一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，通過使用抗血管新生藥物治療荷瘤小鼠，通過體內(nèi)多次治療及篩選而成抗藥性，最后分離培養(yǎng)獲得。本發(fā)明通過皮下接種荷瘤小鼠，通過多輪治療并篩選的方法獲得的耐受抗血管新生治療的小鼠肺癌細(xì)胞系更接近臨床，通過研究藥物耐受細(xì)胞系與原始細(xì)胞系表達(dá)基因的差異，可用于研究導(dǎo)致出現(xiàn)抗血管新生治療藥物耐受的關(guān)鍵基因，為篩選導(dǎo)致藥物耐受的靶點奠定了基礎(chǔ)，同時也為臨床用藥指導(dǎo)提供了依據(jù)。
【專利說明】一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于荷瘤小鼠藥物耐受模型領(lǐng)域，特別涉及一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病。據(jù)中國衛(wèi)生部發(fā)布的《2010年中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒》，中國惡性腫瘤在所有疾病死亡原因中居首位，其中，統(tǒng)計資料顯示死亡率排名前十位的惡性腫瘤中，肺癌居首位，為人民生活和社會發(fā)展帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。近年來，肺癌和其他腫瘤的治療和基礎(chǔ)研究取得了較大發(fā)展，其中抗血管新生藥物是一類新的藥物。
[0003]血管新生(Angiogenesis)是指體內(nèi)已存在的血管生長出新的血管的過程。在成人體內(nèi)，血管新生只見于少數(shù)病理(例如腫瘤)和生理過程中。美國哈佛大學(xué)Folkman教授在四十年前提出，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生，腫瘤通過新生血管得到氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)，腫瘤生長到一定體積后如果未建立血管便會停止生長，因此，可以通過抑制血管新生達(dá)至1J治療月中瘤的目的[Folkman J.Tumor angiogenesis: therapeutic implications.N EnglJ Med.1971，285:1182-6]、[Folkman J, Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoidand other disease.1995, Nature Medicine.1:27-30]。近幾年的臨床試驗證據(jù)證明了這一理論的正確性，抗血管新生(Ant1-angiogenesis)藥物是目前腫瘤新藥開發(fā)的熱點之一 [Kerbel RS.Tumor angiogenesis.N Engl J Med.2008，358:2039-49]、[Cao Y.Tumorangiogenesis and molecular targets for therapy.Front Biosc1.2009，14:3962-73]、[Heath VL, Bicknell R.Anticancer strategies involving the vasculature.Nat RevClin Oncol.2009，6:395-404]。
[0004]血管新生過程受多種刺激因子和抑制因子的調(diào)節(jié)[Hanahan D, FolkmanJ.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch duringtumorigenesis.Cell.1996, 86:353-64]?？寡苄律委煹幕驹碓谟谧钄嘌苄律碳ひ蜃踊蛘哂醚苄律种埔蜃幼柚鼓[瘤血管的形成和生長。目前已經(jīng)知道相當(dāng)數(shù)目的血管新生刺激因子,例如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)等，這些因子能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、分化和血管的形態(tài)發(fā)生。其中，VEGF是目前所知對血管新生最特異、最有效的生長因子[Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors.NatMed.2003，9:669-76]、[Ferrara N.Vascular endothelial growth factor as a targetfor anticancer therapy.0ncologist.2004，1:2-10]。在腫瘤組織內(nèi)的缺氧環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞分泌大量的VEGF，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和遷移，最終在腫瘤建立血管網(wǎng)絡(luò)。眾多動物實驗證明，抑制VEGF能阻止血管的新生，進(jìn)而抑制腫瘤的生長。正因為此，VEGF及其受體是目前抗血管新生藥物最重要的靶標(biāo)。至今，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了多個具有抗血管新生作用的抗腫瘤藥物，它們都直接或間接地作用于VEGF的信號傳遞。其中，VEGF-Trap(Aflibercept)和Avastin (Bevascizumab)直接阻斷VEGF,抑制腫瘤血管的新生，因此是嚴(yán)格意義上的抗血管新生藥物，其他幾個藥物除了抗血管新生外還抑制腫瘤細(xì)胞的分裂，
