一種編碼金屬蛋白酶的基因pme16A及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種編碼金屬蛋白酶的基因pme16A，其核苷酸序列如序列表No.1所示；氨基酸殘基的序列如序列表No.2所示。序列表1中的DNA從5’端第1個(gè)核苷酸開(kāi)始起始密碼子ATG到第1461個(gè)核苷酸以終止密碼子TAA結(jié)束，存在一個(gè)完整的ORF，核苷酸1-1461，自5’端的第1-3位核苷酸為pme16A基因的起始密碼子ATG，自5’端的第1459-1461位核苷酸為pme16A基因的終止密碼子TAA。本發(fā)明為金屬蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供了新的材料，可以有效彌補(bǔ)動(dòng)植物源金屬蛋白酶原材料的短缺現(xiàn)狀，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種編碼金屬蛋白酶的基因pme16A及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種編碼金屬蛋白酶的基因pmel6A及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]金屬蛋白酶(EC3.4.24._)是指其活性中心，依賴(lài)于金屬離子的一類(lèi)蛋白酶。大多數(shù)金屬蛋白酶主要依賴(lài)二價(jià)陽(yáng)離子，如鋅離子、銅離子、鈷離子和錳離子等。其中Zn2+最為普遍。金屬蛋白酶容易被金屬螯合劑強(qiáng)烈抑制。金屬蛋白酶，分布廣泛，性質(zhì)特異，有著重要的經(jīng)濟(jì)和應(yīng)用價(jià)值。由于金屬蛋白酶的來(lái)源不同，所以大多數(shù)都具有自己與眾不同的特點(diǎn)。一般具有耐高溫或者嗜低溫、耐有機(jī)溶劑、耐堿性、熱敏感等特性。目前，金屬蛋白酶類(lèi)主要應(yīng)用于食品、洗滌劑、化妝品、抗腫瘤藥物和疾病機(jī)理研究等方面，而且應(yīng)用于以上各行業(yè)中的金屬蛋白酶大多源自于動(dòng)植物，由于動(dòng)植物源酶來(lái)源有限，限制了金屬蛋白酶在生產(chǎn)生活上的進(jìn)一步應(yīng)用與發(fā)展。
[0003]近年來(lái)，被確定的鋅金屬蛋白酶/肽酶的數(shù)量逐年增加。金屬蛋白酶超家族的成員，都不同程度的涉及胚胎發(fā)育和骨骼形成，關(guān)節(jié)炎和癌癥等。對(duì)不同金屬蛋白酶之間的結(jié)構(gòu)活性研究，有利于我們?cè)O(shè)計(jì)不同的工程金屬蛋白酶。將金屬蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)，引入蛋白質(zhì)中，可以調(diào)節(jié)酶的活性，也有可能誘發(fā)可預(yù)測(cè)的特異構(gòu)象變化。在對(duì)金屬蛋白酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們都擁有一段共同的鋅離子結(jié)合位點(diǎn)序列HEXXH，其中H代表組氨酸殘基，E代表谷氨酸殘基，X代表任意的氨基酸殘基。兩個(gè)組氨酸殘基，是作為鋅的配基，谷氨酸殘基作為常見(jiàn)的支點(diǎn)。含有保守的鋅結(jié)合位點(diǎn)序列HEXXH的金屬肽酶都被稱(chēng)為Zincins，根據(jù)鋅離子第三個(gè)配基所在的位置，又把Zincins分成三個(gè)不同的族群，Gluzincins,即下游的谷氨酸殘基作為鋅離子的第三個(gè)配基,屬于這一類(lèi)的金屬蛋白酶，包括嗜熱菌蛋白酶，肽鏈內(nèi)切酶，白三烯A4水解酶等。
[0004]金屬蛋白酶也廣泛存在于植物的各種器官或組織中，植物幼嫩部分的含量較多，成熟部分含量較少。如:亮氨酸氨基肽酶(LAP)，是廣泛存在于植物中的金屬蛋白酶，序列和結(jié)構(gòu)都很保守。在寄生蟲(chóng)中，有來(lái)`自亞馬遜利什曼原蟲(chóng)的，亮氨酰氨基肽酶(Lap)，它是一個(gè)60kDa的蛋白質(zhì),與來(lái)源于革蘭氏陰性菌、植物、哺乳動(dòng)物中的LaP具有同源性。Eggleson等從食物泡中，純化并鑒定了一種新的金屬肽酶，鐮形溶解素(Falcilysin)。這種金屬肽酶，出現(xiàn)在瘧原蟲(chóng)的天冬氨酸蛋白酶I和II，以及惡性瘧原蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶血色素水解功能的下游。它不能斷裂球蛋白和血色素，但易斷裂血色素的多肽片段。鐮形溶解素的序列顯示了 ME家族中M16金屬肽酶的特點(diǎn)，具有一個(gè)倒轉(zhuǎn)的HXXEH的活性位點(diǎn)基序。通過(guò)用隨機(jī)的多肽對(duì)鐮形溶解素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重組的鐮形溶解素在酸性條件下，具有高度的活性。在中性條件下，也具有較低的活力，但是，卻有不同的底物特異性。
