一種檢測ngal和糖化血紅蛋白的檢測試紙的制作方法
【專利摘要】本實用新型涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、檢測線a、檢測線b、質(zhì)控線和PVC底板，所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸水紙依次搭接在所述PVC底板上，所述檢測線a、檢測線b、所述質(zhì)控線依次包被于硝酸纖維素膜，所述結(jié)合墊包被有NGAL、HbA1c單克隆抗體—膠體金標記物層；所述檢測線a包被有NGAL單抗，所述檢測線b包被有HbA1c單抗，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG；采用本方案的一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、批間差異小、檢測快速、準確的優(yōu)點。
【專利說明】
一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本實用新型涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用膠體金免疫層析法測 定人血液中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白和糖化血紅蛋白含量的一種檢測NGAL和糖 化血紅蛋白的檢測試紙。
【背景技術(shù)】
[0002] NGAL分子量為25kD，是脂質(zhì)運載蛋白Iipocalin超家族的2號成員，Kjeldsen在 1993年在人中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)。NGAL與明膠酶B，即基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)共價結(jié)合，形 成1351kD的異二聚體蛋白，由人類中性粒細胞分泌。研究表明，機體暴露在外界有害理化及 生物因素下，全血NGAL濃度明顯高于正常水平?，F(xiàn)代研究顯示，生理狀態(tài)下，NGAL不僅在中 性粒細胞表達，還在其他一些組織如胃壁細胞、肝膽管細胞、小腸潘氏細胞和腎近曲小管細 胞等均有表達。NGAL參與不同的生理及病理過程，涉及炎癥免疫應答、腫瘤的發(fā)生發(fā)展的各 階段，并且與腎損傷的發(fā)生發(fā)展密不可分。在缺血、中毒等損傷因素造成腎小管上皮細胞 NGAL高表達，使其在血液和尿液中能夠被檢出，而且升高早于血肌酐升高。
[0003] NGAL作為新型AKI早期診斷標志物，在缺血性、膿毒性、腎移植以及早期糖尿病等 的情況下均能在尿液和血液中檢測到，并且靈敏度高，能作為更早的診斷指標。
[0004] 糖化血紅蛋白（HbAlc)是人體血液中紅細胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物。血 糖和血紅蛋白的結(jié)合生成糖化血紅蛋白是不可逆反應，并與血糖濃度成正比，且保持120 天左右，所以可以觀測到120天前。糖化血紅蛋白的含量變化可以作為糖尿病監(jiān)測和診斷的 指標。
[0005] 我國腎病患者已達1.5億人，其中糖尿病患者已高達9800萬人，其他檢測方法由于 時間長、費用高。為我國糖尿病和腎病監(jiān)控和診斷帶來了巨大的困難。
[0006] 鑒于此，本實用新型研究和設(shè)計了一種檢測人血液中中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì) 運載蛋白和糖化血紅蛋白的一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙。 【實用新型內(nèi)容】
[0007] 本實用新型的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡便、批間差異小、檢 測快速、準確并適合床旁檢測人血液中中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白含量和糖化血 紅蛋白（HbAlc)的一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙，以便對急性腎損傷、糖尿病的 早期診斷和治療監(jiān)控。