具有多重作用。
[0005]Avastin是一種人源化的抗VEGF的單克隆抗體，由美國著名生物技術(shù)公司Genentech生產(chǎn)。在大規(guī)模三期臨床試驗中，Avastin與化療聯(lián)合用藥可以顯著延長多種腫瘤病人的生存時間，包括直腸癌、肺癌、乳腺癌、腎癌等[Jenab-Wolcott J, GiantonioBJ.Bevacizumab: current indications and future development for managementof solid tumors.Expert Opin Biol Ther.2009，9 (4):507-17]、[Summers J,CohenMH, Keegan P, Pazdur R.FDA drug approval summary:bevacizumab plus interferon foradvanced renal cell carcinoma.0ncologist.2010，15 (I): 104-11]。美國生物技術(shù)公司Regeneron和Sanof1-Aventis合作的VEGF-Trap在結(jié)腸癌、肺癌等癌癥的治療中具有顯著的療效，已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用?？寡苄律幬镌谂R床上的成功具有重要意義，它證明以腫瘤血管系統(tǒng)為靶標(biāo)的抗血管新生治療是在臨床上有效的治療手段，為多種腫瘤的治療開辟了一個全新的途徑。
[0006]雖然以Avastin為代表的抗血管新生藥物在腫瘤治療上取得了很大的成功，但是，大量臨床試驗也發(fā)現(xiàn)了這一藥物的局限。從臨床效果看，Avastin延長病人的半數(shù)生存時間約 3 ~4 個月[Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny ff, Cartwright T, HainsworthJ, Heim ff, Berlin J,Baron A, Griffing S, Holmgren E, Ferrara N, Fyfe G, Rogers B, RossR, Kabbinavar F.Bevacizumab plus irinotecan,fluorouracil, and leucovorin formetastatic colorectal cancer.N Engl J Med.2004, 350(23):2335-42]> [SandlerA,Gray R, Perry MC, Brahmer J, Schiller JH,Dowlati A, Lilenbaum R,JohnsonDH.Paclitaxel-carbop latin alone or with bevacizumab for non-small-cell lungcancer.N Engl J Med.2006，355 (24): 2542-50]，因此，Avastin 并不能長期有效地抑制腫瘤血管的生長。其中一個重要的原因可能是腫瘤細(xì)胞能在治療過程中獲得逃逸抗血管新生治療的能力，即對抗VEGF治療出現(xiàn)抗性。腫瘤如何獲得對抗血管治療的抗性是一個非常復(fù)雜的問題[Si Z., Liu J.What“helps，，tumors evade vascular targeting treatment?ChinMed J, 2008，121(9):844-849.Mol Ther.2007，15(6):1153-9]。對于大多數(shù)腫瘤來說，VEGF是腫瘤血管建立和生長的關(guān)鍵因子，但是由于腫瘤細(xì)胞非均質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，在抗VEGF的治療過程中其他刺激血管新生的基因可能會得到表達(dá)，從而使腫瘤血管的生長不再依賴于VEGF信號途徑。
[0007]了解腫瘤逃逸抗血管新生治療的分子機理對于研究新一代抗血管新生和抗腫瘤藥物，或者科學(xué)合理地設(shè)計抗腫瘤藥物的聯(lián)合用藥具有重要意義。但是，缺乏理想的動物模型是制約系統(tǒng)研究抗血管新生藥物耐受現(xiàn)象的重要原因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，該細(xì)胞系更接近臨床，通過研究藥物耐受細(xì)胞系與原始細(xì)胞系表達(dá)基因的差異，可用于研究導(dǎo)致出現(xiàn)抗血管新生治療藥物耐受的關(guān)鍵基因，為篩選導(dǎo)致藥物耐受的靶點奠定了基礎(chǔ)，同時也為臨床用藥指導(dǎo)提供了依據(jù)。
[0009]本發(fā)明的一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系通過使用抗血管新生藥物治療荷瘤小鼠，通過體內(nèi)多次治療及篩選而成抗藥性，最后分離培養(yǎng)獲得。
[0010]所述抗血管新生藥物為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抑制劑。
[0011]所述血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抑制劑為VEGF-Trap。