[0005]在鋅金屬蛋白酶中，嗜熱菌蛋白酶和羧肽酶A，被認(rèn)為是典型的模型來(lái)研究作用機(jī)制。在嗜熱菌蛋白中，鋅離子具有近四面體的結(jié)構(gòu)，有三個(gè)殘基提供(Hisl42，Hisl46,Glul66)還有一個(gè)是由水分子來(lái)提供。進(jìn)來(lái)的底物，取代溶劑分子。鋅離子在其中，扮演兩個(gè)重要的角色，第一，使底物的羰基極化，第二，促進(jìn)去質(zhì)子化的水親核試劑。在羧肽酶A中，在酶的催化中心，Zn2+與Hisl96，Glu72，His69結(jié)合，它具有以下作用，第一，通過(guò)Zn2+-OH鍵極化一個(gè)水分子，使其攻擊底物易斷裂的肽鍵，從而形成一個(gè)四面體的過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)。第二，通過(guò)靜電作用，穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)中的部分電荷。Argl27、Glu270協(xié)助形成過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)，Argl27與底物的羰基結(jié)合，Glu270與水分子，通過(guò)氫鍵結(jié)合。Argl45，在Asnl44和Tyr248的協(xié)助下，對(duì)底物的結(jié)合，具有重要的作用。第225位的氨基酸被認(rèn)為，是決定底物特異性的關(guān)鍵殘基。Mpp (線粒體加工肽酶)是一種金屬肽酶，專(zhuān)門(mén)裂解N-端信號(hào)肽序列。它的活性位點(diǎn)位于一個(gè)大的中央腔，在α和β亞基之間，內(nèi)襯親水性氨基酸，其中包括谷氨酸和天冬氨酸。信號(hào)肽的底物是富含帶正電荷的氨基酸殘基，因此，在底物結(jié)合區(qū)域，帶負(fù)電荷的殘基可以與之結(jié)合，形成穩(wěn)定的靜電相互作用的酶和底物。另外，高極性的空腔，不喜歡兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)。底物可到達(dá)活性位點(diǎn)的部位，被富含甘氨酸環(huán)(由a-MPP的284-301位殘基組成)部分阻止。電子密度被甘氨酸環(huán)弱化，顯示靈活。Arecent等人的研究表明，Mpp去除這個(gè)甘氨酸環(huán)后，對(duì)底物的親合力降低以及催化活性降低。這些結(jié)果表明，Mpp中富含甘氨酸環(huán)，可能與底物的結(jié)合或產(chǎn)物的釋放相關(guān)，可能取決于它的靈活度 。
[0006]目前，獲得金屬蛋白酶的主要方式有:(1)從動(dòng)植物組織中直接提取，分離純化得到；這種方法要獲得大量的蛋白酶，則需大量的生物體組織，且生物組織的前期處理較麻煩，價(jià)格較貴。(2)利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)金屬蛋白酶。此方法有諸多優(yōu)勢(shì)，如成本低、獲得量大、通過(guò)分泌表達(dá)系統(tǒng)使純化更容易等。產(chǎn)金屬蛋白酶的菌株可通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)篩選得到，但由于各方面條件的限制，自然界約有99%的微生物不能通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，在發(fā)掘新基因方面有一定的局限性，因此，宏基因組技術(shù)在發(fā)掘新基因方面得到越來(lái)越多的科學(xué)家的重視。宏基因組是指生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，目前主要指環(huán)境樣品中的細(xì)菌和真菌的基因組總和，通過(guò)宏基因組技術(shù)可繞過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)瓶頸。本發(fā)明從污染水樣污泥中直接提取宏基因組總DNA，構(gòu)建了環(huán)境宏基因組文庫(kù)，通過(guò)直接測(cè)序篩選策略，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析平臺(tái)，獲取了一個(gè)編碼金屬蛋白酶的基因pmel6A，完成了該基因的克隆表達(dá)，以及對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行生理生化性質(zhì)的鑒定，為金屬蛋白酶的研究提供新的材料。