一種高效表達中華絨螯蟹抗脂多糖因子的釀酒酵母工程菌的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種高效表達中華絨馨蟹抗脂多糖因子的釀酒酵母工程菌，屬于生物
技術領域。
【背景技術】
[0002] 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國經(jīng)濟出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)業(yè)之一，漁業(yè)在我國已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的 增長點。近年來甲殼類動物病害日趨嚴重，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。
[0003] 甲殼類動物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的先天性非 特異性免疫系統(tǒng)，能夠迅速識別和有效清除入侵的微生物。甲殼類動物的非特異性免疫 機制包括甲殼和粘液的屏障作用、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞隧作用W及非特異性體液分子。（1) 模式識風I蛋白(Pattern recognition proteins, PRPs)，包括LGBP (lipopolysaccharide and β-1, 3-glucan-binding protein, LGBP)與抗月旨多糖因子（Anti-Lipopolysaccharide factor, ALF)等，它們能與外來病原表面的脂多糖β-1,3-葡聚糖和膚聚糖等結合并等識 別病原體相關的分子模式（pathogen-associated molecular patte;rns，PAMPs)，繼而激活 酪氧化酶原（pro-phenoloxidase，proPO)系統(tǒng)；（2)酪氧化酶激活系統(tǒng)。甲殼動物酪氧化 酶酶原在血細胞中合成后釋放到血漿中。酪氧化酶酶原通過酪氧化酶酶原激活酶的水解轉 化成有活性的酪氧化酶，催化單酪化合物氧化成鄰二酪產(chǎn)物（o-diphenols)，再氧化成鄰二 釀（o-quinones)，鄰二釀抑制病原體胞外蛋白酶和幾下質(zhì)酶的活性，從而抑制甚至殺死病 原體。
[0004] 目前，中華絨馨蟹ALF基因的EST序列被測定，ALF全長的基因也被克隆化i， 2008)。有研究學者將中華絨馨蟹ALF基因在大腸桿菌中進行原核表達，但大腸桿菌表達體 系常會導致蛋白聚集形成不溶的無活性的包涵體，復性過程繁瑣，產(chǎn)出率低等因素大大提 高工業(yè)生產(chǎn)的成本，且蛋白表達量不高。目前也沒有中華絨馨蟹ALF在真核宿主中的表達。 眾所周知，基因的異源表達受到宿主、載體、啟動元件等多種因素的影響。因此，如何實現(xiàn)甲 殼類動物來源的ALF的異源表達、活性表達、高效表達是目前亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]為了克服上述問題，本發(fā)明利用釀酒酵母構建真核表達載體，實現(xiàn)了中華絨馨蟹 重要免疫因子ALF進行高效活性表達。本發(fā)明構建的釀酒酵母真核表達工程菌株必將在水 產(chǎn)養(yǎng)殖上發(fā)揮重要作用。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效表達中華絨馨蟹抗脂多糖因子的釀酒酵母 工程菌，所述基因工程菌的構建方法是將中華絨馨蟹抗脂多糖因子EsALF的cDNA克隆至表 達質(zhì)粒pHAClSl上得到測序驗證正確的重組質(zhì)粒pHAC181-EsALF，然后設計同源重組引物， 利用同源重組技術將目的基因EsALF整合至釀酒酵母宿主菌株的GAL1啟動子下游。該工 程菌在半乳糖的誘導下，可高效表達目的蛋白。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述EsALF的cDNA的CDS (coding sequence)區(qū)域 翻譯后的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。 陽00引在本發(fā)明的一種實施方式中，所述EsALF的cDNA的CDS區(qū)域的核巧酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達質(zhì)粒pHAClSl是在商業(yè)化質(zhì)粒YCplaclSl 的SphI和EcoRV位點插入3個組氨酸標簽得到的，詳見文獻：Analysesoftheeffectsof Rck2pmutantsonPbs2p?-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifya MAPkinasedockingmotif，andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidic substitutionofT379,MolGenGenomics, 2004, 271:208 - 219.