[0012]所述腫瘤細(xì)胞系為小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系。
[0013]所述小鼠為C57BL/6J、裸鼠或SCID鼠。
[0014]本發(fā)明的一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系的建立方法，包括:[0015](I)構(gòu)建抗血管新生藥物VEGF-Trap，詳細(xì)方法可以參見Holash等的文獻(xiàn)(Holash, J., et al., VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects.ProcNatl Acad Sci U S A, 2002.99 (17):p.11393-8)。簡述如下:將編碼 VEGF 受體(VEGFR)-1的第二個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、VEGFR2的第三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白(IgG) -1的Fe片段的基因相融合，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0)，經(jīng)過細(xì)胞篩選等步驟獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，使用Protein A等方法純化目的蛋白VEGF-Trap。
[0016](2)在使用VEGF-Trap治療前，首先使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測VEGF-Trap 結(jié)合 VEGF165 的活性。首先將 20ng/mL VEGF165CR & D 公司)包被于 96 孔 ELISA板上，每孔ΙΟΟμ L，4°C過夜，使用PBST (于IL PBS中加入ImL Tween-20)洗滌液洗滌五次后，每孔加入200 μ L鮮配制的1%BSA (KPL公司)室溫封閉I小時，然后加入梯度稀釋的每孔100 μ L VEGF-Trap，37°C孵育2小時，使用PBST洗滌液洗滌五次后，每孔加入100 μ L HRP標(biāo)記的羊抗人IgG Fe抗體(Bethyl公司)，37°C孵育I小時后，使用PBST洗滌五次后，每孔加入100 μ L顯色液(KPL公司)，避光反應(yīng)10-15分鐘至顏色出現(xiàn)，加入100 μ L終止液(KPL公司)終止反應(yīng),然后于酶標(biāo)儀上讀取450nm吸光度值。
[0017](3)耐受抗VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞系的篩選的步驟:
[0018]I)復(fù)蘇原始Lewis小鼠肺癌細(xì)胞株(購自中科院細(xì)胞庫)，于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)中培養(yǎng)，及時換液和傳代，保證細(xì)胞以良好的狀態(tài)生長，用于接種小鼠。
[0019]2)用0.25%胰酶(GIBC0公司)消化分裂旺盛的貼壁細(xì)胞，1000r/min離心5min收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，重懸于無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，臺盼藍(lán)(Sigma公司)染色后用血球計數(shù)板觀察計數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于95%備用。
[0020]3)使用70%酒精棉球局部消毒接種部位，用一次性ImL無菌注射器吸取細(xì)胞懸液，每只小鼠于右側(cè)后肢外側(cè)皮下接種0.2mL (I X IO6)細(xì)胞懸液，繼續(xù)飼養(yǎng)。
[0021]4)接種后用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長軸(a)和短軸(b)，按公式:腫瘤體積(立方毫米)=0.5 X ab2，計算腫瘤體積，待腫瘤體積長到約100立方毫米時，隨機分組，每組10只小鼠并開始治療。
[0022]5)每周兩次腹腔注射10mg/kg VEGF-Trap或PBS，同時測量小鼠的體重和腫瘤大小。
[0023]6)待生長最快的腫瘤達(dá)到1500立方毫米時，無菌剝離腫瘤，消化成單細(xì)胞懸液，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，為第一輪耐受抗VEGF-Trap治療的lewis小鼠肺癌細(xì)胞，液氮凍存保種。
[0024]7)將第一輪耐受抗VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞按同樣的方法接種到小鼠皮下后進(jìn)行治療，同樣剝離生長速度最快的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)后凍存保種，從而得到第二輪耐受抗VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞。
[0025]8)以此方法反復(fù)在小鼠體內(nèi)篩選，Lewis小鼠肺癌細(xì)胞在VEGF-Trap治療的小鼠中生長的速度越來越快，相應(yīng)的半數(shù)生存時間也越來越短。最后，按前述方法將第五輪逃逸抗VEGF-Trap治療的腫瘤細(xì)胞分離，培養(yǎng)擴增，液氮凍存，即建成耐受抗血管新生治療的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞。