本發(fā)明提供的新的金屬蛋白酶可以為金屬蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供理論參考，可以有效彌補(bǔ)動(dòng)植物源金屬蛋白酶原材料的短缺現(xiàn)狀，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景，在食品和疾病機(jī)理研究等方面具有廣泛的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種編碼金屬蛋白酶的基因pmel6A及其應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供的一種編碼金屬蛋白酶的基因pmel6A的克隆方法包括下列步驟:
[0009](I)從廣西某地污染水樣(22° 84; N，108° 28, E)淤泥樣本中提取未培養(yǎng)微生物宏基因組DNA，構(gòu)建環(huán)境宏基因組文庫(kù)；
[0010](2)基于序列特異性的篩選策略，從環(huán)境宏基因組文庫(kù)中分離篩選包含金屬蛋白酶新基因的克隆。
[0011]本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建環(huán)境宏基因組文庫(kù)，基于序列特異性的直接測(cè)序篩選策略，得到了一種新的編碼金屬蛋白酶的基因，可在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)，產(chǎn)生的金屬蛋白酶對(duì)酪蛋白底物有較好的水解能力。
[0012]重組質(zhì)粒菌株E.coli BL21 (DE3)/pGXM16已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，編號(hào)為CGMCC N0.7473，保存日期為2013年4月15日，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0013]序列表N0.1的DNA是克隆載體pGEM_3Zf (+)部分DNA序列和克隆在載體上的外源未培養(yǎng)微生物的DNA，包含完整的編碼金屬蛋白酶的新基因pmel6A。該基因的ORF位于克隆第I至第1461位核苷酸之間，由第1-3位核苷酸的起始密碼子ATG起始，第1459-1461位核苷酸的終止密碼子TAA終止。該ORF —共1461個(gè)核苷酸可編碼由486個(gè)氨基酸組成的多妝。在氨基酸水平上與假定的 Zn-dependent peptidase (YP_004863228.1)、PeptidaseM16domain protein (ZP_09615990.1)分別具有 38% 及 35% 的一致性。[0014]本發(fā)明可以為金屬蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供新的材料，可以有效彌補(bǔ)動(dòng)植物源金屬蛋白酶原材料的短缺現(xiàn)狀，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景，在食品和疾病機(jī)理研究等方面具有廣泛的用途。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為從廣西某地污染水樣環(huán)境(22° 84' N，108° 28' E)活性淤泥樣品中提取的宏基因組DNA。
[0016]圖2為宏基因組DNA雙酶切后的電泳圖。
[0017]圖3為淤泥宏基因文庫(kù)克隆的限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析以判斷文庫(kù)質(zhì)量。
[0018]圖4為表達(dá)金屬蛋白酶活性克隆的篩選。
[0019]圖5為原始克隆PGXM16的酶切檢測(cè)結(jié)果。
[0020]圖6為基因pmel6A的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0021]圖7為表達(dá)重組質(zhì)粒E.coli BL21 (DE3)/pGXM16的酶切檢測(cè)結(jié)果。
[0022]圖8為表達(dá)重組質(zhì)粒E.coli BL21 (DE3)/pGXM16的測(cè)序結(jié)果。
[0023]圖9為表達(dá)重組菌株E.coli BL21(DE3)/pGXM16誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0024]圖10不同溫度對(duì)Pmel6A重組蛋白酶活的影響。
