專利名稱：：細菌檢測和/或鑒定培養(yǎng)基的制作方法細菌檢測和/或鑒定培養(yǎng)基本發(fā)明領域為生化微生物分析，具體為細菌的檢測和鑒定。致病菌特別是革蘭氏陰性菌例如腸細菌每年引起許多疾病、流行病等。大腸桿菌(^"/^"c/^②W是消化道最主要的需氧菌。但是，該細菌在水中的存在提示糞便污染，某些菌株為致病菌，可引起腹腔化膿、膽道化膿、闌尾化膿或生殖器化膿。大腸桿菌的早期特異檢測可以在治療方面提出去污等的適宜解決方法。這種檢測可特別基于包含特定底物的檢測培養(yǎng)基的使用，其中特定底物特異針對檢測培養(yǎng)基需檢測的細菌的代謝活性，稱為靶代謝活性，例如酶活性根據(jù)是否存在反應，通過選擇底物有可能鑒定微生物的性質。CPSID3(bioMerieux)培養(yǎng)基聯(lián)合使用J3-葡糖醛酸糖苷酶底物和13-葡糖苷酶底物和任選地色氨酸酶檢測，用于檢測大腸桿菌的菌株。但是，盡管這種培養(yǎng)基具有出色的特異性，但由于存在少部分不表達這種活性的大腸桿菌菌株(5-10%)，使用13-葡糖醛酸糖苷酶底物檢測大腸桿菌仍表現(xiàn)出不完全的靈敏性。而且，某些檸檬酸桿菌屬菌株也可產生與大腸桿菌菌落顏色相同的B-葡糖醛酸糖苷酶陽性菌落。本發(fā)明通過提供一種特別適合鑒定大腸桿菌的新培養(yǎng)基，旨在解決現(xiàn)有技術難題。該鑒定快速廉價且易于實施。令人驚訝的是，發(fā)明人已表明特定組合的具有適宜濃度的酶底物能夠快速簡便地檢測大腸桿菌，特別是使用尿樣時。在公開本發(fā)明之前，給出下列定義以便于理解本發(fā)明。術語MMMIM是指包含微生物生存和/或生長必需的所有組分的培養(yǎng)基。這種檢測培養(yǎng)基或可只用作檢測培養(yǎng)基，或可用作培養(yǎng)基和檢測培養(yǎng)基。在第一種情況下，接種前進行微生物的培養(yǎng)，而在第二種情況下，檢測培養(yǎng)基也即是培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基可含有其他可能的添加劑，例如:蛋白胨或組織提取物、一種或多種生長因子、碳水化合物、一種或多種選擇劑、緩沖液、一種或多種膠凝劑等。該培養(yǎng)基可為液體形式或即用型凝膠形式，可用于試管、培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿接種。就本發(fā)明而言，檢測可在液體培養(yǎng)基、條帶或其它的固相載體上進行。術語M是指因微生物的酶活性或代謝活性可直接或間接產生可檢測信號的任何分子。底物可特別為偶聯(lián)于指示劑的代謝底物例如碳源或氮源，其中指示劑在其中一種代謝產物的存在下產生顏色。底物還可為酶底物，該底物可被酶水解，產生能夠直接或間接檢測微生物的產物。該底物可特別包含特異針對待揭示的酶活性的第一部分和作為標記的第二部分(以下稱為標記部分)。該標記部分可顯色、產生熒光、發(fā)光等。作為適用于固相載體(濾膜、瓊脂、電泳凝膠)的顯色底物，特別指基于吲哚酚及其衍生物的底物，以及基于羥基喹啉或七葉亭和它們的衍生物的底物，這些底物可檢測糖苷酶(osidase)和酯酶活性。底物還可指基于硝基酚和硝基苯胺及衍生物的底物，基于硝基酚的底物用于檢測糖苷酶和酯酶活性，基于硝基苯胺的底物用于檢測肽酶活性。最后，底物還可指基于萘酚和萘胺和它們衍生物的底物，可通過萘酚檢測糖苷酶和酯酶活性，可通過萘胺檢測肽酶活性。該底物可特別(但不限制)檢測酶活性例如糖苷酶、肽酶、酯酶等活性。酶底物還可為天然底物，其水解產物可被直接或間接檢測。天然底物可特別指檢測色氨酸酶或脫氨酶活性的色氨酸，檢測脫氨酶活性的環(huán)狀氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、酪氨酸)，檢測磷酯酶活性的磷脂酰肌醇等。根據(jù)本發(fā)明，底物優(yōu)選地選自基于吲哚酚(3-吲哚酚，5-溴-3』引哚酚，5_碘_3』引噪酷，4-氯-3』引哚酚，5-溴-4-氯-3』引哚酚，5-溴-6-氯-3』引噪酚，6畫溴-3-卩引哚酚，6-氯-3』引哚酚，6-氟-3-卩引哚酚，5-溴-4-氯-N-甲基-3』引哚酚，N—甲基—3』引哚酚等)；傘形酮(4-甲基傘形酮，環(huán)己酮七葉亭等)；茜素；對萘酚苯甲醇；硝基酚(鄰硝基酚，對硝基酚等)；羥基喹啉；兒茶酚(cathecol，二羥黃酮，羥黃酮等)；試鹵靈；氯酚紅；熒光素；氨基酚(對氨基酚，二氯氨基酚等)；萘酚(a-萘酚，2-萘酚，萘酚-ASBI等)；氨基香豆素(7-氨基-4-甲基香豆素等)；萘酰胺；吖啶(氨基苯吖啶等)；或氨基吩噁嗪(氨基苯并吩噁嗪酮，氨基戊基試鹵靈)的底物。