[0026]本發(fā)明的一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系的應(yīng)用，所述細(xì)胞系進(jìn)行測序分析，根據(jù)測序結(jié)果分析驗證出腫瘤藥物耐受的靶點，用于研究差異表達(dá)基因。
[0027]本發(fā)明的一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系的應(yīng)用，所述細(xì)胞系建立小鼠荷瘤模型，用于觀察抗血管新生和研究抗腫瘤藥物的治療效果，為臨床用藥提供指導(dǎo)依據(jù)。
[0028]有益.效果
[0029]本發(fā)明通過皮下接種荷瘤小鼠，通過多輪治療并篩選的方法獲得的耐受抗血管新生治療的小鼠肺癌細(xì)胞系更接近臨床，通過研究藥物耐受細(xì)胞系與原始細(xì)胞系表達(dá)基因的差異，可用于研究導(dǎo)致出現(xiàn)抗血管新生治療藥物耐受的關(guān)鍵基因，為篩選導(dǎo)致藥物耐受的靶點奠定了基礎(chǔ)，同時也為臨床用藥指導(dǎo)提供了依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為VEGF-Trap蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031]圖2 為 ELISA 法檢`測 VEGF-Trap 梯度結(jié)合 VEGF165 ；
[0032]圖3為建立耐受抗VEGF-Trap小鼠肺癌模型示意圖；
[0033]圖4為第一輪治療荷瘤小鼠半數(shù)生存時間曲線；
[0034]圖5為第五輪治療荷瘤小鼠半數(shù)生存時間曲線。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0036]實施例1
[0037]VEGF-Trap重組蛋白質(zhì)的制備.[0038]構(gòu)建抗血管新生藥物VEGF-Trap的詳細(xì)方法參照Holash, J.，et al., Proc NatlAcad Sci U S A，2002。將編碼VEGF受體(VEGFR)-1的第二個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、VEGFR2的第三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白(IgG)-l的Fe片段的基因相融合，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0)，經(jīng)過篩選、加壓擴增等步驟獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，使用Protein A等方法純化目的蛋白VEGF-Trap (見圖1)。
[0039]VEGFR-1的第二個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列見SEQ ID NOl0
[0040]VEGFR-2的第三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列見SEQ ID N02。[0041]人IgGlFc片段的氨基酸序列見SEQ ID N03。
[0042]實施例2
[0043]VEGF Trap的生物學(xué)活性確定。
[0044]在使用VEGF-Trap治療前，首先使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測VEGF-Trap結(jié)合VEGF165的結(jié)合能力。首先將20ng/mL VEGF165 (R & D公司)包被于96孔ELISA板上，每孔ΙΟΟμ L，4°C過夜，使用PBST(于IL PBS中加入ImL Tween-20)洗滌液洗滌五次后，每孔加入200 μ L鮮配制的1%BSA (KPL公司)室溫封閉I小時，然后加入起點為16000pM，3倍比梯度稀釋的VEGF-Trap于96孔板中，每孔100 μ L，37°C孵育2小時，使用PBST洗滌液洗滌五次后，每孔加入100 μ L HRP標(biāo)記的羊抗人IgG Fe抗體(Bethyl公司)，37°C孵育I小時后，使用PBST洗滌五次后，每孔加入100 μ L顯色液(KPL公司)，避光反應(yīng)10-15分鐘至顏色出現(xiàn)，加入ΙΟΟμ L終止液(KPL公司)終止反應(yīng)，然后于酶標(biāo)儀上讀取450nm吸光度值。結(jié)果顯示:本發(fā)明所用的VEGF-Trap具有結(jié)合VEGF的能力(見圖2)。
[0045]實施例3
[0046]Lewis小鼠肺癌細(xì)胞系的抗血管新生治療。
[0047]耐受抗VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞系的第一輪篩選的步驟:
[0048]I)復(fù)蘇凍存于液氮中的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞株，于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)中培養(yǎng)，每2~3天換液，保證細(xì)胞以良好的狀態(tài)生長，細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底面積80%左右時,開始傳代擴大培養(yǎng)。