[0025]
[0026]【具體實(shí)施方式】
[0027]在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的主要材料包括:限制性?xún)?nèi)切酶(EcoR I > Pst I及Hind III)及T4DNA連接酶均購(gòu)自Fermentas公司、克隆載體pGEM_3Zf(+)及表達(dá)載體pET-32a(+)均購(gòu)自Promega公司、PVPP (交聯(lián)聚乙烯吡咯燒酮)購(gòu)自Sigma公司、CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)購(gòu)自Sigma公司。
[0028]實(shí)施例1
[0029]—種編碼新型金屬蛋白酶的基因pmel6A的克隆,其主要包括下述步驟1、2、3、4。
[0030]步驟1:從污染水樣活性淤泥中提取和純化宏基因組DNA，方法步驟如下。
[0031](I)首先配制DNA提取液:100mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)，l%(w/v)CTAB, IOOmM EDTA(pH8.0),0.3M NaCl,0.01mM Tris-HCl (pH8.0)；
[0032](2)PVPP酸洗處理:稱(chēng)取IOg PVPP，加入3M HCl，浸泡12h，有濾紙過(guò)濾，用20mM磷酸鉀緩沖液(PH7.4)清洗攪拌PVPP，重復(fù)幾次直至懸浮液達(dá)到中性，將PVPP過(guò)濾，于50°C烘干；
[0033](3)稱(chēng)取Ig樣品于15mL離心管，加入0.25g酸化的PVPP，4mL提取緩沖液，混勻，70°C和液氮反復(fù)凍融3次，每次30min。最后一次溶解后，加入SDS至終濃度為1%，顛倒混勻，放置室溫20min, 5000rpm離心8min,取上清待用；
[0034](4)加入2mL提取液重懸沉淀，離心取上清，重復(fù)此步驟兩次，合并所有上清；
[0035](5)加入蛋白酶K至終濃度為0.2mg/mL，65°C水浴lh，加入0.5g酸化PVPP及0.5gSephadex G-200混勻，室溫結(jié)合30min, 5000rpm離心8min,取上清待用；
[0036](6)加入2mL提取液重懸沉淀，離心取上清，重復(fù)此步驟兩次，合并所有上清；
[0037](7)加入PEG-8000使其終濃度達(dá)到10%，加入NaCl使其終濃度為1.1M，放至4°C靜止2h后,分裝于2mL離心管中，4°C, 13000rpm離心IOmin,棄上清；
[0038](8)用75%乙醇洗滌2次，無(wú)水乙醇洗滌I次，真空濃縮至乙醇揮發(fā)完全，加入TE緩沖液溶解，_20°C保存。
[0039]取適量宏基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所得的宏基因組DNA片段完整性較好(見(jiàn)圖1)，經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切后成彌散條帶(見(jiàn)圖2)，證實(shí)其純度符合分子實(shí)驗(yàn)要求。
[0040]對(duì)照?qǐng)D1，為提取的宏基因組DNA電泳圖。泳道M為λ/Hind III Marker，片段大小從大到小依次為:23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb ;泳道1-9為從活性污泥中提取和純化的宏基因組DNA。
[0041]對(duì)照?qǐng)D2，為宏基因組DNA酶切后電泳圖。泳道M為λ/HindIIlMarker，片段大小從大到小依次為:23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb ;泳道I為宏基因組DNA用EcoR I和Pst I進(jìn)行雙酶切結(jié)果，泳道2為酶切前的宏基因組DNA。
[0042]步驟2:污染水樣活性污泥宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建，詳細(xì)方法如下。