通過提示，用于檢測P-葡糖醛酸糖苷酶活性的底物可特別為4-甲基傘形酮-P-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3』引哚基-(3-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3』引哚基-卩-葡糖苷酸、6-氯-3-吲哚基-(3-葡糖苷酸、茜素-卩-葡糖苷酸或環(huán)己酮七葉苷-卩-葡糖苷酸或它們的鹽。用于檢測P-半乳糖苷酶活性的底物可特別為4-甲基傘形酮-P-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3』引哚基-(3-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-卩引哚基-|3-半乳糖苷、6-氯-3』引哚基+半乳糖苷、茜素屮-半乳糖苷或環(huán)己酮七葉苷+半乳糖苷或它們的鹽。用于檢測(3-葡糖苷酶活性的底物可特別為4-甲基傘形酮-|3-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-卩引哚基-P-葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-|3-葡糖苷、6-氯-3』引哚基-卩-葡糖苷、茜素-卩-葡糖苷或環(huán)己酮七葉苷-卩-葡糖苷、硝基酚-卩-葡糖苷或二氯氨基苯葡糖苷或它們的鹽。術語M^H是指誘導靶代謝活性增加的化合物；在其他所有實驗條件相同時，誘導物處于適宜濃度時的代謝活性比誘導物不存在或處于非適宜濃度時要高。不作限制地，100ng/1-10g/1的濃度，優(yōu)選10mg/l-3g/1的濃度特別適合本發(fā)明。誘導物特別指*對于卩-葡糖醛酸糖苷酶，葡糖苷酸優(yōu)選地選自葡糖醛酸和甲基-卩-葡糖苷酸；*對于P-半乳糖苷酶，半乳糖苷優(yōu)選地選自乳糖和異丙基-P-硫代半乳糖苷；*對于(3-葡糖苷酶，碳水化合物的P-位連接葡萄糖的碳水化合物，或具有(3-葡糖苷亞單位的碳水化合物，特別是纖維二糖、纖維素、淀粉、纖維三糖或海藻糖。誘導物還可指甲基-B-葡糖苷、異丙基-13-硫代葡糖苷、吲哚基-B-葡糖苷或甲基-B-硫代葡糖苷。術語fflMM是指引起靶代謝活性降低的化合物；在其他所有實驗條件相同時，抑制劑處于適宜濃度時的代謝活性比抑制劑不存在或處于非適宜濃度時要低。不作限制地，100ng/1-30g/1之間的濃度，優(yōu)選1mg/l-3g/1的濃度特別適合本發(fā)明。抑制劑特別指.對于B-葡糖醛酸糖苷酶D-葡萄糖、D-葡糖二酸l,4-內酯*對于13-半乳糖苷酶2-脫氧半乳糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-葡萄糖。5術語^MI^是指源自生物體液樣品的臨床樣品，或源自任何類型食物的食物樣品，或環(huán)境樣品，例如表面樣品、水樣品、空氣樣品等。因此該樣品可為液體或固體，可指(非限制)來自血液、血漿、尿液或糞便的臨床樣品；取自鼻、喉、皮膚、傷口或腦脊液的樣品；來自水或來自飲料例如牛奶或果汁或來自酸奶、肉類、蛋、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚等的食物樣品，或源自動物飼料例如特別是源自動物肉類的樣品。在這方面，本發(fā)明涉及一種檢測和/或鑒定生物樣品(優(yōu)選為尿樣)中的大腸桿菌的方法，其包括-a)將可能含有大腸桿菌的樣品(優(yōu)選為尿樣)接種到檢測培養(yǎng)基上用于獲得細菌菌落，該檢測培養(yǎng)基包含第一底物，其選自卩-葡糖醛酸糖苷酶底物、P-半乳糖苷酶底物和a-半乳糖苷酶底物，以及用于乳糖酸化酶、P-核糖苷酶(P-ribosidase)、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物，以及不同于所述第一底物的第二底物，其選自P-葡糖醛酸糖苷酶底物、P-半乳糖苷酶底物和a-半乳糖苷酶底物，以及用于乳糖酸化酶、(3-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物；b)鑒定與第一底物和/或第二底物反應的菌落為大腸桿菌的菌落。