[0049]2)處于對數(shù)生長期的細(xì)胞擴大到足量時，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入0.25%胰蛋白酶(GIBC0公司)消化細(xì)胞，1000r/min離心5min收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，重懸于無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，取10 μ L細(xì)胞懸液與苔盼藍(lán)染色液(Sigma公司)混合后室溫靜置5min，加入血球計數(shù)板中觀察并計數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于95%可用于小鼠接種。
[0050]3)雌性C57BL/6J小鼠，生長至6~8周齡時用于接種。使用70%酒精棉球局部消毒小鼠擬接種部位，用一次性ImL無菌注射器吸取細(xì)胞懸液，接種于小鼠右側(cè)后肢外側(cè)的皮下，每只小鼠接種0.2mL (IX IO6)細(xì)胞懸液,接種后放回飼養(yǎng)籠繼續(xù)飼養(yǎng)。
[0051]4)接種后每日用游標(biāo)卡尺測量小鼠的腫瘤長度(L)和寬度(W)，按公式:腫瘤體積(立方毫米)=LX WX W/2，計算腫瘤體積，待腫瘤體積長到100~200立方毫米時，隨機分成兩組進(jìn)行治療，每組5~10只荷瘤小鼠，每周兩次腹腔注射10mg/kg VEGF-Trap或PBS，同時測量小鼠的體重和腫瘤大小。
[0052]5)待治療組和對照組生長最快的腫瘤分別達(dá)到1500立方毫米時，經(jīng)CO2窒息法處死荷瘤小鼠，70%酒精棉球全身消毒小鼠，特別是腫瘤接種部位，使用眼科剪剪開小鼠皮膚，無菌剝離腫瘤組織用PBS洗滌兩次，置于預(yù)冷的PBS中，準(zhǔn)備分離腫瘤細(xì)胞。
[0053]6)用無菌手術(shù)刀切開腫瘤組織，去除腫瘤胞膜和內(nèi)部壞死組織，使用眼科剪將剩余組織剪碎，加入胰蛋白酶37°C消化30min，吸取胰酶細(xì)胞混合液，使用完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶反應(yīng)，1000r/min離心5min，用PBS洗滌兩次后過300目細(xì)胞濾網(wǎng)，收集單細(xì)胞懸液，分成2份，一份1000r/min離心5min后加入含10%DMS0的DMEM完全培養(yǎng)基，放入細(xì)胞凍存盒，置于-80°C冰箱中梯度降溫，次日置于液氮中長期保存；另一份加入DMEM完全培養(yǎng)基，于37°C、5%C02、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時更換新鮮培養(yǎng)基并擴大培養(yǎng)。以此方法所獲得的細(xì)胞分別為第一代逃逸VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞和第一代對照未治療VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞。
[0054]實施例4
[0055]抗血管新生治療的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞系的體內(nèi)選擇。
[0056]耐受抗VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞系通過反復(fù)體內(nèi)篩選獲得:
[0057]I)將第一代逃逸抗VEGF-Trap治療的Lewi s小鼠肺癌細(xì)胞和對照未治療VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞按同樣的方法分別接種到小鼠右側(cè)后肢外側(cè)的皮下，待成瘤后，第一代逃逸VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠按10mg/kg VEGF-Trap進(jìn)行治療；同時，為了排除腫瘤在小鼠體內(nèi)多次傳代可能會出現(xiàn)與起始腫瘤細(xì)胞不同性狀的問題，第一代對照未治療VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠繼續(xù)注射PBS。
[0058]2)待治療組和對照組生長最快的腫瘤分別達(dá)到1500立方毫米時，使用上述同樣方法分別剝離生長速度最快的細(xì)胞，并獲得第二代逃逸VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞和第二代對照未治療VEGF-Trap的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞。部分細(xì)胞中加入DMEM完全培養(yǎng)基后于37°C、5%C02、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用于下一輪接種和細(xì)胞的篩選。