`[0043]首先通過(guò)手工法提取宏基因組DNA，采用EcoR I和Pst I兩種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)宏基因組DNA進(jìn)行雙酶切。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收3-10kb的片段，與經(jīng)同樣的兩種限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切和純化的克隆載體pGEM-3Zf(+)連接，導(dǎo)入E.coli DH5 α宿主中，涂布于含有40 μ g/mL X_gal、40 μ g/mL IPTG及50 μ g/mLAmp的LA平板上進(jìn)行藍(lán)白篩選。將白色克隆挑至含有50 μ g/mL Amp的LA平板上，37°C倒置培養(yǎng)至菌落為2_3mm后，再次挑板，將轉(zhuǎn)化子挑取到文庫(kù)保存培養(yǎng)基于96孔培養(yǎng)板孔中，37°C恒溫培養(yǎng)24h左右，然后保存于_80°C低溫冰箱中。最終得到了 8500個(gè)白色轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取14個(gè)轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，用EcoR I和Pst I進(jìn)行酶切檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)14個(gè)帶有隨機(jī)插入的外源DNA片段，平均長(zhǎng)度為3.0kb,結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0044]對(duì)照?qǐng)D3，為活性污泥宏基因組文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)。泳道M為Ikb Marker,從上至下片段大小依次為:10.0kb, 8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb，3.0kb, 2.5kb，2.0kb, 1.5kb,1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp ;泳道1_14為隨機(jī)挑取的重組質(zhì)粒用EcoR I和Pst I進(jìn)行雙酶
切結(jié)果。
[0045]步驟3:采用直接測(cè)序篩選策略從宏基因組文庫(kù)中分離金屬蛋白酶基因，詳細(xì)方法如下。
[0046]為了獲得金屬蛋白酶基因，采用直接測(cè)序分離篩選方法，用雙脫氧核苷酸法在ABI377DNA自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)定DNA核苷酸序列。得到一個(gè)編號(hào)為pGXM16的陽(yáng)性克隆，攜帶一個(gè)可能的編碼延胡索酸還原酶的基因。如圖4所示，電泳檢測(cè)結(jié)果表明，pGXM16克隆所攜帶的外源DNA片段大小約為1.5kb。[0047]對(duì)照?qǐng)D4，為攜帶金屬蛋白酶基因克隆質(zhì)粒DNA的酶切檢測(cè)結(jié)果。泳道M為IkbLadder Marker,從上至下片段大小依次為:10.0kb, 8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb,
3.0kb, 2.5kb, 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp ;泳道 I 為克隆 pGXM16 質(zhì)粒 DNA 酶切之前的檢測(cè)結(jié)果；泳道2為克隆pGXM16質(zhì)粒DNA酶切之后的檢測(cè)結(jié)果。
[0048]步驟4:克隆pGXM16測(cè)序及生物信息學(xué)分析，詳細(xì)方法如下。
[0049]采用雙脫氧核苷酸法在ABI377DNA自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)定克隆pGXM16的核苷酸序列，用軟件DNA Star對(duì)測(cè)序所得到的序列進(jìn)行拼接。使用ORF Finder工具分析其測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)外源DNA片段中攜帶的可能的編碼金屬蛋白酶的新基因大小為1461bp，將該基因命名為pmel6A，其序列見(jiàn)序列表1。從5’端第I個(gè)核苷酸起始密碼子ATG到1461個(gè)堿基以終止密碼子TAA結(jié)束，存在一個(gè)完整的0RF，自5’端的第1-3位核苷酸為pmel6A基因的起始密碼子ATG，自5’端的第1459-1461位核苷酸為pmel6A基因的終止密碼子TAA，編碼一個(gè)由486個(gè)氨基酸組成的多肽。該基因編碼的相應(yīng)的氨基酸產(chǎn)物見(jiàn)圖5所示。
