裂開型核酸適配體探針及其在腫瘤細胞檢測、捕獲與釋放中的應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種裂開型核酸適配體探針及其在腫瘤細胞檢測、捕獲與釋放中的應(yīng)用方法，該探針包括將完整的核酸適配體序列在適當(dāng)位點分裂后形成的片段a和片段b，二者與靶腫瘤細胞會發(fā)生特異性結(jié)合。檢測方法包括在片段a和片段b分別連接熒光供體和熒光受體，通過檢測供受體對的熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號強度來判斷腫瘤細胞存在與否。捕獲與釋放方法包括將插入有連接片段的片段a修飾于捕獲容器底部并向捕獲容器中加入待捕獲樣品和片段b，在溫度調(diào)控下實現(xiàn)對靶腫瘤細胞的捕獲與釋放。本發(fā)明的探針對靶腫瘤細胞具有特異響應(yīng)性和溫度敏感性，對腫瘤細胞的檢測、捕獲與釋放方法簡單、快速、靈敏、特異性強，有重要的科學(xué)價值和廣闊的市場前景。
【專利說明】裂開型核酸適配體探針及其在腫瘤細胞檢測、捕獲與釋放中的應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于核酸探針【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種裂開型核酸適配體探針的設(shè)計及其在腫瘤細胞檢測、捕獲與釋放中的應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】[0002]靈敏而特異的分子探針設(shè)計與構(gòu)建一直是腫瘤診斷學(xué)面臨的重要挑戰(zhàn)之一。在過去幾十年間，以“抗原-抗體”反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫分型技術(shù)對腫瘤診斷及治療相關(guān)研究的發(fā)展做出了巨大貢獻。然而，傳統(tǒng)的抗體制備過程主要依賴于動物或細胞，使其在應(yīng)用時往往表現(xiàn)出篩選周期長、成本高、存在批間差、保存和反應(yīng)條件適應(yīng)性差等不足。近年來，作為新型“化學(xué)抗體”出現(xiàn)的核酸適配體(aptamer)探針，由于具有一系列蛋白質(zhì)抗體所不具備的優(yōu)越特性，在腫瘤醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域受到了重要關(guān)注，為腫瘤診斷分型技術(shù)的發(fā)展帶來了新契機。
[0003]從本質(zhì)上來說，核酸適配體是指從人工合成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高親和性和高特異性地與靶標(biāo)分子結(jié)合的單鏈寡核苷酸，通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技術(shù)篩選而獲得(Tuerk C, Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNAligands to bacteriophage T4DNA polymerase.Sciencel990，249，505-510.EllingtonADj Szostak JW.1n vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Naturel990，346，818-822.)。它不僅具有類似抗體對靶標(biāo)的高親和力和高特異性結(jié)合性能，更在許多方面優(yōu)于抗體，如:靶標(biāo)種類豐富、合成方法簡單且重復(fù)性好、修飾靈活以及便于長期貯存和常溫運輸?shù)?。尤其是近幾年以全細胞為靶?biāo)并引入對相近細胞系反篩過程的cell-SELEX技術(shù)的出現(xiàn)，由于其具有富集快速、操作簡便、無需了解復(fù)雜靶標(biāo)的詳細信息并可同時篩選一組探針等一系列優(yōu)點，使得aptamer作為分子識別探針在區(qū)分不同腫瘤細胞類型甚至亞型方面的能力得到了極大增強(Shangguan D, Li Y，Tang Z, etal.Aptamers evolved from live cells as effective molecular probes for cancerstudy.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica2006，103，11838-11843.)。目前，基于cell-SELEX技術(shù)已有包括血液瘤和實體瘤在內(nèi)的多種腫瘤細胞特異性aptamer被篩選出來，并被廣泛應(yīng)用于腫瘤分型、診斷和治療石開究中(Fang X，Tan W.Aptamers generated from cell-SELEX for molecular medicine:achemical biology approach.Accounts of Chemical Research2010，43，48-57.)。
