一種編碼β-葡萄糖苷酶的基因bglG及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種編碼β-葡萄糖苷酶的基因bglG，其核苷酸序列如序列表No.1所示；氨基酸殘基的序列如序列表No.2所示。序列表No.1中的DNA從5’端第1個(gè)核苷酸開(kāi)始起始密碼子ATG到1407個(gè)堿基以終止密碼子TAA結(jié)束，存在一個(gè)完整的ORF，自5’端的第1-3位核苷酸為bglG基因的起始密碼子ATG，自5’端的第1405-1407位核苷酸為bglG基因的終止密碼子TAA。本發(fā)明所述的編碼β-葡萄糖苷酶的基因bglG在生產(chǎn)烷基葡萄糖苷方面有重要的意義和廣泛的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種編碼β -葡萄糖苷酶的基因bgIG及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種編碼β-葡萄糖苷酶的基因bglG及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]烷基葡萄糖苷是一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的非離子表面活性劑，具有生物降解徹底、無(wú)毒和無(wú)刺激特性，作為主活性物廣泛用于洗滌、乳化、增溶、保濕等功能制品。烷基葡萄糖苷可以通過(guò)化學(xué)法或生物酶法合成，工業(yè)化生產(chǎn)的烷基葡萄糖苷主要采用化學(xué)法合成。化學(xué)法主要有Koenings-Khorr反應(yīng)制備法，乙酰化醇解法，糖的縮酮物醇解法以及直接糖苷法和轉(zhuǎn)糖苷法等。其中化學(xué)法合成生產(chǎn)烷基葡萄糖苷主要采用應(yīng)用直接糖苷化法和雙醇交換法。目前國(guó)內(nèi)已有遼寧鞍山化工一廠和江蘇南京梅山化工總廠等廠家采用化學(xué)法小規(guī)模生產(chǎn)烷基葡萄糖苷，但是在產(chǎn)品的色澤、氣味等指標(biāo)上與國(guó)外產(chǎn)品有較大差距，難以和國(guó)外廠商競(jìng)爭(zhēng)，因而目前國(guó)內(nèi)使用的烷基葡萄糖苷主要是從國(guó)外進(jìn)口，用于高檔洗滌用品。并且，傳統(tǒng)上的化學(xué)合成法成本高，工藝復(fù)雜，易造成環(huán)境污染，存在產(chǎn)物純度低和立體專(zhuān)一性問(wèn)題。研究與開(kāi)發(fā)酶法生物合成烷基葡萄糖苷，具有反應(yīng)條件溫和、工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，可以解決產(chǎn)物純度低和立體專(zhuān)一性問(wèn)題。因此，作為酶法生物合成烷基葡萄糖苷的β-葡萄糖苷酶，對(duì)其研究也就受到了廣泛的重視。
[0003]β -葡萄糖苷酶(beta-glucosidase, Bgl, EC3.2.1.21),是一類(lèi)糖基水解酶,廣泛地存在于自然界的細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物組織等中發(fā)揮其生理生化功能。β-葡萄糖苷酶可以通過(guò)縮合反應(yīng)和葡萄糖基轉(zhuǎn)移作用合成烷基葡萄糖苷。在縮合反應(yīng)途徑中，β_葡萄糖苷酶催化一個(gè)分子的單糖與一個(gè)分子的醇反應(yīng)生成一個(gè)分子的烷基葡萄糖苷和一個(gè)分子的水，而在葡萄糖基轉(zhuǎn)移作用途徑中，其催化一個(gè)分子的二糖與一個(gè)分子的醇反應(yīng)生成一個(gè)分子的烷基葡萄糖苷和一個(gè)分子的單糖。20世紀(jì)90年代以來(lái)，有不少學(xué)者嘗試?yán)貌煌瑏?lái)源的β -葡萄糖苷酶生物合成烷基 葡萄糖苷。例如Smaali等通過(guò)β -葡萄糖苷酶的葡萄糖基轉(zhuǎn)移作用，以300mg/mL的纖維二糖為供體，與受體己醇反應(yīng)30h后，可以生成18.3mM的己基葡萄糖苷(Hexyl glucoside)。Fischer等比較了市售的杏仁β -葡萄糖苷酶的反向水解反應(yīng)和葡萄糖基轉(zhuǎn)移作用:以纖維二糖為供體，通過(guò)葡萄糖基轉(zhuǎn)移作用，烷基葡萄糖苷的產(chǎn)量達(dá)到44.9% (V/V)，而以葡萄糖為供體，通過(guò)反向水解反應(yīng)，烷基葡萄糖苷的產(chǎn)量為
11.3%(V/V)等。
[0004]根據(jù)葡萄糖苷酶在細(xì)胞中的存在位置，可以分為胞內(nèi)葡萄糖苷酶和胞外 葡萄糖苷酶，物種不同，葡萄糖苷酶存在位置也有所不同。在細(xì)菌中，基因一般多為
單拷貝。不同來(lái)源的葡萄糖苷酶都遵循雙取代的反應(yīng)機(jī)制:首先葡萄糖苷酶與底物結(jié)合形成米氏復(fù)合物；其次，葡萄糖苷酶的活性中心通過(guò)變構(gòu)效應(yīng)與底物緊密結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了 β -葡萄糖苷酶的底物專(zhuān)一性，酶的親核基團(tuán)通過(guò)酸催化機(jī)制進(jìn)攻異頭碳，即形成共價(jià)酶與底物中間體；最后水分子按照堿催化機(jī)制進(jìn)攻異頭碳，酶恢復(fù)到初始質(zhì)子化態(tài)，生成相應(yīng)產(chǎn)物。