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主菌株為釀酒酵母GALl-ScRCHl，是將釀酒酵 母BY4741(Sc04153268_sl)菌株里的ScRCHl基因的啟動子替換成GAL1啟動子。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述釀酒酵母工程菌是按照如下方法構建得到的： (1)W中華絨馨蟹組織的cDNA為模板PCR擴增或者直接化學合成，得到核巧酸序列如SEQ IDNO. 1所示的EsALF基因片段；似將EsALF基因片段克隆到表達質(zhì)粒PHAC181上，得到 重組表達質(zhì)粒pHAC181-EsALF; (3)設計同源重組引物，對質(zhì)粒pHAC181-EsALF進行擴增，得 到含有EsALF基因的核巧酸片段，使用同源重組的方法，將該核巧酸片段整合至釀酒酵母 菌株中GAL1啟動子下游，并使用引物進行PCR檢測，有EsALF基因片段擴增出的轉化子即 為同源重組成功的菌株Gal-pHAC181-EsALF。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟（3)，還包括將菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導培 養(yǎng)化后，提取菌株蛋白，用于做WESTERN化0T檢測，目的蛋白表達的菌株則為構建成功的 酵母工程菌。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種高效表達中華絨馨蟹抗脂多糖因子的方法，所述 方法是使用所述釀酒酵母工程菌為生產(chǎn)菌株。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將釀酒酵母工程菌活化后，接種于YPG 培養(yǎng)基中，在半乳糖的誘導下培養(yǎng)化；所述YPG培養(yǎng)基含有D-半乳糖20g/l、蛋白腺20g/ ^酵母提取物lOg/L。
[0015] 本發(fā)明還要求保護所述釀酒酵母工程菌生產(chǎn)得到的抗脂多糖因子，W及其在水產(chǎn) 養(yǎng)殖及水產(chǎn)動物免疫飼料添加劑方面的應用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明構建的釀酒酵母工程菌，可W實現(xiàn)中華絨馨蟹重要免疫因子EsALF進 行高效表達、活性表達；本發(fā)明的釀酒酵母工程菌得到的EsALF具有活力，誘導培養(yǎng)化后每 mL發(fā)酵液可得蛋白0. 06mg。
[0018] (2)本發(fā)明的工程菌為釀酒酵母工程菌，表達真核來源的EsALF,可W分泌經(jīng)正確 折疊和加工的蛋白質(zhì)；而且釀酒酵母具有在簡單培養(yǎng)基中快速生長等優(yōu)點；
[0019] (3)本發(fā)明WPHAC181為載體、GALl-ScRCHl為宿主構建釀酒酵母工程菌，實現(xiàn)了 中華絨馨蟹重要免疫因子EsALF的高效表達，W期增強甲殼類動物對各種主要疾病和環(huán)境 變化的抵抗力，有效促進其健康生長。目前新型飼料蛋白源與飼料添加劑的研制與開發(fā)己 成為促進現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關鍵技術，本發(fā)明的酵母工程菌不僅可W更進一步對 甲殼類動物重要免疫基因的蛋白功能進行研究，也將為開發(fā)新型免疫增強型飼料添加劑提 供科學依據(jù)及新方法。
【附圖說明】
[0020]圖1 :中華絨馨蟹抗脂多糖因子EsALFcDNA擴增條帶（360bp); 陽02U圖2 :將中華絨馨蟹cDNA克隆至載體PHAC181上時，菌落PCR驗證陽性轉化子(Line4, 7,9,10,11為正確的轉化子）； 陽02引 圖3 :將中華絨馨蟹cDNA克隆至載體PHAC181上時，陽性轉化子的酶切驗證化ine5為正確的轉化子）；
[0023] 圖4 :高保真酶PrimeSTARG)(L酶對重組質(zhì)粒pHAC181-EsALF進行擴增（4742bp);
[0024] 圖5 :檢測引物檢測pHAC181-EsALF與含GAL1啟動子的菌株同源重組（同源重組 成功的條帶為634bp，Line1，3,6,7為正確的轉化子）； 陽0巧] 圖6 :肥STERNBL0T檢測到Gal-pHAC181-EsALF蛋白表達，目的蛋白為20邸。
【具體實施方式】
[00%] 在本發(fā)明中，首先采用基因克隆技術，具體為：將中華絨馨蟹RNA提取后，用反轉 錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。利用高保真PCR酶將目的基因片段EsALF進行擴增。擴 增得到的基因片段與載體PHAC181連接，轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞transTl中，涂布于LA 平板上37°C過夜培養(yǎng)。LA平板上得到的陽性轉化子進行酶切驗證及測序驗證。其次，利 用同源重組技術將帶有目的基因EsALF的質(zhì)粒PHAC181整合至釀酒酵母菌株GALl-ScRCHl 菌株中GAL1啟動子下游，整合成功的菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)化后，提取蛋白，用于 WESTERNBL0T檢測。目的蛋白表達成功的菌株則為構建成功的酵母工程菌。
[0027]LA培養(yǎng)基的組成：蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L、化C1lOg/l、瓊脂12g/l，調(diào)PH 為 7. 0,Amp抗生素lOOmg/ml(120°C，20min)。
[0028]SD-Leu培養(yǎng)基的組成：含有酵母氮源（無AA) 1. 7g/l、硫酸錠5g/L、葡萄糖20g/ LlOxAAmix(-ura，-leu，-his)100ml，100xUralOmiaOOxHis10ml，瓊脂 20g/L(12(TC， 20min)。
[0029]YPG培養(yǎng)基的組成：D-半乳糖20g/l、蛋白腺20g/l、酵母提取物10g/L(115°C， 20min)。
[0030] 實施例1:釀酒酵母基因工程菌的構建（基因克?。?br>[0031] 通過構建高表達質(zhì)粒pHAC181-EsALF，具體方法為提取中華絨馨蟹組織RNA，反 轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。利用高保真酶將目的基因片段EsALF進行PCR擴增， EsALF基因片段（CDS區(qū)域，不包含終止密碼子，共36化P)，然后將運個片段克隆到高表達質(zhì) 粒PHAC181多克隆位點上，最后對正確的重組子進行DNA測序，驗證序列沒有發(fā)生突變，得 到重組高表達質(zhì)粒pHAC181-EsALF。 陽0巧實施例2 :釀酒酵母基因工程菌的構建（同源重組）
[0033] 根據(jù)構建好的重組高表達質(zhì)粒pHAC181-EsALF設計同源重組引物，利用高保真 PrimeSTAR G)(L酶對質(zhì)粒pHAC181-EsALF進行擴增，擴增成功的長片段整合至釀酒酵母菌 株中GAL1啟動子下游。
[0034] 同源重組引物為F1、R1，序列如沈QIDNO. 3、SEQIDNO. 4所示：
[0035]FI：caaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaa 過過過cccgg過tctc過過過
[OO%] ATGGCACGCCTGTCGCTG
[0037] 民1 ;tatggacgaggtaataaggaaactcagaaccagaatagtggcatgagctctccaatttaacatatt tgccattagtgacc
[0038] CGATGATAAGCTGTCAAACATG
[0039] 基因同源重組（整合）的具體步驟為：