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本實用新型提供一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙，包 括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、檢測線a、檢測線b、質(zhì)控線和PVC底板，所述樣品 墊、所述結(jié)合墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸水紙依次搭接在所述PVC底板上，所述檢測線 a、檢測線b、所述質(zhì)控線依次包被于硝酸纖維素膜，所述結(jié)合墊包被有NGAUHbAlc單克隆抗 體一膠體金標記物層;所述檢測線a包被有NGAL單抗，所述檢測線b包被有HbAl c單抗，所述 質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgG。
[0009]本實用新型一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙的制備方法，包括以下步 驟：
[0010]步驟一、膠體金的制備:取1個500mL圓底燒瓶，加入IOOmL去離子水，圓底燒瓶上端 接一回流冷凝管，于恒溫磁力攪拌器上使用溫度檔350°C對其進行加熱，轉(zhuǎn)速420r/min，加 熱至第5min，加入125yL 1%氯金酸。繼續(xù)加熱5min至沸騰狀態(tài)后，沸騰的標準是水溫為100 °C，向圓底燒瓶中快速加入250yL 10%檸檬酸三鈉溶液，圓底燒瓶中溶液由紫變紅后繼續(xù) 加熱反應10min，直至溶液透亮后，停止加熱，繼續(xù)以420r/min攪拌5min，冷卻至室溫，4°C密 封保存，即制得膠體金。
[0011]步驟二、金標抗體的制備:取ImL膠體金于1.5mL離心管中，調(diào)節(jié)pH至8.5。向離心管 中加入10以8/111]^的如41^單克隆抗體、81^/111]^的池41(3單克隆抗體，混勾后靜置1〇111；[11，向離心 管中加入IOOyL 10 %BSA溶液，混勻后靜置5min，制得金標抗體，即NGAL、HbAlc抗體一膠體 金標記物。
[00?2] 將制得的金標抗體溶液于4 °C 13500r/min離心10min，去除上清液，將沉淀用金標 稀釋溶液稀釋至原體積3/2，于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0013] 步驟三、NGAL單克隆抗體、HbAl c單克隆抗體、羊抗鼠 IgG包被:取稀釋至0.5mg/mL NGAL單克隆抗體、0.5mg/mL HbAlc單克隆抗體和I .Omg/mL羊抗鼠 IgG，采用dispent劃膜儀 分別包被至硝酸纖維素膜的檢測線a、檢測線b和質(zhì)控線位置。其中0.5mg/mL NGAL單克隆抗 體中含0.3%甲醇，0.51^/111^?^1(3單克隆抗體中含2.5%蔗糖，檢測線 &距質(zhì)控線距離為 14mm，檢測線b距質(zhì)控線距離為8mm，劃膜濃度均為]^1^/〇11，平臺移動速度為4〇1111]1/8。
[0014] 步驟四、試紙條的組裝：（1)將硝酸纖維素膜，即NC膜，和吸水紙分別粘貼于PVC底 板上，吸水紙壓住NC膜上方2mm; (2)將粘貼好NC膜和吸水紙的PVC底板在切條機上切割成 4_寬的試紙(3)將樣品墊和結(jié)合墊切成4mm寬的條，同時將結(jié)合墊浸泡于金標抗體溶液中， 并放置于37攝氏度恒溫恒濕干燥箱中烘干，制得金標墊；（4)烘干后的金標墊按長度Icm進 行裁剪。將金墊粘貼于PVC底板上，壓住NC膜下方2mm，同時用樣品墊壓住金標墊下方2mm。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型具有下列優(yōu)點：
[0016] 1、本實用新型的檢測人血液中中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白和糖化血紅 蛋白一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙，具有特異性強、靈敏度高、檢測時間短、批 間差異小、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點
[0017] 2、本實用新型的檢測試紙條檢測時間短，出報告時間快。
[0018] 3、本實用新型的檢測試紙條操作簡便，不需要專業(yè)人員操作。
[0019] 4、本實用新型對膠體金的制備實現(xiàn)程序化操作，大大降低了批間差異。
[0020] 5、本實用新型的抗體標記時間短，比傳統(tǒng)時間縮短了 30min以上。
[0021] 6、本實用新型的樣品墊和金墊具有優(yōu)異的釋放能力和吸水能力，有著更高準確 度。
[0022] 7、本實用新型中抗體在NC膜上包被方式可以提高免疫層析試紙條的穩(wěn)定性和親 水性。
