下步驟:選取能分泌葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的酵母菌種，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將發(fā)酵培養(yǎng)的酵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)離心制得酵母細(xì)胞濕菌體，將海藻酸鈉配成6 — 8%的溶液，經(jīng)消毒處理后，與濕菌體按比例在真空條件下混勻，然后利用壓力噴霧法使混合液通過(guò)孔徑為0.6mm的噴嘴，均勻落入10%的氯化鈣溶液中，形成直徑為2_3_范圍內(nèi)的凝膠珠，硬化20-30分鐘后，過(guò)濾分離得到固定化酵母細(xì)胞； (3)通過(guò)分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶、固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)低聚果糖，包括以下步驟:按照分批反應(yīng)法，在反應(yīng)罐中，按55%蔗糖溶液加入3%的固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，控制反應(yīng)液ph5-6，溫度48°C -55°C，反應(yīng)1h左右，進(jìn)行過(guò)濾，將過(guò)濾液稀釋25%，加入8%的固定化酵母細(xì)胞，控制反應(yīng)液ph5-6，溫度28 °C -35 °C,反應(yīng)1h左右，即可獲得含量70% — 90%的FOS產(chǎn)品，反應(yīng)結(jié)束，用篩網(wǎng)過(guò)濾反應(yīng)液，可以分離回收固定化酶，用于下一批原料的生產(chǎn)；按照柱式反應(yīng)法，將固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶裝入柱中，以20% — 60%(w/w)的蔗糖溶液在ph4.5-7.5，溫度30— 55°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)蔗糖溶液的流量0.l_3m3/h下通過(guò)此柱，反應(yīng)8 — 48h，過(guò)濾，得到過(guò)濾溶液；將固定化酵母細(xì)胞裝入柱中，以10% — 40% (w/w)的過(guò)濾溶液在ph4.5-7.5，溫度20— 35°C下通過(guò)此柱，調(diào)節(jié)溶液的流量0.l_3m3/h下通過(guò)此柱，反應(yīng)8 — 48h，，可控制FOS成分達(dá)到60— 90%的要求。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)低聚果糖的方法，其特征在于:固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)，所述的合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)包括以下步驟: A.斜面培養(yǎng)基 土豆200 g/L、瓊脂15 g/L、蔗糖20 g/L，30°C下培養(yǎng)5天； B.種子培養(yǎng)基 蔗糖5% — 20%、豆柏粉1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、玉米粉0.1% — 5%、硫酸鎂0.01%一 1%，磷酸氫二鉀 0.01% 一 1%、消泡劑 0.03%，30°C發(fā)酵 16h ； C.發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖5% — 25%、豆柏粉1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、玉米粉0.1% — 5%、硫酸鎂0.01%一 1%，磷酸氫二鉀 0.01% 一 1%、消泡劑 0.03%，30°C發(fā)酵 24h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)低聚果糖的方法，其特征在于:固定化酵母細(xì)胞培養(yǎng)，所述的合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)包括以下步驟: A.斜面培養(yǎng)基 麥芽汁12 g/L、瓊脂15 g/L，30°C下培養(yǎng)2天； B.種子培養(yǎng)基 葡萄糖1% —20%、蛋白胨0.1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、硫酸鎂0.01% —1%，磷酸氫二鈉 0.01% 一 1%、消泡劑 0.02%，30°C發(fā)酵 16-20h ； C.發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖1% — 20%、蛋白胨0.1% —10%、玉米漿0.1% — 5%、硫酸鎂0.01% 一 1%，磷酸氫二鈉 0.01%—1%、消泡劑 0.02%, 30°C發(fā)酵 30-35h。
【文檔編號(hào)】C12P19/00GK104232706SQ201310512152
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】李國(guó)文, 趙洪濤, 袁偉崗 申請(qǐng)人:山東文遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司