[0004]但是，現(xiàn)有基于aptamer的腫瘤診斷研究大多釆用“always on”信號模式，即利用具有信號發(fā)射特性的分子或納米材料標(biāo)記腫瘤特異性aptamer構(gòu)建腫瘤檢測探針，通過探針對祀標(biāo)和非祀標(biāo)的親和力差異實現(xiàn)腫瘤診斷(Hicke BJj Stephens AWj Gould T, etal.Tumor targeting by an aptamer.Journal of Nuclear Medicine2006，47，668-678.Hwang DWj Ko HY，Lee JHj et al.A nucIeoI in-targeted multimodal nanoparticleimaging probe for tracking cancer cells using an aptamer.Journal of NuclearMedicine2010，51，98-105.Shi H，Tang Z，Kim Y，et al.1n vivo fluorescence imagingof tumors using molecular aptamers generated by cell-SELEX.Chemistry-An AsianJournal2010，5，2209-2213.)。由于這類探針的信號始終存在，在體外應(yīng)用中，需要借助繁瑣的洗滌步驟以除去多余探針的信號干擾；而用于活體成像時，未與腫瘤結(jié)合的探針長時間存留于血液循環(huán)系統(tǒng)和非靶組織中，造成極高的背景信號，只有當(dāng)未結(jié)合探針代謝出體外后，腫瘤部位的熒光信號才能凸顯出來。因此，“always on”模式往往表現(xiàn)出診斷時間長、成像對比度不高、靈敏度有限等缺點，難以適應(yīng)腫瘤早期診斷的需要，并限制了 aptamer在臨床實際體系的腫瘤檢測與治療等方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有靶腫瘤細胞特異響應(yīng)性構(gòu)型激活性能的裂開型核酸適配體探針，并在此基礎(chǔ)上提供一種簡單、快速、免洗、靈敏而特異的腫瘤細胞檢測方法和一種簡單、快速、細胞親和性好的腫瘤細胞捕獲與釋放方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種裂開型核酸適配體探針(Splited Aptamer Probe, SAP),所述探針包括將完整的核酸適配體序列在適當(dāng)位點分裂后形成的兩條核酸片段，設(shè) 為片段a和片段b ;所述完整的核酸適配體序列具有對靶腫瘤細胞的特異性識別能力，在與靶腫瘤細胞結(jié)合時會形成特定的構(gòu)型；所述適當(dāng)位點是指在該位點(一個或一個以上的位點)對完整的核酸適配體序列進行分裂后的核酸片段仍能保持對靶腫瘤細胞的特異性識別能力；所述片段a和片段b在沒有靶腫瘤細胞存在時不會發(fā)生相互作用，當(dāng)體系中引入靶腫瘤細胞時，片段a和片段b與靶腫瘤細胞發(fā)生特異性結(jié)合，形成與完整的核酸適配體序列類似的識別構(gòu)型，所述片段a和片段b對靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合必須在片段a和片段b同時存在時才能發(fā)生。
[0007]上述的裂開型核酸適配體探針中，所述片段a和片段b對靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合具有溫度敏感性，即片段a和片段b與靶腫瘤細胞在0°C-8°C共培育時發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)溫度上升至37°C或37°C以上時，片段a和片段b與靶腫瘤細胞全部解離；所述片段a和片段b與靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合和解離具有可逆性。