優(yōu)選情況下，所述第一底物和第二底物處于適宜的濃度?？赏ㄟ^本領域技術人員知曉的任何接種技術進行微生物的接種。可在最適于需檢測的酶活性的溫度下進行接種步驟，其中本領域技術人員根據(jù)待檢測的酶活性可以容易地選擇所述溫度。可通過目視檢查、比色法或熒光法進行檢測/鑒定。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，所述第一底物的濃度是20-1000mg/1，所述第二底物的濃度是20mg/l-30g/1。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，所述第一底物是13-葡糖醛酸糖苷酶底物，第二底物是P-半乳糖苷酶底物。優(yōu)選情況下，用于P-葡糖醛酸糖苷酶活性的底物選自濃度優(yōu)選為20-1000mg/1的4-甲基傘形酮-(3-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3』引哚基-P-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3-吲哚基-p-葡糖苷酸、6-氯-3-卩引哚基-P-葡糖苷酸、茜素+葡糖苷酸或環(huán)己酮七葉苷-|3-葡糖苷酸或它們的鹽。優(yōu)選情況下，p-半乳糖苷酶底物的濃度低。優(yōu)選情況下，用于(3-半乳糖苷酶活性的底物選自濃度優(yōu)選為10-1000mg/l，優(yōu)選為20-500mg/1的4畫甲基傘形酮-|3-半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-(3-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3』引噪基-P-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-卩-半乳糖苷、茜素-卩-半乳糖苷或環(huán)己酮七葉苷-P-半乳糖苷或它們的鹽。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，檢測培養(yǎng)基還包含第三底物，優(yōu)選地選自P-葡糖苷酶、(3-乳糖苷酶、N-乙酰氨基己糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶、(3-木糖苷酶、磷脂酶、a-甘露糖苷酶、卩-甘露糖苷酶、P-纖維二糖苷酶、a-葡糖苷酶、色氨酸酶、脫氨酶、氧化酶、色素合成、肽酶(卩-丙氨酸氨肽酶，彈性蛋白酶等)的底物。優(yōu)選情況下，所述第三底物是卩-葡糖苷酶的底物。優(yōu)選情況下，用于卩-葡糖苷酶活性的底物選自濃度優(yōu)選為10-1000mg/1，優(yōu)選為20-500mg/1的4-甲基傘形酮-卩-葡糖苷、5-溴-4-氯-3』引哚基-P-葡糖苷、5-溴-6-氯-3』引哚基-P-葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-卩-葡糖苷、環(huán)己酮七葉苷-卩-葡糖苷、硝基苯-卩-葡糖苷或二氯氨基苯葡糖苷或它們的鹽。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，檢測培養(yǎng)基還包含誘導物。優(yōu)選情況下，誘導物的濃度為100ng/l-10g/l。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，誘導物優(yōu)選為，對于P-葡糖醛酸糖苷酶，葡糖苷酸優(yōu)選地選自葡糖醛酸和甲基-(3-葡糖苷酸；*對于卩-半乳糖苷酶，半乳糖苷優(yōu)選地選自乳糖和異丙基-卩-硫代半乳糖苷；*對于卩-葡糖苷酶，碳水化合物的卩-位連接葡萄糖的碳水化合物，或具有P-葡糖苷亞單位的碳水化合物，特別是纖維二糖、纖維素、淀粉、纖維三糖或海藻糖。誘導物還可指甲基-B-葡糖苷、異丙基-B-硫代葡糖苷、吲哚基-13-葡糖苷或甲基-B-硫代葡糖苷。優(yōu)選情況下，誘導物是纖維二糖，其濃度優(yōu)選為100ng/l-10g/l。