一種鑒別肝硬化腹水中感染細菌種類的方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種鑒別肝硬化腹水中感染細菌種類的方法，屬于病菌檢測【技術(shù)領域】。該方法包括：(1)對肝硬化病人的肝腹水樣本進行培養(yǎng)；(2)對步驟(1)中進行培養(yǎng)的樣本采用安瓿法，放入微熱量熱儀中，得到樣本中細菌生長代謝熱譜曲線；(3)將步驟(2)得到的熱譜曲線與相同條件下標準細菌的熱譜曲線進行對比，確定肝硬化腹水中細菌的種類。本發(fā)明的方法具有可信度高、靈敏度好，可以快速有效的鑒定肝硬化腹水細菌感染病原菌的優(yōu)點，同時相對于微生物自動化檢測系統(tǒng)，本方法還具有簡便實用、成本低的特點。
【專利說明】一種鑒別肝硬化腹水中感染細菌種類的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于病菌檢測【技術(shù)領域】，具體涉及一種鑒別肝硬化腹水中感染細菌種類的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝硬化腹水，是一種慢性肝病，俗稱肝腹水。正常人腹腔內(nèi)有少量(約50ml)起維持臟器間潤滑作用的游離腹水，當腹腔內(nèi)出現(xiàn)過多游離液體時，稱為腹水。而肝硬化肝功能減退引起門靜脈高壓，導致脾腫大，對蛋白質(zhì)和維生素的不吸收而滲漏出的蛋白液，形成了腹水癥。由于肝腹水患者的抵抗力低，特別是肝內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)嚴重受損、巨噬細胞吞噬功能以及白細胞粘附趨化與吞噬功能降低等原因有關，這時腸道內(nèi)細菌就會增多，易引起肝硬化腹水細菌感染和少數(shù)真菌感染，出現(xiàn)自發(fā)性細菌性腹膜炎(Spontaneous bacterialperitonitis, SBP)、呼吸道感染、尿路感染以及軟組織感染約占肝硬化合并感染等癥。
[0003]近年研究表明，肝硬化腹水患者約20%伴自發(fā)性細菌性腹膜炎。其原因主要包括腸道細菌的轉(zhuǎn)運、病原菌的接觸傳播以及血源污染。致病菌常為來源于腸道的需氧的革蘭陰性菌(49.5%)及非腸源性的鏈球菌。最常見的是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、枯草芽胞桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌等。目前，微生物自動化檢測系統(tǒng)，如API和VITEK系統(tǒng)，相對于常規(guī)鑒定方法具有準確、快速和鑒定病原體的特點，較廣泛地應用于臨床檢驗、疾病控制等領域。臨床上鑒定肝硬化腹水感染細菌種類主要通過制作血培養(yǎng)陽性標本，采用VITEK、API方法和藥敏法等方法進行檢測，均具有較好的靈敏度和準確度，但是微生物自動化檢測系統(tǒng)在檢測中過程復雜、成本較聞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于公開了一種鑒別肝硬化腹水中感染細菌種類的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0006]一種鑒別肝硬化腹水中感染細菌種類的方法，包括下述步驟:
[0007](I)、對肝硬化病人的肝腹水樣本進行培養(yǎng)；
[0008](2)、對步驟(I)中進行培養(yǎng)的樣本采用安瓿法，放入微熱量熱儀中，得到樣本中細菌生長代謝熱譜曲線(熱功率-時間曲線)；
[0009](3)、將步驟⑵得到的熱譜曲線與相同條件下標準細菌的熱譜曲線進行對比，確定肝硬化腹水中細菌的種類。
[0010]上述技術(shù)方案所述的方法，其中，步驟(I)中的樣本在接種量為IXio6Cells/ml條件下，在LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述LB培養(yǎng)基的組成為蛋白胨0.01g/ml、酵母膏0.005g/ml 和 NaCl0.005g/ml。
[0011]上述技術(shù)方案所述的方法，其中，步驟(2)中得到熱譜曲線的條件為37°C等溫條件下得到熱譜曲線。[0012]上述技術(shù)方案所述的方法，其中，步驟(3)中是通過對比兩個熱譜曲線之間的出峰數(shù)量N、峰寬W和各峰出峰時間t來確定肝硬化腹水中細菌的種類。
[0013]上述技術(shù)方案所述的方法，其中，在步驟(I)之前還包括獲得標準細菌熱譜曲線的過程，步驟為:在37°C恒溫條件下，采用安瓿法，將標準細菌以lX106cellS/ml的濃度接種到LB培養(yǎng)基中，放入微熱量熱儀中，得到標準細菌的生長代謝熱譜曲線。