[0050]根據(jù)Blastp結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其與一個(gè)假設(shè)的Zn-dependent peptidase (依賴(lài)鋅離子肽酶)(GenBank登錄號(hào):YP_004863228.1)的基因的一致性為38%，相似性為54% ;與基因Peptidase M16domain protein (M16 家族妝酶)(GenBank 登錄號(hào):ΖΡ_09615990.I)的一致性為35%，相似性為55%。通過(guò)對(duì)氨基酸水平的相似性分析，ΡΜΕ16Α的氨基酸序列，與金屬蛋白酶中Μ16蛋白酶的氨基酸序列具有一定的相似性，因此，pmel6A基因可能是一個(gè)編碼金屬蛋白酶的基因。經(jīng)SMART分析后，PME16A蛋白從N端開(kāi)始，第I個(gè)氨基酸到第22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。第44個(gè)氨基酸到第17 9個(gè)氨基酸序列為Peptidase-Mie結(jié)構(gòu)域，第197個(gè)氨基酸到第377個(gè)氨基酸 序列為Peptidase-M16-C結(jié)構(gòu)域。PME16A蛋白序列存在一個(gè)HXXEH的保守氨基酸殘基結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是金屬蛋白酶的鋅離子結(jié)合位點(diǎn)。因此，PME16A可能具有金屬蛋白酶的功能。
[0051]對(duì)照?qǐng)D5,金屬蛋白酶基因pmel6A的核苷酸序列及其編碼的產(chǎn)物的氨基酸序列。
[0052]實(shí)施例2
[0053]pmel6A基因表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0054]利用美國(guó)Novagen公司提供的質(zhì)粒pET_32a(+)作為表達(dá)載體和E.coliBL21 (DE3) pLysS作為宿主細(xì)胞進(jìn)行目標(biāo)基因的異源高效表達(dá)。
[0055]根據(jù)pmel6A基因序列，利用相關(guān)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。正向擴(kuò)增引物Fl: 5’ -GCGAATTCATGCCCCTTTATCAGACCTTC-3，,引入 EcoR I 酶切位點(diǎn)；反向擴(kuò)增引物 Rl:5，-AACTCGAGGGGCGATTCGAGCTC-3'添加 Pst I 酶切位點(diǎn)。以 pGXM16 為模板，采用 Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增pmel6A基因，如圖6所示。提取表達(dá)載體pET_32 (a) +質(zhì)粒，用EcoR I和Pst I進(jìn)行雙酶切，純化后與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切并純化的pmel6A擴(kuò)增產(chǎn)物連接，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒，采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coli DH5ci，酶切驗(yàn)證后(見(jiàn)圖6)進(jìn)行測(cè)序。利用ExPASy網(wǎng)站相關(guān)軟件分析pGXPME16A的理論等電點(diǎn)和分子量，發(fā)現(xiàn)其理論等電點(diǎn)為5.95，分子量約為54kDa。
[0056]實(shí)施例二請(qǐng)參考圖6。圖6為表達(dá)重組質(zhì)粒PGXPME16A的檢測(cè)結(jié)果，I為Ikb LadderMaker,從上至下片段大小依次為:10.0kb, 8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb, 3.0kb,
2.5kb，2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp ;2 為用 EcoR I 和 Pst I 酶切 pGXPME16A之后的結(jié)果。[0057]實(shí)施例3
[0058]pmel6A基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。