[0005]β -葡萄糖苷酶生物合成烷基葡萄糖苷需在水/醇兩相系統(tǒng)中進(jìn)行，醇既作為溶劑，又作為反應(yīng)受體。醇濃度越高，越有利于反應(yīng)向產(chǎn)物(烷基葡萄糖苷)方向進(jìn)行。而β-葡萄糖苷酶的活性需要一定水相來(lái)維持，醇濃度越高，β-葡萄糖苷酶活性越低?，F(xiàn)有研究表明β-葡萄糖苷酶在水/醇兩相系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化效率是限制其工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。因此，篩選新型β -葡萄糖苷酶，并研究其在水/醇兩相系統(tǒng)中高效合成烷基葡萄糖苷能力已經(jīng)成為當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0006]目前認(rèn)為限制β-葡萄糖苷酶催化反應(yīng)的主要問(wèn)題還在于酶的催化效率、成本以及產(chǎn)物提取分離困難等。尤其是β_葡萄糖苷酶在對(duì)強(qiáng)有機(jī)溶劑的耐受性方面，該酶的合成效率較低，雖然可用固定化和基因工程技術(shù)等改進(jìn)β-葡萄糖苷酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，來(lái)提高反應(yīng)效率，但是改善的程度也是十分有限，且耗時(shí)耗力耗資。所以，從自然環(huán)境中篩選高效產(chǎn)葡萄糖苷酶的菌種顯得非常重要。獲得編碼葡萄糖苷酶的新基因，不僅可以研發(fā)新的生物生產(chǎn)工藝提高烷基葡萄糖苷產(chǎn)量，也可以為構(gòu)建高產(chǎn)葡萄糖苷酶的基因工程菌提供新的理論依據(jù)和參考模式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種編碼β_葡萄糖苷酶的基因bglG及其應(yīng)用。通過(guò)構(gòu)建DNA文庫(kù)，采用酶的底物活性篩選策略，從基因文庫(kù)里面分離得到了編碼β -葡萄糖苷酶的新基因，可在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)該基因以生產(chǎn)葡萄糖苷酶，對(duì)于研發(fā)新的生物工藝大量生產(chǎn)烷基葡萄糖苷具有重要的意義和廣泛的用途。
[0008]本發(fā)明所提供的一種編碼β -葡萄糖苷酶的基因，名稱(chēng)為bglG，來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室從廣西南寧市某污染環(huán)境中篩選分離得到的微小桿菌Exiguobacterium sp.GXG2，具有下列核苷酸序列之一:
[0009]I) 一種編碼β -葡萄糖苷酶的基因bglG，其核苷酸序列為序列表N0.1所示。
[0010]2)所述基因編碼的蛋 白質(zhì)，其氣基酸序列如序列表N0.2所不。
[0011]攜帶該基因的質(zhì)粒E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保存，分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌Escher i ch i a Co I i，編號(hào)為CGMCCN0.7829，保存日期為2013年6月28日，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0012]序列表N0.1的DNA是克隆重組質(zhì)粒pETBG所含的外源DNA片段中攜帶的完整開(kāi)放閱讀框架(0RF，Open Reading Frame)，該ORF由1407個(gè)堿基組成，GC含量為50.25%。為一個(gè)可能完整的新型葡萄糖苷酶基因，新基因被命名為bglG。從5’端第I個(gè)核苷酸開(kāi)始起始密碼子ATG到1407個(gè)堿基以終止密碼子TAA結(jié)束，為一個(gè)完整的0RF，自5’端的第1-3位核苷酸為bglG基因的起始密碼子ATG，自5’端的第1405-1407位核苷酸為bglG基因的終止密碼子TAA。該ORF—共1407個(gè)核苷酸可編碼由468個(gè)氨基酸組成的蛋白。通過(guò)Blastx分析該氨基酸序列和來(lái)自于菌株“Bacillus megaterium WSH-002(巨大芽抱桿菌 WSH-002)、Exiguobacterium sp.S17 (微小桿菌 S17)和 Exiguobacteriumsp.ATlb (ATlb)” 的 “glycosyl hydrolase family protein (糖苷水解酶家族蛋白)、aryl-phospho-β -D-glucosidase (乙酸憐酸化-β-D-葡萄糖苷酶)和 β-glucosidase(β -葡萄糖苷酶)”基因(全基因組測(cè)序結(jié)果，暫未見(jiàn)有關(guān)其功能注釋的報(bào)道)存在最高的87%—致性，其余一致性均在74%以下。