[0023] 8、本實用新型采用氯化鈉破壞法確定最終抗體標記濃度，提高試紙條靈敏度的同 時降低抗體用量，節(jié)約了成本。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本實用新型一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖：
[0025] 圖2為本實用新型一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙檢測模式圖；
[0026] 圖3為制備本實用新型一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙的NGAL的線性范 圍相關(guān)性；
[0027]圖4為制備本實用新型一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙的HbAlc的線性 范圍相關(guān)性。
[0028] 其中，1為樣品墊，2為結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為吸水紙，5為檢測線a，6為檢測 線b，7為質(zhì)控線，8為PVC底板，9為加樣孔，T為層析方向。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本實用新型作進一步詳細的說明：
[0030] 如圖1、2所示本實用新型揭示了一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙，包括 樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3、吸水紙4、檢測線a 5、檢測線b 6質(zhì)控線7和PVC底板8。所 述樣品墊1、所述結(jié)合墊2、所述硝酸纖維素膜3及所述吸水紙4依次粘接在所述PVC底板8 上;所述結(jié)合墊2包被有NGAUHbAlc克隆抗體一膠體金標記物;所述檢測線a 5上包被有中 性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白單克隆抗體，所述檢測線b 6上包被有糖化血紅蛋白單 克隆抗體，所述質(zhì)控線7上包被有羊抗鼠 IgG。
[0031 ] -種制備一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙的制備方法，包括以下步驟： [0032] 步驟一、膠體金的制備：取一個500mL的圓底燒瓶，加入IOOmL去離子水，圓底燒瓶 上端接一根回流冷凝管，于恒溫磁力攪拌器上使用溫度擋350°C對其進行加熱，轉(zhuǎn)速420r/ min，加熱至第5min，加入125uL 1 %氯金酸。繼續(xù)加熱5min至沸騰狀態(tài)后，沸騰的標準是水 溫為100 °C，向圓底燒瓶中快速加入250yL 10 %檸檬酸三鈉溶液，圓底燒瓶中溶液由紫變紅 后繼續(xù)加熱反應1〇111；[11，直至溶液透亮后，停止加熱，繼續(xù)以4201'/1]1；[11攪拌51]1；[11，冷卻至室 溫，4 °C密封保存，即制得膠體金。
[0033] 步驟二、金標抗體的制備:取ImL膠體金于1.5mL離心管中，調(diào)節(jié)pH至8.5。向離心管 中加入10以8/111]^的如41^單克隆抗體、81^/111]^的池41(3單克隆抗體，混勾后靜置1〇111；[11，向離心 管中加入IOOyL 10 %BSA溶液，混勻后靜置5min，制得金標抗體，即NGAL、HbAlc抗體一膠體 金標記物。
[0034] 將制得的金標抗體溶液于4°C13500r/min離心10min，去除上清液，將沉淀用金標 稀釋溶液稀釋至原體積3/2，于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0035] 步驟三、NGAL單克隆抗體、HbAl c單克隆抗體、羊抗鼠 IgG包被:取稀釋至0.5mg/mL NGAL單克隆抗體、0.5mg/mL HbAlc單克隆抗體和I .Omg/mL羊抗鼠 IgG，采用dispent劃膜儀 分別包被至硝酸纖維素膜的檢測線a、檢測線b和質(zhì)控線位置。其中0.5mg/mL NGAL單克隆抗 體中含0.3%甲醇，0.51^/111〇^41(3單克隆抗體中含2.5%蔗糖，檢測線 &距質(zhì)控線距離為 14mm，檢測線b距質(zhì)控線距離為8mm，劃膜濃度均為]^1^/〇11，平臺移動速度為4〇1111]1/8。
