一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用，其基因工程菌的構(gòu)建方法主要將35S強(qiáng)啟動(dòng)子和油桐油酸脫氫酶基因vfFAD2構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入粘紅酵母，使vfFAD2基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達(dá)。本發(fā)明提高粘紅酵母油脂中亞油酸的含量。
【專利說明】一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres.) Harrison)是一種重要的工業(yè)菌株，可以生產(chǎn)微生物油脂和其他活性物質(zhì)，包括類胡蘿卜素、L-苯丙氨酸、過氧化物歧化酶，近年來日益受到營養(yǎng)學(xué)家和藥理學(xué)家的重視。
[0003]目前對(duì)于產(chǎn)油粘紅酵母基因工程改良的報(bào)道不多，特別是以提高亞油酸含量為目的的基因工程改良還未有報(bào)道，而亞油酸是人體的必需氨基酸，因此提高粘紅酵母油脂中亞油酸的含量有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種粘紅酵母野生菌株的構(gòu)建方法，以提高粘紅酵母油脂中亞油酸的含量。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種粘紅酵母生產(chǎn)高亞油酸的基因工程菌的構(gòu)建方法，利用35S強(qiáng)啟動(dòng)子和油桐vfFAD2基因構(gòu)建重組表達(dá)載體導(dǎo)入粘紅酵母，使vfFAD2在粘紅酵母種獲得高校表達(dá)，其基因工程菌構(gòu)建的具體步驟如下:
(1)采用同源序列克隆方法，以油桐基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠回收試劑盒回收純化，進(jìn)行TA克隆，并測(cè)序，獲得目的基因 vfFAD2 ；`
(2)目的基因vfFAD2與表達(dá)載體pBI121重組，獲得重組載體pBI121_vfFAD2，酶切、測(cè)序驗(yàn)證重組載體；
(3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，重組載體pBI121-vfFAD2轉(zhuǎn)化粘紅酵母，將微孔濾膜轉(zhuǎn)移到含60 μ g*mL-l鏈霉素，200 μ g*mL_l頭孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-5 d后，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300 yg*mL-l頭孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上劃線，培養(yǎng)3-5 d后，能正常生長(zhǎng)的初步認(rèn)定為陽性轉(zhuǎn)化子；
(4)提取基因組DNA、PCR驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子；
(5)氣相色譜法檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因粘紅酵母轉(zhuǎn)化子中亞油酸含量和粘紅酵母野生型相比，亞油酸相對(duì)含量則分別從6.65%提高到13.49%，提高了 102.86%。
[0006]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中擴(kuò)增引物為:
FAD2-Y:5’ -TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’ ；
FAD2-R:5， -GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3，
PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5 min ；94 °C變性30 S，58 °C退火40 S，72 °C延伸50S，35個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min ;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。[0007]進(jìn)一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種粘紅酵母轉(zhuǎn)化子的篩選方法，所述步驟(4)首先用60 μ g*mL-l鏈霉素，200 μ g*mL_l頭孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5 d后，再將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300μ g*mL-l頭孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上劃線篩選，最后提取基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種粘紅酵母的培養(yǎng)方法，其方法具體步驟如下: 將粘紅酵母保藏斜面轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL
液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，然后按1:10的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C振蕩發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心收集菌體；種子培養(yǎng)基:15 g.L—1 葡萄糖，I g.L—1 酵母粉，2 g·L-1 (NH4)2SO4, 7 g.L-1 KH2PO4,2 g-L^1Na2HPO4,1.5 g·L-1 MgSO4,PH 5.5;發(fā)酵培養(yǎng)基:50 g·L-1 葡萄糖，1 g.·L-1 酵母粉，2.5 g·L-1 (NH4)2SO4,7 g·L-1 KH2PO4, 2 ·L-1 Na2HPO4, 2 g*L-1 MgSO4,0.1 g.L-1CaCl2，0.07 g.L-1FeCl3，PH 5.5。
[0009]本發(fā)明的目的還在于提供了一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產(chǎn)微生物油脂方面的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的還在于提供了一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產(chǎn)功能性油脂方面的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的目的還在于提供了一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在食品方面的應(yīng)用。
[0012]說明書附圖
圖1.vfFAD2基因的獲得及pBI121-vfFAD2酶切、PCR驗(yàn)證；
圖 1-a.vfFAD2 的 RT-PCR 擴(kuò)增圖1:DNA Marker ；2, 3:vfFAD2 ；
圖 1-b.質(zhì)粒pBI121 的酶切電泳圖1:DNA Marker ；2:pBI121 未酶切；3:pBI121 的XbaI/Sac I雙酶切；
圖 1-c.重組質(zhì)粒 pBI121-vfFAD2 的 PCR 驗(yàn)證，I:DNA Marker ；2, 3:vfFAD2 ；
圖2.部分vfFAD2轉(zhuǎn)化子的抗生素篩選及PCR驗(yàn)證；
圖 2a:SM I 篩選；圖 2b:SM II 篩選；圖 2c:FAD2_F/R ；圖 2d:FAD2-RTF/RTR ；M:DNAmarker 2000 ;1_7:FAD2酵母轉(zhuǎn)化子；8:野生型酵母；
圖3.轉(zhuǎn)基因酵母中FAD2基因的表達(dá)分析；
圖4.轉(zhuǎn)FAD2酵母的脂肪酸組成分析。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1、油桐FAD2基因?qū)湍傅倪z傳轉(zhuǎn)化
(I)基因的獲得
根據(jù)NCBI上已提交的油桐vfFAD2序列(Genbank登錄號(hào):AF525534)，利用分子生物學(xué)分析軟件01igo6.0設(shè)計(jì)引物:
VF2a:5’ TATCTTCAGGTTGGGCAACGA 3’ ；
VF2b:5’ CGATTGAACGGCCTACATTAT 3’。
[0014]PCR擴(kuò)增vfFAD2基因反應(yīng)體系:
IOXEx buffer (Mg2+ free)2.5 μ LdNTP Mix2.0 μ L
25mM MgCl21.5 μ L
VF2al.0yL
VF2bl.0yL
Templet (油桐種仁總 cDNA) 1.0 μ L ddH2015.9 μ L
Ex Taq polymerase0.1 μ L
Total25 μ L
PCR反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性3 min，94°C變性45 s，60°C退火45 s，72°C延伸I min，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。1%瓊脂糖電泳結(jié)果如圖l_a。
[0015]目的片段回收及與pMD18_T simple vector連接:
將PCR擴(kuò)增得到的vfFAD2目的片段進(jìn)行凝膠回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T simplevector 連接:
PCR回收產(chǎn)物4 yL
pMD18_T simple vectorI μ L
Solution I5 μ L
Total10 μ L
16°C反應(yīng) I h0
[0016]4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌及陽性克隆的鑒定:
連接產(chǎn)物PMD-FAD2 5 μ L轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取藍(lán)白斑篩選出的白斑進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定呈陽性的克隆搖菌后，測(cè)序鑒定。
[0017](2)植物表達(dá)載體pBI121_vfFAD2的構(gòu)建
O設(shè)計(jì)引物:按照載體連接試劑盒的要求設(shè)計(jì)引物D15f-a/D15f-b，此引物不僅具有目的基因的序列和酶切位點(diǎn)，還要求與載體具有15個(gè)堿基同源。
[0018]D15f-a:5’ CACGGGGGACTCTAGATGGGTGCT 3’ {含Xba J 酶切位點(diǎn))；
D15f~b:5’ GATCGGGGAAATTCGTCAAAACTTCT 3’(含 fee J 酶切位點(diǎn))。
[0019](注:下劃線為載體的15個(gè)堿基，方框內(nèi)為內(nèi)切酶的堿基序列，剩下的為目的基因序列。)
2)PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的回收:
反應(yīng)體系: IOXEx buffer (Mg2+ free) 2.5 μ L dNTP Mix2.0 μ L
25mM MgCl21.5 μ L
D15f-al.0yL
D15f-bl.0yL
Templet (質(zhì)粒 pMD_FAD2) l.0yL ddH2015.9 μ L