[0008]上述的裂開型核酸適配體探針中，優(yōu)選的，所述完整的核酸適配體序列是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(簡稱SELEX技術(shù))篩選出來的腫瘤細胞特異性核酸適配體。更優(yōu)選的，所述完整的核酸適配體序列是指對人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞(簡稱CCRF-CEM腫瘤細胞)具有特異性識別能力的核酸適配體序列，所述完整的核酸適配體序列的核苷酸序列為:
[0009]5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’ ；
[0010]所述完整的核酸適配體序列裂開后形成的片段a和片段b的核苷酸序列分別為:
[0011]片段a:5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3’ ；
[0012]片段b:5’-TAC TGT ACG GTT AGA-3’ 或 5’-CTG TAC GGT TAG A-3’(在前一個片段b核苷酸序列的基礎(chǔ)上去除TA兩個堿基)。
[0013]作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述裂開型核酸適配體探針用于腫瘤細胞檢測的方法，包括以下步驟:
[0014](I)在片段a的5’端、片段b的3’端分別連接熒光供體和熒光受體，或者在片段a的3’端、片段b的5’端分別連接熒光供體和熒光受體；
[0015](2)向待測細胞溶液中加入5’端連接有熒光供體的片段a和3’端連接有熒光受體的片段b，或者加入3’端連接有熒光供體的片段a和5’端連接有熒光受體的片段b，混勻后于0°C-8°C下共培育90分鐘，并采用陰性細胞溶液進行相同操作作為陰性對照；
[0016](3)對上述共培育后的陰性細胞溶液和待測細胞溶液分別進行流式細胞術(shù)分析，即采用流式細胞儀激發(fā)熒光供體、收集熒光受體的信號，并對收集到的細胞群的熒光受體信號強度進行統(tǒng)計分析；在相同檢測參數(shù)下，當(dāng)陰性細胞溶液中熒光受體信號強度高于10的細胞數(shù)占細胞群中細胞總數(shù)的百分率小于或等于5%、待測細胞溶液中熒光受體信號強度高于10的細胞數(shù)占細胞群中細胞總數(shù)的百分率大于或等于10%時，即認為待測溶液中有目標(biāo)腫瘤細胞被所述裂開型核酸適配體探針檢出。
[0017]上述裂開型核酸適配體探針用于腫瘤細胞檢測的方法中，所述熒光供體和熒光受體之間存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)；所述熒光供體和熒光受體組成熒光供受體對，所述熒光供受體對優(yōu)選包括 FITC-TMR、FAM-TMR、Alexa488_TMR、Atto550-Atto647, Cy3_Cy5。
[0018]作為一個總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種上述裂開型核酸適配體探針用于溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放的方法，包括以下步驟:
[0019](1)將片段a的5’端先插入連接片段后再修飾第一功能團，在一捕獲容器底部修飾第二功能團，通過第一功能團與第二功能團之間的相互作用將帶有連接片段的片段a固定至捕獲容器底部，得到固定有片段a的捕獲容器；
[0020](2)將待捕獲細胞樣品與片段b —起加入上述固定有片段a的捕獲容器中，于(TC-8°C下共培育90分鐘，去除上清液并洗滌捕獲容器后，靶腫瘤細胞即可從待捕獲細胞樣品中分離出來并被捕獲至捕獲容器的底部；
[0021](3)將上述捕獲有靶腫瘤細胞的捕獲容器置于25°C-40°C培育60分鐘后取出上清液，即得到含有單純靶腫瘤細胞的溶液，可進一步用于細胞培養(yǎng)、檢測或其他相關(guān)研究。
[0022]上述裂開型核酸適配體探針用于溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放的方法中，所述裂開型核酸適配體探針對腫瘤細胞的捕獲與釋放具有可逆性；所述固定有片段a的捕獲容器具有循環(huán)使用功能，即在通過溫度變化控制腫瘤細胞捕獲與釋放過程中，當(dāng)經(jīng)過一輪細胞捕獲與釋放后，所述固定有片段a的捕獲容器能夠繼續(xù)用于下一輪腫瘤細胞的捕獲與釋放。
[0023]上述裂開型核酸適配體探針用于溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放的方法中，所述連接片段優(yōu)選一段不會與片段a雜交的核酸片段(如聚A鏈、聚T鏈等)或者一段具有親水性和生物相容性的聚合物鏈(如聚乙二醇鏈等)；所述第一功能團優(yōu)選生物素、巰基、羧基、氨基或炔基；所述第二功能團優(yōu)選鏈霉親和素、巰基、氨基或疊氮基；所述捕獲容器優(yōu)選細胞培養(yǎng)板(如96孔板等)或細胞捕獲芯片(如微流控芯片等)。