[0036]步驟四、試紙條的組裝：（1)將硝酸纖維素膜，即NC膜，和吸水紙分別粘貼于PVC底 板上，吸水紙壓住NC膜上方2mm; (2)將粘貼好NC膜和吸水紙的PVC底板在切條機上切割成 4mm寬的試紙條；（3)將樣品墊和結(jié)合墊切成4mm寬的條，同時將結(jié)合墊浸泡于金標抗體溶液 中，并放置于37攝氏度恒溫恒濕干燥箱中烘干，制得金標墊；（4)烘干后的金標墊按長度Icm 進行裁剪。將金墊粘貼于PVC底板上，壓住NC膜下方2mm，同時用樣品墊壓住金標墊下方2mm。
[0037] 作為實施的優(yōu)選方式:在所述步驟一之前對實驗所用容器的清洗:首先將實驗用 玻璃容器浸泡于5 %二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備 用。
[0038] 作為實施的優(yōu)選方式:在所述步驟一中，所用去離子水電阻率為18.2Ω。
[0039]作為實施的優(yōu)選方式:在所述步驟二中，金標稀釋液為含有3 環(huán)糊精、0.01 % 酪蛋白、0.5%83厶、0.05%吐溫的?!1為7.4，的0.0謂的?83。
[0040]作為實施的優(yōu)選方式:在所述步驟四（3)中，還包括對樣品墊進行前處理的步驟， 即將樣品墊用切條機分別切成4mm的長條，用含有5%的蔗糖、I %BSA、0.2 %吐溫的pH為7.6 的0.01M的PBS。
[0041 ]抗體最佳標記量的確定：
[0042]氯化鈉破壞法:取20支1.5mL離心管，對其從1 一20編號，分別加入ImL膠體金溶液， 然后加入IOyl 〇 · IM K2CO3調(diào)節(jié)pH，混勾。1 一10管加入0以8、2以8、4以8、6以8、8以8、1(^8、12以8、14 yg、16yg、18yg中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體，11 一20管加入Oyg、2yg、4yg、6yg、 8yg、10yg、12yg、14yg、16yg、18yg糖化血紅蛋白抗體，震蕩混勾。最后1至20號管分別IOOyL 10%NaCl溶液，靜置觀察每支離心管的顏色變化，當有離心管顏色變?yōu)樽仙珪r說明該抗體 濃度不是最適合標記濃度，顏色保持紅色不變的標記濃度為適合標記濃度，保持紅色不變 的最低標記濃度為最小標記量。
[0043]表一：中性粒細胞明Jj父酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體最佳蛋白標記量的確定
[0045]表二:糖化血紅蛋白抗體最佳標記量確定
[0047]抗體最佳標記pH值的確定
[0048]氯化鈉破壞法:取7支1.5mL離心管，對其從1 一7編號，分別加入ImL膠體金溶液，然 后按1 一7序號分別將膠體金溶液pH值調(diào)整至6、7、7.5、8、8.5、9、9.5，混勻。再加入IOng中性 粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白抗體和Sng糖化血紅蛋白抗體，震蕩混勻。最后1至7號管分 別IOOyL 10 %NaCl溶液，靜置觀察每支離心管的顏色變化，當有離心管顏色變?yōu)樽仙珪r說 明該PH值不是最適合標記pH值，顏色保持紅色不變的pH值為最適合標記pH值。
[0049]表三:最佳標記pH值的確定
[0051 ]試紙條性能測試 [0052] 1試紙條的靈敏度
[0053]將0.5mg/mL中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白標準品溶液用陰性全血分別稀 釋為 Ong/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1500ng/mL 的一系列標準溶 液，每個標準濃度取50μ1，加入200yL0.0IM pH7.6PBS中，混勻，取75yL加入加樣孔，計時 3min后檢測。儀器可以檢測到產(chǎn)生變化的最小OD值對應濃度為20ng/mL，因此中性粒細胞明 膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白的最低檢出限為20ng/mL。取糖化血紅蛋為16%的患者全血樣本，分 別稀釋至〇 %、1.5 %、3 %、6 %、12 %、16 %的一系列標準濃度，每個標準濃度取50μ 1，加入 200yL0.0 lM pH7.6PBS中，混勻，取75yL加入加樣孔，計時3min后檢測。儀器可以檢測到產(chǎn)生 變化的最小OD值對應濃度為3%，因此糖化血紅蛋白的最低檢出限為3%。
[0054] 2試紙條的重復性測試