[0013]本發(fā)明提供的一種編碼β -葡萄糖苷酶的基因的克隆方法包括下列步驟:[0014](I)從本課題組提取微小桿菌Exiguobacterium sp.GXG2基因組DNA,構(gòu)建DNA文庫(kù)；
[0015](2)基于底物活性的篩選策略，從DNA文庫(kù)中分離含有葡萄糖苷酶活性的克隆。
[0016]本發(fā)明提供的編碼葡萄糖苷酶的新基因，可在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)該基因以生產(chǎn)β_葡萄糖苷酶，在構(gòu)建新的生物工藝生產(chǎn)烷基葡萄糖苷方面具有廣泛的用途。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1 為微小桿菌 Exiguobacterium sp.GXG2 基因組 DNA。
[0018]圖2為DNA文庫(kù)克隆的限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI酶切分析以判斷文庫(kù)質(zhì)量。
[0019]圖3為原始克隆pGEMBO的酶切檢測(cè)結(jié)果。
[0020]圖4為bglG基因DNA序列以及編碼產(chǎn)物分析圖。
[0021]圖5為重組表達(dá)克隆E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG的構(gòu)建檢測(cè)分析。
[0022]圖6為攜帶bglG基因的重組質(zhì)粒pETBG的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTuner (DE3)PLacI后得到的重組表達(dá)克隆的蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0023]圖7為不同溫度對(duì)BglG重組蛋白的酶活影響。
[0024]圖8為不同pH值對(duì)BglG重組蛋白的酶活影響。
[0025]圖9為薄層層析技術(shù)分析甲基葡萄糖苷和正辛基葡萄糖苷的合成。
【具體實(shí)施方式】
[0026]在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的主要材料包括:EcoRI限制性內(nèi)切酶、PstI限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、pGEM-3Zf (+)載體購(gòu)自Promega公司，胰蛋白胨、p_NPG(英文全稱(chēng):p-nitrophenyl- β -D-glucopyranoside)購(gòu)自上海生物工程有限公司。
[0027]實(shí)施例1
[0028]一種編碼β -葡萄糖苷酶的基因bglG的克?。恢饕ㄏ率霾襟E1、2、3、4、5。
[0029]步驟1:從微小桿菌Exiguobacterium sp.GXG2中提取基因組DNA,采用BioFlux公司的Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，詳細(xì)的方法步驟描述如下。
[0030](1)收集適當(dāng)?shù)奈⑿U菌Exiguobacterium sp.GXG2菌液,通過(guò)離心盡可能地去除
上清液。
[0031](2)向菌體中加入100 μ L EL Buffer (EL緩沖液)，并用槍頭吹打混勻。
[0032](3)將其放入37°C中進(jìn)行溫育40min (革蘭氏陽(yáng)性菌適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間)。
[0033](4)向其中加入 RS Buffer (RS 緩沖液)100 μ L 和 PK Solution (PK 溶液)10 μ L并徹底混勻，然后再加入20mg/mL的RNase A (RNA溶解酶)2 μ L并混勻。
[0034](5)將其在 56°C中放置 15min。
[0035](6)向其中加入GA Buffer (GA緩沖液)200 μ L并進(jìn)行混勻。
[0036](7)在12000Xg條件下進(jìn)行離心lmin。
[0037](8)取一個(gè)新的1.5mL離心管，將上清液移入其中。
[0038](9)向其中加入BA Buffer (BA緩沖液)400 μ L并進(jìn)行混勻。
[0039](10)取出離心柱，并將混合液移入其中，在10000Xg條件下進(jìn)行離心lmin，并去除接液管的液體。
[0040](11)再將G Binding Buffer (G結(jié)合緩沖液)500 μ L加入離心柱中，在10000 X g條件下進(jìn)行離心30s，然后去除接液管液體。
[0041](12)將Wash Buffer (洗脫緩沖液)500 μ L加入離心柱中，在10000X g條件下進(jìn)行離心30s,然后去除接液管液體。
[0042]( 13)把12.的操作再重復(fù)一次。
[0043](14)再把離心柱在10000 Xg條件下進(jìn)行離心lmin，然后取一個(gè)新的1.5mL離心
管，并將離心柱轉(zhuǎn)至其中 。