[0014]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0015]本發(fā)明一種利用微量熱法鑒別肝硬化腹水感染細菌種類的方法是將檢測樣本中的細菌生長代謝熱譜曲線與標準細菌生長代謝熱譜曲線的出峰數(shù)量(N)、峰寬(W)、各峰的達峰時間t等指標進行對比，從而可以快速、準確地鑒定樣本中細菌種類；與VITEK等方法(直接法)檢測的結(jié)果相比，本發(fā)明方法的鑒定結(jié)果具有可信度高、靈敏度好，可以快速有效的鑒定肝硬化腹水細菌感染病原菌的優(yōu)點，同時相對于微生物自動化檢測系統(tǒng)，本方法還具有簡便實用、成本低的特點。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0016]1、圖1為大腸埃希菌在不同接種量下的熱譜曲線圖(37°C，安瓿法)；
[0017]2、圖2為大腸埃希菌在不同培養(yǎng)基下的熱譜曲線圖(37°C，安瓿法)；
[0018]3、圖3為大腸埃希菌標準菌株熱功率-時間曲線標準圖譜；
[0019]4、圖4為肺炎克雷伯囷標準囷株熱功率_時間曲線標準圖譜；
[0020]5、圖5為陰溝腸桿菌標準菌株熱功率-時間曲線標準圖譜；
[0021]6、圖6為銅綠假單胞菌標準菌株熱功率-時間曲線標準圖譜；
[0022]7、圖7為金黃色葡萄球菌標準菌株熱功率-時間曲線標準圖譜；
[0023]8、圖8為表皮葡萄球菌標準菌株熱功率-時間曲線標準圖譜；
[0024]9、圖9為屎腸球菌標準菌株熱功率-時間曲線標準圖譜；
[0025]10、圖10為血液鏈球菌標準菌株熱功率-時間曲線標準圖譜；
[0026]11、圖11為臨床樣本中大腸埃希菌熱功率-時間曲線圖譜；
[0027]12、圖12為臨床樣本中肺炎克雷伯菌熱功率-時間曲線圖譜；
[0028]13、圖13為臨床樣本中陰溝腸桿菌熱功率-時間曲線圖譜；
[0029]14、圖14為臨床樣本中銅綠假單胞菌熱功率-時間曲線圖譜；
[0030]15、圖15為臨床樣本中金黃色葡萄球菌熱功率-時間曲線圖譜；
[0031]16、圖16為臨床樣本中表皮葡萄球菌株熱功率-時間曲線圖譜；
[0032]17、圖17為臨床樣本中屎腸球菌標準菌株熱功率-時間曲線圖譜；
[0033]18、圖18為臨床樣本中血液鏈球菌熱功率-時間曲線圖譜。
【具體實施方式】:
[0034]為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗例對本發(fā)明一種鑒定肝硬化腹水中感染細菌種類的方法作進一步的說明。
[0035]以下試驗例中的病例選擇、儀器及材料如下:
[0036]一、肝硬化腹水細菌感染病例及入選、排除標準:
[0037]入選標準:(I)腹水病原菌培養(yǎng)陽性。(2)符合炎性滲出液特點，白細胞計數(shù)>0.5X IO9 / L，或多形核粒細胞計數(shù)>0.25Χ109 / L。(3)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、腹痛、腹瀉。(4)不同程度的腹膜刺激征。(5)腹水量迅速增加、利尿劑治療無效。(6)排除繼發(fā)性、結(jié)核性及癌性腹水者。
[0038]排除標準:(I)入院前2周內(nèi)應用過抗生素、微生態(tài)制劑者；(2)繼發(fā)性腹膜炎患者。
[0039]按上述入選標準和排除標準，選取2005年I月至2013年3月中國人民解放軍第302醫(yī)院治療的500例肝硬化合并SBP患者，男362例，女138例，年齡26-67歲。原發(fā)病情況:病毒性肝炎后肝硬化329例(乙型肝炎263例，丙型肝炎28例，乙丙型肝炎28例)，酒精性肝硬化151例，原發(fā)性膽汁性肝硬化6例，自身免疫性肝炎肝硬化5例，血吸蟲性肝硬化2例，不明原因7例。肝臟儲備功能情況=Child-Pugh B級101例，c級399例。
[0040]二、標準菌株:
[0041]大腸埃希菌標準菌株ATCC25922 ;肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC700603 ;陰溝腸桿菌標準菌株CMCC45301 ;銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853 ;金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC43300 ;表皮葡萄球菌標準菌株ATCC12228 ;屎腸球菌標準菌株ATCC35667 ;血液鏈球菌標準菌株BZW23112。
[0042]以上標準菌株均從南京便診生物科技有限公司購買。
[0043]三、試驗儀器及耗材:
[0044]TAM Air微量量熱儀(瑞典Thermometric公司);BACYEC9120全自動血培養(yǎng)儀(美國BD公司);VITEK-32自動微生物檢測系統(tǒng)和API鑒定條(法國生物梅里埃公司);API120cAUX自動微生物檢測系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司);YXQG02型高壓蒸汽滅菌器(山東安得醫(yī)療科技有限公司)；超凈工作臺(青島冰峰公司)；ATL-032搖床(上海堪鑫儀器設備有限公司)；微量加樣器(德國eppendorf公司)；加樣槍頭(德國eppendorf公司)；離心管、凍存管(德國Greiner公司)；血平板(北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司，20120108)；麥康凱瓊脂平板(上海泛柯實業(yè)有限公司，20120112)。