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，檢測培養(yǎng)基還包含抑制劑。優(yōu)選情況下，抑制劑的濃度為100ng/l-30g/l。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，抑制劑優(yōu)選為對于fi-葡糖醛酸糖苷酶D-葡萄糖、D-葡糖二酸l,4-內酯對于B-半乳糖苷酶2-脫氧半乳糖、纖維二糖、D-半乳糖、D-葡萄糖。下文給出的實施例用于解釋，絕非用于限制。它們使得更清楚地理解本發(fā)明成為可能。實施例1:6-氯-3-吲哚基-!3-葡糖苷酸和5-溴-6-氯-3-吲哚基-B-半乳糖苷組合的評價向CPSID3培養(yǎng)基(bioM6rieux)加入各種濃度的6-氯-3』引哚基-|3-葡糖苷酸(0-0.1-0.15和0.20g/l)和5-溴-6-氯-3-卩引哚基-(3-半乳糖苷(0-0.025-0.05和0.1g/1)，加以混合，其中該培養(yǎng)基已除去13-葡糖醛酸糖苷酶的合成酶底物。這些培養(yǎng)基還包含50mg/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-葡糖苷。它們按每培養(yǎng)皿20ml的比例進行分配。平行測試用于檢測和計數(shù)食物樣品中大腸桿菌和大腸菌且同時含有B-葡糖醛酸糖苷酶底物(6-氯-3-吲哚基-B-葡糖苷酸)和13-半乳糖苷酶底物(5-溴-3-吲哚基-fi-半乳糖苷)的ColiID培養(yǎng)基(bioM6rieux)。通常從尿樣分離且源自申請人收藏菌株的微生物通過10^0.5McFarland的混懸液的半定量分離被接種到這些培養(yǎng)基上，稀釋至1/20。培養(yǎng)皿在37°C下溫育20小時，隨后目視檢査形成的菌落。記錄這些菌落的顏色。下表l給出了結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例2:纖維二糖對含有6-氯-3』引哚基-fi-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3』引哚基-fi-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-fi-葡糖苷組合的培養(yǎng)基的影響分別向胰胨豆胨瓊月旨培養(yǎng)基(TrypticaseSoyaAgarMedium,bioM6rieux)加入0.15g/l、0.08g/1和0.08g/1的6-氯-3-卩引哚基各葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3-吲哚基-B-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3』引哚基-fi-葡糖苷。該培養(yǎng)基添加或未添加0.5g/l的纖維二糖。這兩種培養(yǎng)基按每培養(yǎng)皿20ml的比例進行分配。通常從尿樣分離且源自申請人收藏菌株的微生物通過IO^tl0.5McFarland的混懸液的半定量分離被接種到這些培養(yǎng)基上，稀釋至1/20。培養(yǎng)皿在37。C下溫育24小時，隨后目視檢査形成的菌落。記錄這些菌落的顯色。下表2給出了結果。纖維二糖的濃度(mg/1)菌株0500大腸桿菌407粉紅粉紅大腸桿菌067粉紅粉紅肺炎克雷伯桿菌111青綠青綠粘質塞氏桿菌(Se/ra"a脂rcescms)112青綠青綠弗氏擰檬酸桿菌031灰灰弗氏檸檬酸桿菌009粉紅藍紫無乳鏈球菌(&reptococctwaga/ac"ae)019紫紅紫紅糞腸球菌117青綠青綠表2:纖維二糖對含6-氯-3』引哚基-B-葡糖苷酸、5-溴-6-氯-3』引哚基-B-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-H引哚基-B-葡糖苷的培養(yǎng)基在菌落顯色方面的影響上表2中，混合有6-氯-3-吲哚基各葡糖苷酸和5-溴-6-氯-3』引哚基各半乳糖苷的培養(yǎng)基中，纖維二糖可更清楚地將弗氏檸檬酸桿菌009菌株與大腸桿菌菌株區(qū)分開。這可以增加大腸桿菌檢測的靈敏性，而又不破壞檢測的特異性。