[0044](15)將IOOyL Elution Buffer (洗滌緩沖液)加入到離心柱中，并在室溫下放置Imin0
[0045](16)將其在12000Xg條件下進(jìn)行離心lmin，離心管中即是DNA溶液，丟棄離心柱。
[0046](17)將DNA溶液放置于-20°C保存。
[0047]步驟2:采用BioFlux公司的Biospin膠回收試劑盒回收3_10kb的酶切后基因組DNA，詳細(xì)的方法步驟描述如下。
[0048](I)首先用干凈的刀片，將含有目的DNA片段瓊脂糖凝膠進(jìn)行切割，放進(jìn)離心管中。
[0049](2)向離心管中加入提取緩沖液，加入的提取緩沖液的微升體積:切下來(lái)的凝膠質(zhì)量毫克數(shù)=3: I。
[0050](3)將其放入50°C水浴鍋中進(jìn)行溫育大約15min。
[0051](4)向其中加入異丙醇，加入異丙醇的微升體積:切下來(lái)的凝膠質(zhì)量毫克數(shù)=1: I。
[0052](5)取出離心柱，將液體移入其中，在6000rpm條件下離心lmin，并倒掉接液管中液體。
[0053](6)將提取緩沖液500 μ L加入離心柱中，在12000rpm條件下進(jìn)行離心lmin，并倒
掉接液管中的液體。
[0054](7)將洗脫緩沖液750 μ L加入離心柱中，并在12000rpm條件下進(jìn)行離心lmin，并
倒掉接液管中的液體。
[0055](8)再在12000rpm條件下將離心柱離心lmin，然后把離心柱轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
[0056](9)把梯度淋洗緩沖液或者蒸餾水40-60 μ L加入到離心柱中，并放置l_2min。
(10)把離心柱于12000rpm條件下進(jìn)行Imin離心，丟掉離心柱，離心管中的液體即是DNA溶液，放于零下20°C進(jìn)行保存。
[0057]對(duì)照?qǐng)D1。在實(shí)施主要步驟I和2中，其中泳道I為λ/HindIII標(biāo)準(zhǔn)樣，片段大小從大到小依次為:23.13kb，9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb ;泳道2為微小桿菌Exiguobacterium sp.GXG2 基因組 DNA,跑樣量為 3 μ L。
[0058]步驟3:微小桿菌 Exiguobacterium sp.GXG2DNA 文庫(kù)的構(gòu)建。
[0059]首先采用BioFlux公司的Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取克隆載體pGEM-3Zf(+)質(zhì)粒DNA，獲得較高純度質(zhì)粒DNA，其主要形式是超螺旋CCC，經(jīng)過(guò)EcoRI和PstI酶雙酶切，變?yōu)榫€性DNA分子，直接用來(lái)連接部分酶切微小桿菌Exiguobacteriumsp.GXG2 基因組 DNA。
[0060]用EcoRI和PstI對(duì)純化好的微小桿菌Exiguobacterium sp.GXG2基因組DNA進(jìn)行部分酶切，瓊脂糖電泳分離酶切產(chǎn)物，將這些片段與pGEM-3Zf(+) DNA連接，連接產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α ,在含有X-gal、IPTG、氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani固體平板上檢測(cè)含有重組子的白色大腸桿菌菌落。X_gal、IPTG、氨芐青霉素的濃度分別為:40μ g/mL、40 μ g/mL、50 μ g/mL。
[0061]將陽(yáng)性單菌落挑板至含有50 μ g/mL氨節(jié)青霉素的加有七葉苷的Luria-Bertani固體平板上，37°C培養(yǎng)至菌落為2-3mm后，再次挑板，將轉(zhuǎn)化子挑取到文庫(kù)保存培養(yǎng)基于96孔培養(yǎng)板孔中，37°C恒溫培養(yǎng)24h左右，然后保存于_80°C低溫冰箱中。最終得到了 10080個(gè)左右的白色克隆。隨機(jī)挑取11個(gè)轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，然后用EcoRl和Pstl雙酶切檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)8個(gè)有隨機(jī)插入的外源DNA片段，理論平均長(zhǎng)度為3.0kb左右。
[0062]對(duì)照?qǐng)D2，其中，泳道I和15為Ikb ladder標(biāo)準(zhǔn)樣，片段大小從大到小依次為:
10.0kb, 8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb，3.0kb, 2.5kb, 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb，750bp，500bp, 250bp ;泳道2和14為經(jīng)過(guò)EcoRI和PstI酶切的pGEM_3Zf (+)質(zhì)粒DNA ;其它泳道