[0055]配制濃度為0即/1111^(0%)、50]^/1111^(6%)、10001^/1111^(16%)的如41^和池41(3混合標 準品溶液，括號里面為HbAlc的濃度。取同一批次的90條試紙條進行檢測，每個濃度用30條 試紙條進行測定，測試OD值，濃度為0ng/mL(0% )的CV值為7%、50ng/mL(6% )的CV值為8%、 1000ng/mL( 16% )的CV值為6.5%。根據(jù)檢測結(jié)果可知，該試紙條具有較好的重復性。
[0056] 3試紙條的穩(wěn)定性測試
[0057]將試紙條保存于裝有干燥劑的鋁箱袋中，置于37°C恒溫干燥箱中，密封保存。分 別在1、2、3、4周后進行測試。配制濃度為0ng/mL(0% )、50ng/mL(6% )、1000ng/mL( 16% )的 NGAL和HbAl c混合標準品溶液，括號里面為HbAl c的濃度，進行測試。在第4周，各濃度標準品 檢測OD值沒有降低。說明該試紙條可以穩(wěn)定存放兩年。
[0058] 標準曲線的繪制 [0059] I. NGAl標準曲線繪制
[0060] 取0 · 5mg/mL的NGAl標準品用陰性全血分別稀釋成Ong/mL、20ng/mL、50ng/mL、 125ng/mL、312ng/mL、782ng/mL、1500ng/mL的一系列標準濃度。每個濃度重復測試3次，取平 均值，以濃度為X，以O(shè)D值為Y繪制標準工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計擬合標準工作曲線的表達式列出方 程為 Υ = 3·28638/[ 1 + (Χ/457· 86033)-2·32345]+0· 11853，擬合系數(shù) R2 = 0.99618.結(jié)果見附圖 3，圖3為線性檢測標準工作曲線，NGAL測定范圍為20ng/mL~1500ng/mL.
[0061 ] 2 .HbAl c標準曲線繪制
[0062] 取HbAI c為16 %的患者抗凝全血標本，配制成HbAI c為1 · 5 %、3 %、6 %、8 %、16 %的 全血標本，每個濃度重復測試3次，記錄OD值，以濃度為X，測定OD值為Y繪制標準工作曲線， 經(jīng)擬合標準工作曲線的表達式列出方程為:Y = 2.81517/[1+(Χ/6.39003)-2·69146]-0.09493， 擬合系數(shù)R2 = 0.99342.結(jié)果見附圖4,圖4為線性檢測標準工作曲線。HbAlc測定范圍為3% ~16% 〇
[0063] 干擾試驗
[0064] -、將一新鮮抗凝全血標本分成6份，每份ImL，第1、2份加入葡萄糖分別為30mmol/ 1^、501111]1〇1凡的10(^1^高糖物質(zhì)，第3、4份加入總膽紅素分別為0.21111]1〇1凡、0.41]11]1〇1凡的血清 100yL，第5、6份加入甘油三酯分別為7mmol/L、10mmol/L的血清100μΙ，混勻后測定HbAlc和 NGAL 值。
[0065]二、采集患者全血標本，分別注入含EDTA、肝素、構(gòu)櫞酸鈉3種抗凝劑，混勻后測定 HbAl c 和 NGAL 值。
[0066] 三、結(jié)果表明，在葡萄糖為30mmol/L以下高糖標本，總膽紅素為0.2mmol/L以下的 黃疸標本以及甘油三酯為IOmmo 1/L以下的血脂標本對本方法測定HbAlc和NGAL無明顯干 擾。采用Η)ΤΑ、肝素抗凝劑對實驗結(jié)果也無明顯干擾。
[0067]本領(lǐng)域的科研人員從本實用新型公開內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認 為是本實用新型的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測NGAL和糖化血紅蛋白的檢測試紙，其特征在于：包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸 纖維素膜、吸水紙、檢測線a、檢測線b、質(zhì)控線和PVC底板，所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述硝 酸纖維素膜及所述吸水紙依次搭接在所述PVC底板上，所述檢測線a、檢測線b、所述質(zhì)控線 依次包被于硝酸纖維素膜，所述結(jié)合墊包被有NGAUHbAlc單克隆抗體一膠體金標記物層； 所述檢測線a包被有NGAL單抗，所述檢測線b包被有HbAlc單抗，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠 IgG0
【文檔編號】G01N33/558GK205539004SQ201620061930
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年1月21日
【發(fā)明人】雷均平, 田奇, 曾繁兵
【申請人】深圳市博卡生物技術(shù)有限公司