[0024]本發(fā)明的裂開型核酸適配體探針中，當(dāng)片段a和片段b與靶腫瘤細胞在0°C-8°C共同培育時表現(xiàn)出高親和力的特異性結(jié)合，隨著環(huán)境溫度逐漸升高，片段a和片段b對靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合能力逐漸下降，片段a和片段b與靶腫瘤細胞逐漸解離，當(dāng)環(huán)境溫度升至37°C或37°C以上時，片段a和片段b對靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合能力幾乎完全消失，片段a和片段b與靶腫瘤細胞完全解離；片段a和片段b與靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合和解離具有明顯的可逆特征，當(dāng)片段a和片段b與靶腫瘤細胞在OV-8°C結(jié)合后，隨著環(huán)境溫度升高至37°C或37°C以上，片段a和片段b從靶腫瘤細胞表面解脫下來，隨著環(huán)境溫度降低至0°C-8°C，片段a和片段b重新結(jié)合到靶腫瘤細胞表面。
[0025]本發(fā)明的探針用于腫瘤細胞檢測的方法中，在沒有靶腫瘤細胞存在時，5’端連接有熒光供體的片段a和3’端連接有熒光受體的片段b、或者3’端連接有熒光供體的片段a和5’端連接有熒光受體的片段b均處于游離狀態(tài)且不發(fā)生相互作用，此時熒光供體和熒光受體距離較遠，信號轉(zhuǎn)換微弱；體系中引入靶腫瘤細胞時，5’端連接有熒光供體的片段a和3’端連接有熒光受體的片段b、或者3’端連接有熒光供體的片段a和5’端連接有熒光受體的片段b與靶腫瘤細胞結(jié)合并形成特定構(gòu)型，導(dǎo)致熒光供體和熒光受體靠近而發(fā)生顯著的信號轉(zhuǎn)換效應(yīng)。
[0026]熒光供體可優(yōu)選FITC、FAM、Alexa488、Atto550、Cy3、包裹染料分子的二氧化硅納米顆?；驘晒饬孔狱c，熒光受體可優(yōu)選TMR、Atto647或Cy5。
[0027]本發(fā)明的探針用于腫瘤細胞特異性捕獲與釋放的方法中，通過溫度變化控制腫瘤細胞捕獲與釋放時，第一功能團和第二功能團之間的相互作用不會受到顯著影響，固定的片段a不會產(chǎn)生明顯損失。
[0028]連接片段用于使片段a與捕獲容器底部之間存在一定距離，以避免片段a與靶腫瘤細胞結(jié)合時捕獲容器底部產(chǎn)生的空間位阻；第一功能團與第二功能團之間的相互作用包括特異性結(jié)合作用或者共價交聯(lián)作用；捕獲容器用于裝載一定體積溶液并進行細胞培育。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0030]本發(fā)明利用了核酸適配體對腫瘤細胞的特異性高親和力以及裂開型核酸探針的靶標(biāo)響應(yīng)性構(gòu)型轉(zhuǎn)換機制和溫度敏感性，發(fā)展了基于裂開型核酸適配體探針的腫瘤細胞檢測以及溫度控制的特異性捕獲與釋放技術(shù)。在基于SAP的腫瘤細胞檢測技術(shù)中，本發(fā)明利用裂開型核酸探針作為信號轉(zhuǎn)換元件，將核酸適配體對靶腫瘤細胞的識別能力高靈敏、高特異性地轉(zhuǎn)換為熒光信號的變化，避免了現(xiàn)有基于單一信號報告基團標(biāo)記核酸適配體的檢測方法中，為克服非特異性吸附信號而進行的繁瑣洗滌過程，縮短了檢測時間。同時，基于裂開型核酸探針信號轉(zhuǎn)換機制，SAP與靶腫瘤細胞結(jié)合前后因構(gòu)型發(fā)生變化而引起熒光信號被激活，極大提高了檢測方法的靈敏性和特異性，這是傳統(tǒng)分析方法所無法比擬的。而在基于SAP的腫瘤細胞捕獲與釋放技術(shù)中，本發(fā)明利用裂開型核酸探針對靶標(biāo)響應(yīng)能力的溫度敏感特性，實現(xiàn)了一種溫和、簡單、快速且細胞親和性好的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放方法，將有望在血液循環(huán)腫瘤細胞分析及相關(guān)研究中發(fā)揮重要作用。
[0031]本發(fā)明為核酸適配體在腫瘤細胞檢測以及捕獲和釋放研究中的應(yīng)用提供了全新的手段和思路。該基于裂開型核酸適配體探針的腫瘤細胞檢測方法操作簡單、快速、靈敏、特異性強、成本低，該基于裂開型核酸適配體探針的腫瘤細胞捕獲與釋放方法操作簡單、溫和、快速、選擇性好、細胞傷害小，均具有重要的科學(xué)價值和廣闊的市場前景，有巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明實施例中裂開型核酸適配體探針的構(gòu)建及其腫瘤細胞識別原理示意圖。