3-13分別為文庫(kù)克隆質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)EcoRI和PstI酶切以后的分析結(jié)果。
[0063]步驟4:從DNA文庫(kù)中分離篩選表達(dá)β -葡萄糖苷酶活性的克隆。 [0064]采用底物活性分離篩選方法，在含有七葉苷的Luria-Bertani固體平板上進(jìn)行點(diǎn)板，有黑色圈形成的菌落即為陽(yáng)性克隆。得到一個(gè)編號(hào)為pGEMBO的陽(yáng)性克隆，攜帶一個(gè)可能的編碼β_葡萄糖苷酶的基因。電泳檢測(cè)結(jié)果表明，PGEMBO克隆所攜帶的外源DNA片段大小為6.5kb。
[0065]對(duì)照?qǐng)D3。其中，泳道I為Ikb ladder標(biāo)準(zhǔn)樣,片段大小從大到小依次為:10.0kb,8.0kb, 6.0kb, 5.0kb, 4.0kb, 3.5kb，3.0kb, 2.5kb, 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp,250bp ;泳道2為經(jīng)過(guò)EcoRI和PstI酶切的pGEM_3Zf (+)質(zhì)粒DNA ;泳道3_5為EcoRI和PstI酶切陽(yáng)性克隆pGEMBO質(zhì)粒DNA的結(jié)果。
[0066]步驟5:重組質(zhì)粒E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG上表達(dá)β -葡萄糖苷酶活性的基因的測(cè)序和開(kāi)放閱讀框ORF分析。
[0067]用軟件DNAStar對(duì)直接測(cè)序所得到的序列進(jìn)行拼接,用NCBI (National Centerfor Biotechnology Information, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)上的軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行分析，如 ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), Blast (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)。
[0068]對(duì)照?qǐng)D4，外源DNA片段中攜帶的可能的編碼β -葡萄糖苷酶的新基因大小為1407bp。從5’端第I個(gè)核苷酸開(kāi)始起始密碼子ATG到1407個(gè)堿基以終止密碼子TAA結(jié)束，存在一個(gè)最有可能的完整的0RF，自5’端的第1-3位核苷酸為bglG基因的起始密碼子ATG，自5’端的第1405-1407位核苷酸為bglG基因的終止密碼子TAA。經(jīng)過(guò)Blastn軟件比較，目標(biāo)ORF序列在DNA水平上只能與Exiguobacterium sp.ATlb (微小桿菌ATlb)的全基因組序列能匹配上。表達(dá)葡萄糖苷酶活性的基因bglG編碼一個(gè)含468個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，用簡(jiǎn)單組件結(jié)構(gòu)研究工具(英文名稱(chēng):Simple Modular Architecture Research Tool,SMART, http://smart, embl-heidelberg.de)分析，由DNA序列推測(cè)的表達(dá)β -葡萄糖苷酶活性的BglG蛋白組件結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能的獨(dú)立催化區(qū)域功能結(jié)構(gòu)，該催化結(jié)構(gòu)域由第I個(gè)氨基酸開(kāi)始，到第466個(gè)氨基酸結(jié)束。編碼目標(biāo)蛋白的基因一共包含1404個(gè)核苷酸，編碼一個(gè)由468個(gè)氨基酸組成的多肽，用Blastp分析該ORF氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列和來(lái)自于菌株 “Bacillus megaterium WSH-002 (巨大芽抱桿菌 WSH-002)、Exiguobacteriumsp.S17 (微小桿菌 S17)和 Exiguobacterium sp.ATlb (微小桿菌 ATlb))” 的 “glycosylhydrolase family protein (糖基水解酶家族蛋白)、&^111108口110-0-0-8111(308丨(1386 (芳香磷酸化-β-D-葡萄糖苷酶)和β-glucosidase ( β -葡萄糖苷酶)”基因(全基因組測(cè)序結(jié)果，暫未見(jiàn)有關(guān)其功能注釋的報(bào)道)存在最高的87%—致性，其余比較蛋白的一致性均在74%以下。
[0069]該氨基酸序列編碼的唯一保守性假定蛋白沒(méi)有明顯的親疏水性，沒(méi)有形成明顯的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，也不存在低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)。ExPASy網(wǎng)站相關(guān)軟件分析bglG基因編碼的產(chǎn)物的理論等電點(diǎn)/分子量為:5.06/53.1kDa0