Ex Taq polymerase0.1 μ L
Total25 μ L
PCR反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，52°C退火40 s，72°C延伸I min，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。瓊脂糖電泳后，凝膠回收目的基因片段。
[0020]3 )載體 pB1121 的油a I/Sac J 雙酶切:
IOXM buffer2 yL
ddH207 μ L
PMD-FAD210 μ L
Xba II yL
Total20 μ L
先37°C酶切2 h，65°C將/酶滅活0.5 h后，冷卻至室溫，加入內(nèi)切酶fee I I μ L，37°C酶切2 h以上。酶切后凝膠回收pBI121的大片段。
[0021](2)植物表達(dá)載體pBI121-FAD2的構(gòu)建:
按照試劑盒步驟進(jìn)行連接，具體操作如下:
①在潔凈的eppendorf管中加入以下成分:
FAD2基因回收產(chǎn)物1μL
PBI121的大片段回收產(chǎn)物6 μL
5XIn-Fusion Reaction Buffer 2 μ L In-Fusion EnzymeI μ L
Total10 μ L
②混勻后，PCR儀上 37°C 15 min, 50°C 15 min ；
③迅速置于冰上冷卻至室溫，加入IXTE(pH 8.0)使體系增至50 yL，混勻；
④取2.5 μ L上述產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；
⑤挑取白斑進(jìn)行PCR檢測(cè)及酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖l_b，C，對(duì)于檢測(cè)呈陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0022](3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)vfFAD2基因轉(zhuǎn)化酵母
本研究參照Piers等(1996)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行。首先挑取粘紅酵母單克隆接種于10 mL的YPD培養(yǎng)基，30 V，180 rpm振蕩培養(yǎng)18 h，然后按1: 10稀釋到Y(jié)PD新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，用無菌水沖洗兩次，用液體頂培養(yǎng)基重懸，稀釋酵母至0D660為0.7左右(細(xì)胞濃度約IXl(AmL-1);將含有質(zhì)粒pBI121_FAD2和pBI121的根癌農(nóng)桿菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線活化，培養(yǎng)基內(nèi)加入50 μ g.mL-1.卡那霉素和50 μ g.mL-1利福平，挑取農(nóng)桿菌單克隆接種于10 mL液體LB培養(yǎng)基中(加入50 μ g*mL_1卡那霉素,50 μ g*mL_1利福平)，28 °C, 180 rpm振蕩培養(yǎng)18 h，離心收集菌體，用10 mL液體頂培養(yǎng)基重懸(含50μ g*mL_1卡那霉素,50 μ g*mL_1利福平),繼續(xù)培養(yǎng)6 h。隨后離心收集菌體,用IM培養(yǎng)基稀釋農(nóng)桿菌0D600值0.5左右(細(xì)胞濃度約lXlOlOmr1)。各取50 μ L稀釋好的酵母與農(nóng)桿菌加入到10 mL液體頂培養(yǎng)基(含200 μ M的乙酰丁香酮)中，28 °C, 180 rpm振蕩培養(yǎng)過夜后，取150 μ L培養(yǎng)液涂布于鋪有微孔濾膜的IM固體培養(yǎng)基上(含200 μ M的乙酰丁香酮)，25 °C，倒置，黑暗培養(yǎng)48 h。
[0023]( 3 )轉(zhuǎn)化酵母初步篩選
將微孔濾膜轉(zhuǎn)移到含60 μ g.mL_1鏈霉素,200 μ g?mL_1頭孢霉素和100 μ g?mL_1卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-5 d后，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300 μ gir1頭孢霉素，150 Ugmr1卡那霉素的SM II平板上劃線，培養(yǎng)3-5 d后，能正常生長(zhǎng)的初步認(rèn)定為陽性轉(zhuǎn)化子。將SM I平板(圖2a)篩選到的出酵母與野生型酵母同時(shí)在加有抗生素的SM II平板(圖2b)上劃線，結(jié)果表明(圖2b)，野生型酵母菌株(8)在平板上不能正常生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)化酵母菌株(1-7)均能夠正常生長(zhǎng)，將這些轉(zhuǎn)化酵母初步認(rèn)定為陽性菌株。
[0024]實(shí)施例2轉(zhuǎn)vfFAD2基因粘紅酵母鑒定
酵母轉(zhuǎn)化子基因組DNA提取及PCR鑒定，按照北京艾德萊生物技術(shù)公司的酵母DNA提取試劑盒說明書提取酵母DNA。以野生型酵母為對(duì)照。根據(jù)油桐FAD2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物:
FAD2-F:5’ -TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’ ；
FAD2-R:5，-GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3，
PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5 min ；94 °C變性30 S，58 °C退火40 S，72 °C延伸50S，35個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0025]以野生型酵母做對(duì)照，利用FAD2-F/R以及FAD2-RTF/RTR兩對(duì)引物進(jìn)一步進(jìn)行PCR鑒定，其中FAD2-F/R所擴(kuò)得的片段長(zhǎng)度為584 bp，F(xiàn)AD2-RTF/RTR所擴(kuò)得的片段長(zhǎng)度為240bp。結(jié)果顯示，用FAD2-F/R引物擴(kuò)增有5個(gè)轉(zhuǎn)化酵母菌株在目的片段有條帶(圖2c)，而用FAD2-RTF/RTR引物擴(kuò)增時(shí)4個(gè)轉(zhuǎn)化酵母菌株在目的片段有條帶(圖2d)，野生型酵母均無條帶，因此將轉(zhuǎn)化子1，2，3，6視為成功轉(zhuǎn)入FAD2的轉(zhuǎn)基因酵母。
[0026]實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因酵母中vfFAD2的表達(dá)分析
為了探明油桐FAD2基因在轉(zhuǎn)基因酵母中的表達(dá)情況，我們提取了 3個(gè)轉(zhuǎn)基因酵母菌株的總RNA，經(jīng)過微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度后，用1%瓊脂糖電泳分析其完整性，獲得了完整的 RNA,根據(jù) SuperScript? III First-Strand Synthesis System 試劑盒的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以FAD2-RTF/RTR為實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，檢測(cè)酵母中油桐FAD2基因的表達(dá)水平，以酵母肌動(dòng)蛋白基因ACTl (AB248916)為內(nèi)參，設(shè)計(jì)其特異性引物:
RgACTl-RTF:5’ -ACTTTGAGCAGGAGATGCAG-3’
RgACTl-RTR:5’ -GACATGACAATGTTGCCGTA-3’
按照熒光定量試劑盒SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit指導(dǎo)說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR0利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因酵母中FAD2的表達(dá)，以轉(zhuǎn)pBI121的酵母為對(duì)照。圖3表明，F(xiàn)AD2基因在3個(gè)轉(zhuǎn)基因酵母菌株中均有表達(dá)，但是在不同菌株中表達(dá)水平有所差異，其中以FAD2-1表達(dá)水平最高，在FAD2-3中表達(dá)水平最低，轉(zhuǎn)pBI121空載體中FAD2基因無表達(dá)。
[0027]實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因酵母的脂肪酸成分分析
為了檢測(cè)油桐FAD2基因?qū)湍钢舅峥赡芫哂械恼{(diào)控作用，我們利用酸熱法提取了酵母的油脂。首先在YB)培養(yǎng)基上活化酵母菌株，培養(yǎng)3 d后，將轉(zhuǎn)基因酵母菌株與對(duì)照分別接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，30 °C, 180 rpm搖床培養(yǎng)24 h后，移種于500 mL發(fā)酵培養(yǎng)液中，30 °C, 180 rpm搖床培養(yǎng)72 h。將獲得的發(fā)酵液采用酸熱法進(jìn)行油脂的提取。具體步驟:`
1)離心收集菌體,菌體沉淀稱重,按大約每克菌加入6ml 4 mol*L-l鹽酸的比例重懸菌體，振蕩混勻；
2)將混合液室溫放置30min，沸水浴3 min，放入冰箱，-20 °C速冷30 min ；3)取出混合液，加入2倍體積的氯仿:甲醇(1:1)提取液，充分振蕩混勻；
4)5OOO rpm離心5 min,取氯仿層(下相)到新的離心管；
5)加等體積0.1%氯化鈉溶液,混勻,5 000 rpm離心5 min,取氯仿層(下相)；
6)將氯仿層放入旋轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去氯仿即得油脂。將裝有油脂的旋轉(zhuǎn)瓶放入真空烘箱 60 °C, 30 min。
[0028]7)對(duì)油脂進(jìn)行氣象色譜分析
各組分參考標(biāo)準(zhǔn)品出峰情況進(jìn)行定性，計(jì)算各脂肪酸的相對(duì)含量，并對(duì)亞油酸含量進(jìn)行T-test顯著性分析，P < 0.01,為極顯著，標(biāo)為；0.01 < P < 0.05為顯著，標(biāo)為；P > 0.05，為不顯著。采用氣相色譜法分析了酵母中五種主要的脂肪酸，包括棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:l)、亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)。經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因酵母菌株的脂肪酸絕對(duì)含量(每克油中的脂肪酸總量)沒有明顯的變化，而相對(duì)含量與對(duì)照相比均有所改變(圖4)，其中以油酸、亞油酸和亞麻酸變化幅度較大，3個(gè)轉(zhuǎn)FAD2酵母的油酸含量與對(duì)照相比，分別從72.4%下降為62.73%，67.89%和68.86%，亞油酸相對(duì)含量則分別從 6.65% 提高至Ij 13.49%, 12.1% 和 8.1%，即分別提高了 102.86%, 81.95% 和 21.80%,此外，轉(zhuǎn)基因酵母的亞麻酸含量分別從0.78%上升為2.28%，1.18%和1.24%，即分別提高了192.31%，51.28%和58.97%。本文對(duì)亞油酸含量的提高做了 T_test顯著性分析，表明亞油酸含量提高較顯著。綜合分析，油桐vfFAD2基因能夠提高粘紅酵母菌株亞油酸含量，使其從 6.65% 提高至Ij 13.49%ο`