[0033]圖2為本發(fā)明實施例1中裂開型核酸適配體探針對靶腫瘤細胞的識別親和力、特異性和溫敏性考察中，CCRF-CEM細胞和Ramos細胞分別與Cy5_SAPb探針、Cy5_SAP探針(同時包含Cy5-SAPb和SAPa)、Cy5_Sgc8c探針在4°C、20°C和37°C培育后的流式分析結(jié)果圖，其中:
[0034]曲線a為CCRF-CEM細胞或Ramos細胞與Cy5_SAPb探針在4°C、20°C或37°C培育后的流式分析結(jié)果；
[0035]曲線b為CCRF-CEM細胞或Ramos細胞與Cy5_SAP探針(同時包含Cy5_SAPb和SAPa)在4°C、20°C或37°C培育后的流式分析結(jié)果；
[0036]曲線c為CCRF-CEM細胞或Ramos細胞與Cy5_Sgc8c探針在4°C、20°C或37°C培育后的流式分析結(jié)果。
[0037]圖3為本發(fā)明實施例1中裂開型核酸適配體探針與靶腫瘤細胞結(jié)合的可逆溫度響應(yīng)性考察中，Cy5-SAP探針標(biāo)記的CCRF-CEM細胞首先在37°C培育不同時間再于4°C培育不同時間、扣除背景后的歸一化細胞平均熒光強度柱狀圖。
[0038]圖4為本發(fā)明實施例2中SAPa_Cy3探針和Cy5_SAPb探針的構(gòu)建及其腫瘤細胞檢測原理示意圖。
[0039]圖5為本發(fā)明實施例2中基于裂開型核酸適配體探針結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的腫瘤細胞特異性檢測可行性考察中，SAPa_Cy3探針和Cy5_SAPb探針共存時分別對CCRF-CEM細胞和Ramos細胞檢測的流式細胞分析結(jié)果圖。
[0040]圖6為本發(fā)明實施例3中基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放原理示意圖。
[0041]圖7為本發(fā)明實施例3中基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放可行性考察中，對照實驗組未修飾生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針后對CCRF-CEM細胞捕獲結(jié)果的明視場成像圖。
[0042]圖8為本發(fā)明實施例3中基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放可行性考察中，對照實驗組修飾有生物素化SAPa探針的96孔板在不加入SAPb探針的情況下對CCRF-CEM細胞捕獲結(jié)果的明視場成像圖。
[0043]圖9為本發(fā)明實施例3中基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放可行性考察中，對照實驗組修飾有生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針后對Ramos細胞捕獲結(jié)果的明視場成像圖。
[0044]圖10為本發(fā)明實施例3中基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放可行性考察中，修飾有生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針后對CCRF-CEM細胞捕獲結(jié)果的明視場成像圖。
[0045]圖11為本發(fā)明實施例3中基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放可行性考察中，修飾有生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針并對CCRF-CEM細胞捕獲后的樣品在4°C培育I小時后的釋放結(jié)果的明視場成像圖。
[0046]圖12為本發(fā)明實施例3中基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放可行性考察中，修飾有生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針并對CCRF-CEM細胞捕獲后的樣品在37°C培育I小時后的釋放結(jié)果的明視場成像圖。[0047]圖13為本發(fā)明實施例3中基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放可行性考察中，修飾有生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針后對CCRF-CEM細胞的捕獲結(jié)果、修飾有生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針并對CCRF-CEM細胞捕獲后的樣品分別在4°C和37°C培育I小時后的釋放結(jié)果的統(tǒng)計分析圖。