[0070]對(duì)照?qǐng)D4，bglG基因DNA序列以及目標(biāo)ORF所編碼的氨基酸序列分析。
[0071]實(shí)施例2
[0072]bglG基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0073]利用美國(guó)Novagen公司提供的質(zhì)粒pETBlue_2作為表達(dá)載體和E.coliTuner (DE3)pLac?作為宿主細(xì)胞進(jìn)行目標(biāo)基因的異源高效表達(dá)；設(shè)計(jì)正向引物FMl:5’_CCGGAATTCTATGAAAATGCCAAAAGATTT-3 ’ (加下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn));設(shè)計(jì)反向引物FM2:5’ -TAACTGCAGTAGTTCAGCAGCACGTGTCG-3’(加下劃線部分為 PstI 酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增目標(biāo) 0RF，一共1404個(gè)核苷酸。將PCR產(chǎn)物與pETBlue-2載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并在含X-gal和IPTG的Luria-Bertani固體平板上篩選正確的陽(yáng)性克隆，將包含重組表達(dá)質(zhì)粒DNA的大腸桿菌細(xì)胞命名為pETBG。將pETBG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Ε.coli Tuner (DE3) pLacI得菌株Tuner(DE3)pLacI/pETBG。
[0074]重組質(zhì)粒E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG已在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心完成微生物保存，CGMCC N0.7829，保存日期為2013年6月28日。
[0075]實(shí)施例2請(qǐng)參見(jiàn)圖5。圖5為重組質(zhì)粒E.coli Tuner (DE3)pLacI/pETBG的構(gòu)建檢測(cè)結(jié)果。泳道I為Ikb ladder標(biāo)準(zhǔn)樣,片段大小從大到小依次為:10.0kb, 8.0kb, 6.0kb,5.0kb, 4.0kb, 3.5kb, 3.0kb, 2.5kb, 2.0kb, 1.5kb, 1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp ;泳道 2 為質(zhì)粒pETBlue-2限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI酶切后檢測(cè)結(jié)果，跑樣量為3 μ L ;泳道3:使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和PstI酶切Ε.coli Tuner (DE3) pLacI/pETBG之后的質(zhì)粒DNA檢測(cè)結(jié)果，跑樣量為3 μ L。
[0076]實(shí)施例3
[0077]BglG目標(biāo)蛋白在大腸桿囷系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。
[0078]將已被驗(yàn)證正確的具有活力的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)接于IOmL含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10-15h。從IOmL LB菌液中取2_3mL加入到盛有200mL含有氨芐青霉素和氯霉素的LB液體培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)。2_3h后取出ImL菌液測(cè)定0D_，當(dāng)OD6tltl到0.4-0.6的時(shí)候加入IPTG至終濃度為0.8mmo/L, 20°C、220rpm振蕩培養(yǎng)6h后，制備粗酶液；采用QIAGEN公司的N1-NTA瓊脂糖金屬鎳親和層析介質(zhì)Sepharose CL-6B對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。對(duì)制備的對(duì)照樣品以及分離純化的目標(biāo)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白表達(dá)檢測(cè)。[0079]實(shí)施例3請(qǐng)參見(jiàn)圖6。圖6為重組質(zhì)粒pETBG所攜帶bglG基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Tuner (DE3)pLacI后得到的重組表達(dá)克隆的SDS-PAGE分析結(jié)果。泳道5和10為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品帶，自上而下大小依次為:116.0kDa, 66.0kDa, 45kDa, 35kDa, 25.0kDa, 18.8kDa ;泳道1-4和泳道6-9為采用鎳柱親和層析技術(shù)分離純化得到的BglG蛋白檢測(cè)結(jié)果，跑樣量為5 μ L0