[0059]3)以此方法反復(fù)在小鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行逃逸腫瘤細(xì)胞的篩選，經(jīng)過多輪接種與篩選后，持續(xù)使用VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出逃逸抗VEGF治療或者說對VEGF-Trap藥物耐受的性狀，即使在使用VEGF-Trap治療的條件下，細(xì)胞的生長速度越來越快，相應(yīng)的半數(shù)生存時間也越來越短，經(jīng)過五輪篩選，持續(xù)使用VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠的半數(shù)死亡時間接近于持續(xù)傳代而未用VEGF-Trap治療的Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠的半數(shù)死亡時間。第一輪荷瘤小鼠使用VEGF-Trap治療的半數(shù)生存時間為54天，對照組治療的半數(shù)生存時間為38天，統(tǒng)計學(xué)統(tǒng)計結(jié)果顯示具有顯著差異(見圖4)，即表明抗血管新生藥物VEGF-Trap對起始Lewis小鼠肺癌細(xì)胞的生長具有顯著抑制效果。而經(jīng)過五輪篩選之后，荷瘤小鼠使用VEGF-Trap治療的半數(shù)生存時間為36天，接近于對照組治療的半數(shù)生存時間(32天)，使用統(tǒng)`計學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示兩者無顯著差異，表明經(jīng)過五輪篩選，小鼠Lewis肺癌細(xì)胞產(chǎn)生了對抗血管新生藥物VEGF-Trap的耐受(見圖5)。
[0060]實施例5
[0061]耐受抗血管新生治療的小鼠肺癌細(xì)胞系的保存
[0062]經(jīng)過五輪VEGF-Trap治療的小鼠肺癌細(xì)胞系獲得了對VEGF抑制劑VEGF-Trap治療的抗藥性。為了建立細(xì)胞庫，首先將具有耐受抗血管新生治療的腫瘤從小鼠剝離，用眼科剪碎腫瘤組織剪，加入胰蛋白酶37°C消化，1000r/min離心5min收集細(xì)胞，用PBS洗滌兩次后過300目細(xì)胞濾網(wǎng)，將收集的單細(xì)胞懸液用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37°C 5%C02條件下培養(yǎng)，通過適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)傳代以擴大細(xì)胞數(shù)量。但細(xì)胞生長到指數(shù)生長期時，將腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消化，細(xì)胞懸浮于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，1000r/min離心收獲細(xì)胞。最后，將細(xì)胞懸浮于含10%DMS0的DMEM完全培養(yǎng)液中，將細(xì)胞凍存于液氮中，此為建成的逃逸抗血管新生治療的Lewis小鼠肺癌肺癌細(xì)胞的原始細(xì)胞庫。
【權(quán)利要求】
1.一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系，其特征在于:所述細(xì)胞系通過使用抗血管新生藥物治療荷瘤小鼠，通過體內(nèi)多次治療及篩選而成抗藥性，最后分離培養(yǎng)獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系，其特征在于:所述抗血管新生藥物為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抑制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系，其特征在于:所述血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抑制劑為VEGF-Trap。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系，其特征在于:所述腫瘤細(xì)胞系為小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系，其特征在于:所述小鼠為C57BL/6J、裸鼠或SCID鼠。
6.一種耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系的建立方法，包括: Cl)構(gòu)建抗血管新生藥物VEGF-Trap ； (2)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測VEGF-Trap結(jié)合VEGF165的活性； (3)使用VEGF-Trap通過體內(nèi)多次治療及篩選，得到腫瘤細(xì)胞系。
7.—種如權(quán)利要求1所述的耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)胞系進(jìn)行測序分析，根據(jù)測序結(jié)果分析驗證出腫瘤藥物耐受的靶點，用于研究差異表達(dá)基因。
8.—種如權(quán)利要求1所述的耐受抗血管新生治療的腫瘤細(xì)胞系的應(yīng)用，其特征在于:所述細(xì)胞系建立小鼠荷瘤模型，用于觀察抗血管新生和研究抗腫瘤藥物的治療效果，為臨床用藥提供指導(dǎo)依據(jù)。```
【文檔編號】C12N5/09GK103695370SQ201310425831
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】房健民, 李棟 申請人:同濟(jì)大學(xué)