[0059]提取序列正確的重組質(zhì)粒pGXPME16A，轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)表達(dá)宿主細(xì)胞。將已驗(yàn)證具有金屬蛋白酶活性的重組表達(dá)菌轉(zhuǎn)接于IOmL含有Amp和Cm的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。按1%接種量取200 μ L加入IOmL的LB培養(yǎng)基(含有Amp和Cm)中，370C，200rpm 振蕩培養(yǎng) 2_3h 至 0D_ 到 0.6-0.8，加入終濃度為 0.8mM 的 IPTG，28°C，200rpm誘導(dǎo)12h,制備粗酶液；采用Qiagen公司的His-Bind Purification Kit (組氨酸結(jié)合純化試劑盒)對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。制備的對(duì)照樣品以及分離純化得到的重組蛋白通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。
[0060]實(shí)施例三請(qǐng)參考圖7。圖7為重組質(zhì)粒PGXPME16A轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)PLysS誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE分析結(jié)果。泳道I為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品帶，自上而下大小依次為:116.0kDa, 66.2kDa, 45.0kDa, 35.0kDa, 25.0kDa, 18.4kDa, 14.4kDa ;泳道 2 為 E.coliBL21 (DE3)pLysS/pET-32a(+)全蛋白；泳道 3 為 Ε.coli BL21 (DE3)pLysS/pGXPME16A 全蛋白；泳道4為采用鎳柱親和層析技術(shù)分離純化得到的Pmel6A蛋白。
[0061]實(shí)施例4
[0062]溫度和pH對(duì)Pmel6A蛋白的酶活影響。
[0063]設(shè)置不同的溫度，測(cè)定重組蛋白Pmel6A的酶活。使用Thermo公司的酶標(biāo)儀，在660nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。
[0064]結(jié)果參見(jiàn)圖8，35°C時(shí)Pmel6A蛋白具有最高的酶活。
[0065]Pme 16A蛋白與底物在最適溫度下、不同pH值的緩沖液中測(cè)定Pmel6A蛋白的酶活:磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(6.0-8.`0) ；Tirs-HCl緩沖液(7.5-8.9) ；Gly-Na0H緩沖液(8.6-10.6)。
[0066]結(jié)果參見(jiàn)圖9，pH值為7.0時(shí)Pmel6A蛋白具有最高的酶活。
[0067]實(shí)施例5
[0068]不同金屬離子對(duì)Pmel6A蛋白活性影響。
[0069]在溫度35°C和pH7.0的條件下，在酶促反應(yīng)體系中，加入種類(lèi)不同的金屬離子，均為鹵化物，加入終濃度為2mM，測(cè)定酶活力，以未加入金屬離子的,在最適溫度和最適pH條件下的酶活力作100%,得出不同金屬離子的相對(duì)酶活力，如圖10所示。
[0070]結(jié)果顯示，金屬鋅離子(氯化物)可以刺激酶活提升至對(duì)照組的120%左右。表明Pmel6A蛋白酶活的提升，需要金屬鋅離子的刺激。
[0071]含有本發(fā)明基因的開(kāi)放閱讀框及其部分序列的表達(dá)載體、細(xì)胞系以及產(chǎn)物金屬蛋白酶等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種編碼金屬蛋白酶的基因pmel6A,其特征在于,其核苷酸序列如序列表N0.1所/Jn ο
2.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如序列表N0.2所示。
3.權(quán)利要求1所述的金屬蛋白酶的基因pmel6A,其特征在于,序列表N0.1中的DNA從5’端第I個(gè)核苷酸開(kāi)始起始密碼子ATG到第1461個(gè)核苷酸以終止密碼子TAA結(jié)束，存在一個(gè)完整的ORF (核苷酸1-1461)，自5’端的第1_3位核苷酸為pmel6A基因的起始密碼子ATG,自5’端的第1459-1461位核苷酸為pmel6A基因的終止密碼子TAA。
4.權(quán)利要求2所述 的蛋白質(zhì)在制備金屬蛋白酶中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/50GK103509810SQ201310450387
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】蔣承建, 黃捷, 古恒森, 曾蓉, 陳高, 申佩弘, 武波 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)