【權(quán)利要求】
1.一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將35S強(qiáng)啟動(dòng)子和油桐油酸脫氫酶基因vfFAD2構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入粘紅酵母，使vfFAD2基因在粘紅酵母體內(nèi)獲得高效表達(dá)，其基因工程菌構(gòu)建的具體步驟如下: (1)粘紅酵母進(jìn)行活化和擴(kuò)培； (2)采用同源序列克隆法，以油桐基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠回收試劑盒回收純化，進(jìn)行TA克隆并測(cè)序，獲得目的基因vfFAD2 ； (3)目的基因vfFAD2與表達(dá)載體pBI121重組，獲得重組載體pBI121_vfFAD2，酶切、測(cè)序驗(yàn)證重組載體； (4)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，重組載體pBI121-vfFAD2轉(zhuǎn)化粘紅酵母，將微孔濾膜轉(zhuǎn)移到含60 μ g*mL-l鏈霉素，200 μ g*mL-l頭孢霉素和100 μ g*mL-l卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-5 d后，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300 yg*mL-l頭孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上劃線，培養(yǎng)3-5 d后，能正常生長(zhǎng)的初步認(rèn)定為陽性轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA，PCR驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子； (5)氣相色譜法檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因粘紅酵母轉(zhuǎn)化子中亞油酸含量和粘紅酵母野生型相比，亞油酸相對(duì)含量則分別從6.65%提高到13.49%，提高了 102.86%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)中擴(kuò)增引物為:
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4) 60 μ g*mL-l鏈霉素，200 μ g*mL_l頭孢霉素和100 μ g*mL_l卡那霉素的SM I篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5 d后，將初篩得到的轉(zhuǎn)化子與野生型粘紅酵母同時(shí)在含300μ g*mL-l頭孢霉素，150 μ g*mL-l卡那霉素的SM II平板上劃線篩選初步獲得陽性轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證進(jìn)一步鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。
4.一種粘紅酵母的培養(yǎng)方法，其特征在于，將粘紅酵母保藏斜面轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h之后，挑2環(huán)接入裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)24h，然后按1:10的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28°C振蕩發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)離心收集菌體； 種子培養(yǎng)基:15 g.!/1 葡萄糖，I g.!/1 酵母粉，2 g-L-1 (NH4)2SO4, 7 g-L-1 KH2PO4,2 g-L^1Na2HPO4,1.5 g-L-1 MgSO4, PH 5.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基:50 g.!/1 葡萄糖，I g.!/1 酵母粉，2.5 g*L—1 (NH4)2SO4, 7 g*L—1 KH2PO4, 2 g*L_1 Na2HPO4, 2 g*L—1 MgSO4,0.1 g*L—1CaCl2,0.07g^L^FeC^, PH 5.5。
5.一種如權(quán)利要求1所述的粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產(chǎn)微生物油脂方面的應(yīng)用。
6.一種如權(quán)利要求1所述的粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產(chǎn)功能性油脂方面的應(yīng)用。
7.一種如權(quán)利要求1所述的粘紅酵母高產(chǎn)亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在食品方面的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK103509725SQ201310418736
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】汪陽東, 陳益存 申請(qǐng)人:中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所