[0080]實(shí)施例4
[0081]不同溫度和不同pH條件對(duì)β -葡萄糖苷酶的酶活影響。
[0082]從20°C到65°C，設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)溫度條件，測(cè)定不同溫度下重組蛋白BglG的酶活。使用的分析儀器有:Switzerland TECAN集團(tuán)公司U Quamt TM酶標(biāo)儀,在410nm波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)OD值的變化。
[0083]結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在35°C時(shí)目標(biāo)蛋白具有最聞的酶活。
[0084]在其它條件相同的情況下設(shè)置不同pH值(4.0,5.0,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5、9.0,9.5、10.0)，測(cè)定不同pH值下重組蛋白BglG的酶活。
[0085]結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖8，結(jié)果顯示pH值為7.0的目標(biāo)蛋白具有最高的酶活。
[0086]實(shí)施例5
[0087]薄層層析技術(shù)分析甲基葡萄糖苷和正辛基葡萄糖苷的酶法合成。
[0088]酶法合成反應(yīng)體系為5mL。體系包括:lmL的IOmM的纖維二糖，加入10% -40%的甲醇或正辛醇，又加入500微`克左右的BglG重組蛋白，其余的補(bǔ)充0.1M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)至5mL。反應(yīng)在40°C搖動(dòng)6h后加入3mL冰醋酸停止反應(yīng)，將反應(yīng)管置于乙醇浴2min，零下20°C下過(guò)夜靜置后，離心后用于薄層層析。
[0089]離心后的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Silica gel60F254招板點(diǎn)樣后,兩種展開(kāi)劑分別將其展開(kāi)后噴上加有2% H2SO4的乙醇，放于烘箱中，在120°C下加熱20min后取出觀察結(jié)果。展開(kāi)劑I為:乙酸乙酯:甲醇:水=14:5:1 ;展開(kāi)劑2為:2_丙醇:乙醇:水=6:2:2。
[0090]結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖9，表明合成體系中有甲基糖苷或正辛基糖苷的生成。泳道1-4:標(biāo)樣依次是葡萄糖，纖維二糖，甲基_β -D-吡喃葡萄糖苷，η-辛基-β -D-吡喃葡萄糖苷；泳道5和6 =BglG重組蛋白催化合成的甲基葡萄糖苷；泳道7和8 =BglG重組蛋白催化合成的正辛基葡萄糖苷。
[0091]含有本發(fā)明基因的啟動(dòng)子、開(kāi)放閱讀框及其部分序列的表達(dá)載體、細(xì)胞系以及產(chǎn)物烷基葡萄糖苷的酶法合成等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種編碼β-葡萄糖苷酶的基因bglG，其特征在于，其核苷酸序列為序列表N0.1所/Jn ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼葡萄糖苷酶的基因bglG，其特征在于，其核苷酸序列從5’端第I個(gè)核苷酸開(kāi)始起始密碼子ATG到1407個(gè)堿基以終止密碼子TAA結(jié)束，存在一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框架1-1407，自5’端的第1-3位核苷酸為bglG基因的起始密碼子ATG，自5’端的第1405-1407位核苷酸為bglG基因的終止密碼子TAA。
3.權(quán)利要求1所述基因所編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如序列表N0.2所/Jn ο
4.權(quán)利要求3所述`的蛋白質(zhì)在制備烷基葡萄糖苷中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103525844SQ201310450366
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】蔣承建, 古恒森, 曾蓉, 陳高, 黃琴, 申佩弘, 武波 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)