[0045]四、試驗試劑:
[0046]1、LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母膏5g，NaC15g，溶于1000ml蒸餾水中，調(diào)ρΗ=7.2后分裝，121.1°C高壓蒸汽滅菌30min，4°C冰箱中放置備用；蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司，20120412 ;酵母膏購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司，20120412 ；NaCl購自北京化工廠，20120114。
[0047]2、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨IOg,酵母膏3g, NaC15g,溶于1000ml蒸懼水中，調(diào)pH=7.2后分裝，121.1°C高壓蒸汽滅菌30min，4°C冰箱中放置備用。
[0048]3、葡萄糖肉湯培養(yǎng)液:蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化鈉5g，葡萄糖10g，加入蒸餾水至IOOOmL,攪拌加熱至全部溶解，調(diào)整pH為7.3 ±0.2，分裝，121 °C高壓滅菌15min，冷卻備用。
[0049]試駘例I:
[0050]一、肝硬化腹水細菌感染樣本病原菌分布鑒別試驗:
[0051]病原菌培養(yǎng)鑒定方法:無菌抽取500例肝硬腹水細菌感染患者的腹水各IOml注入血培養(yǎng)瓶增菌液，置于BACYEC9120全自動血培養(yǎng)儀中常規(guī)培養(yǎng)，陽性者即時報警。革蘭陽性菌及陰性菌的鑒定采用VITEK-32系統(tǒng)和API鑒定條，真菌的鑒定采用API120C AUX系統(tǒng)。以標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC43300、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853作室內(nèi)質(zhì)控菌株。以上檢測按照VITEK-32系統(tǒng)操作指南和API鑒定條使用說明進行鑒定，嚴格無菌操作。
[0052]I周內(nèi)2次腹水培養(yǎng)檢出相同病原菌記為一株。觀察SBP致病菌的分布情況。
[0053]試驗結(jié)果:500例肝硬化合并SBP患者腹水標本中141例培養(yǎng)陽性，共檢出148株病原菌，陽性率為28.2%，單一病原菌感染比例為95.3%。148株病原菌中，革蘭陰性菌115株，革蘭陽性菌29株，真菌4株，厭氧菌未分離得到，病原菌構(gòu)成比見表1。
[0054]表1500例肝硬化合并自發(fā)性細菌性腹膜炎患者腹水檢出病原菌構(gòu)成比
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別肝硬化腹水中感染細菌種類的方法，包括下述步驟: (1)、對肝硬化病人的肝腹水樣本進行培養(yǎng)； (2)、對步驟(I)中進行培養(yǎng)的樣本采用安瓿法，放入微熱量熱儀中，得到樣本中細菌生長代謝熱譜曲線； (3)、將步驟(2)得到的熱譜曲線與相同條件下標準細菌的熱譜曲線進行對比，確定肝硬化腹水中細菌的種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中的樣本在接種量為I X IO6ce 11 s/ml條件下，在LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述LB培養(yǎng)基的組成為蛋白胨0.0lg/ml、酵母膏 0.005g/ml 和 NaCl0.005g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中得到熱譜曲線的條件為37°C等溫條件下得到熱譜曲線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中是通過對比兩個熱譜曲線之間的出峰數(shù)量N、峰寬W和各峰出峰時間t來確定肝硬化腹水中細菌的種類。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(I)之前還包括獲得標準細菌熱譜曲線的過程，步驟為:在37°C恒溫條件下，采用安瓿法，將標準細菌以lX106cellS/ml的濃度接種到LB培養(yǎng)基中，放入微熱量熱儀中，得到標準細菌的生長代謝熱譜曲線。
【文檔編號】C12Q1/04GK103499600SQ201310418427
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】趙艷玲, 肖小河, 王伽伯, 鄢丹, 鄭全福 申請人:中國人民解放軍第三0二醫(yī)院