實施例3確定本發(fā)明的所述第一底物和第二底物濃度的測試可進行下面的測試以確定本發(fā)明的所述第一底物和第二底物的濃度，濃度隨使用的底物而變化，更普遍地隨反應培養(yǎng)基的配方而變化。為了輔助理解該測試，在下文的13-葡糖醛酸糖苷酶和13-半乳糖苷酶組合的情況下，采用微生物菌株組合(kit)進行該測試，其中特別包含大腸桿菌菌株并包括不表達陽性活性或表達陽性活性較弱或較遲的菌株，以及任選地其他微生物。該測試可用于其它類型的底物。使用包含適宜濃度的J3-葡糖醛酸糖苷酶底物或非13-葡糖醛酸糖苷酶底物的兩種反應培養(yǎng)基，制備J3-半乳糖苷酶底物范圍，其中包括零濃度，得到與表達13-半乳糖苷酶的大腸桿菌菌株的陽性反應的至少一種濃度，以及中間濃度。等分每種培養(yǎng)基，使得每種微生物菌株可以純培養(yǎng)形式接種到每種培養(yǎng)基上。在優(yōu)選為20-50°C的適宜溫度下經過一段適宜的溫育時間(一般為30分鐘到72小時)后，檢査培養(yǎng)基，選擇包含fi-半乳糖苷酶和J3-葡糖醛酸糖苷酶底物組合的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可揭示最大數(shù)目的大腸桿菌菌株，同時可將它們同最大數(shù)目的其他微生物菌株區(qū)分開?？赡苡斜匾ㄟ^調節(jié)每種底物濃度和菌株組合來重復實驗。反應培養(yǎng)基還可優(yōu)選包含B-半乳糖苷酶和/或fi-葡糖醛酸糖苷酶的誘導物和/或抑制劑。權利要求1.一種檢測和/或鑒定尿樣中大腸桿菌(E.coli)的方法，其包括a)將可能含有大腸桿菌的尿樣接種到檢測培養(yǎng)基上用于獲得細菌菌落，該檢測培養(yǎng)基包含·第一底物，其選自β-葡糖醛酸糖苷酶底物、β-半乳糖苷酶底物和α-半乳糖苷酶底物以及用于乳糖酸化酶、β-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物，以及·不同于所述第一底物的第二底物，其選自β-葡糖醛酸糖苷酶底物、β-半乳糖苷酶底物和α-半乳糖苷酶底物以及用于乳糖酸化酶、β-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物；b)鑒定與第一底物和/或第二底物反應的菌落為大腸桿菌的菌落。2.如權利要求1所述的方法，根據(jù)該方法，所述第一底物是(3-葡糖醛酸糖苷酶底物，所述第二底物是卩-半乳糖苷酶底物。3.如權利要求2所述的方法，根據(jù)該方法，所述第一底物的濃度是20-1000mg/1，所述第二底物的濃度是10mg/1-30g/1。4.如權利要求1-3任一項所述的方法，根據(jù)該方法，所述檢測培養(yǎng)基還包含第三底物，其選自(3-葡糖苷酶、P-乳糖苷酶、N-乙酰氨基己糖苷酶、酯酶、硫酸酯酶、P-木糖苷酶、磷脂酶、a-甘露糖苷酶、卩-甘露糖苷酶、P-纖維二糖苷酶、a-葡糖苷酶、色氨酸酶、脫氨酶、氧化酶、色素合成、肽酶((3-丙氨酸氨肽酶、彈性蛋白酶等)的底物。5.如權利要求4所述的方法，根據(jù)該方法，所述第三底物是(3-葡糖苷酶底物。6.如權利要求1-5任一項所述的方法，根據(jù)該方法，所述檢測培養(yǎng)基還包含誘導物，優(yōu)選為纖維二糖。7.如權利要求1-6任一項所述的方法，根據(jù)該方法，所述檢測培養(yǎng)基還包含抑制劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測和/或鑒定尿樣中大腸桿菌的方法，其包括a)將可能含有大腸桿菌的尿樣接種到檢測培養(yǎng)基上用于獲得細菌菌落，該檢測培養(yǎng)基包含選自β-葡糖醛酸糖苷酶底物、β-半乳糖苷酶底物和α-半乳糖苷酶底物，和用于乳糖酸化酶、β-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物的第一底物，以及不同于所述第一底物的第二底物，其選自β-葡糖醛酸糖苷酶底物、β-半乳糖苷酶底物和α-半乳糖苷酶底物，以及用于乳糖酸化酶、β-核糖苷酶、磷酸酶、L-丙氨酸氨肽酶和L-亮氨酸氨肽酶的底物；和b)鑒定與第一底物和/或第二底物反應的菌落為大腸桿菌的菌落。文檔編號C12Q1/04GK101631873SQ200880004152公開日2010年1月20日申請日期2008年2月7日優(yōu)先權日2007年2月8日發(fā)明者C·羅歇-達爾貝托,D·蒙熱,M·佩雷,S·歐倫加申請人:生物梅里埃公司