[0048]圖14為本發(fā)明實施例3中生物素化SAPa探針修飾的孔板用于靶腫瘤細胞的循環(huán)捕獲與釋放可行性考察中，修飾有生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針后對經(jīng)鈣黃綠素染色的CCRF-CEM細胞的第一輪抓捕結(jié)果、釋放結(jié)果和第二輪抓捕結(jié)果、釋放結(jié)果的熒光成像圖。[0049]圖15為本發(fā)明實施例3中生物素化SAPa探針修飾的孔板用于靶腫瘤細胞的循環(huán)捕獲與釋放可行性考察中，修飾有生物素化SAPa探針的96孔板加入SAPb探針后對經(jīng)鈣黃綠素染色的CCRF-CEM細胞的第一輪抓捕結(jié)果、釋放結(jié)果和第二輪抓捕結(jié)果、釋放結(jié)果的統(tǒng)計分析圖。
【具體實施方式】
[0050]以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。
[0051]實施例1:
[0052]針對CCRF-CEM腫瘤細胞(即人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞)設(shè)計的裂開型核酸適配體探針
[0053]一種如圖1所示的本發(fā)明的裂開型核酸適配體探針(SAP)，該探針包括將完整的核酸適配體序列在適當(dāng)位點分裂后形成的兩條核酸片段一SAPa和SAPb。該完整的核酸適配體序列具有對靶腫瘤細胞的特異性識別能力，并在與靶腫瘤細胞結(jié)合時會形成特定的發(fā)夾構(gòu)型。SAPa和SAPb在沒有靶標(biāo)(即靶腫瘤細胞)存在的情況下均處于自由游離狀態(tài)，不會發(fā)生明顯的相互作用，但當(dāng)體系中引入靶腫瘤細胞后，靶標(biāo)會誘導(dǎo)SAPa和SAPb形成與完整的核酸適配體序列類似的發(fā)夾構(gòu)型，從而可與靶腫瘤細胞發(fā)生特異性結(jié)合。本實施例的裂開型核酸適配體探針設(shè)計完成后直接交上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。
[0054]本實施例中的完整的核酸適配體序列是一段對CCRF-CEM腫瘤細胞具有特異性識別能力的DNA，其核苷酸序列為:
[0055]5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’ ；
[0056]本實施例中的裂開型核酸適配體探針的核苷酸序列分別為
[0057]SAPa:5，-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3，；
[0058]SAPb:5’ -CTG TAC GGT TAG A-3’。
[0059]裂開型核酸適配體探針對靶腫瘤細胞的識別親和力、特異性和溫敏性考察
[0060]為考察上述本實施例的裂開型核酸適配體探針對靶腫瘤細胞的識別性能，首先采用近紅外熒光染料Cy5對SAPb的5’端進行標(biāo)記，隨后向100 ii L含有2 X IO5個CCRF-CEM細胞的結(jié)合緩沖液(含4.5g/L葡萄糖、5mM MgCl2、lmg/mL牛血清白蛋白和0.lmg/mL酵母tRNA 的 Dulbecco，s PBS 緩沖液)中加入 100 u L 含有 80nM Cy5 標(biāo)記的 SAPb (Cy5_SAPb)和640nMSAPa的結(jié)合緩沖液，混勻后分別于4°C (0-8°C均可，下同)、20°C和37°C下避光培育90分鐘，再立即用FACSCalibur流式細胞儀(Becton-Dickinson，美國)對細胞的熒光強度進行檢測(采用633nm光激發(fā)、第四通道FL4收集);同時，在相同條件下，采用人B淋巴細胞瘤細胞(簡稱Ramos細胞)作為陰性對照細胞，采用單純Cy5_SAPb作為陰性對照探針，采用Cy5標(biāo)記的完整核酸適配體序列SgcSc (Cy5-Sgc8c)作為陽性對照探針。
[0061]如圖2所示，當(dāng)以單純Cy5_SAPb探針為陰性對照時，在4°C培育后，Cy5_SAP探針(同時包含Cy5-SAPb和SAPa)顯示出與完整Cy5_Sgc8c相當(dāng)?shù)腃CRF-CEM細胞熒光標(biāo)記強度，說明該溫度下，將SgcSc裂開并不會對其靶細胞識別能力產(chǎn)生影響；然而，隨著溫度的升高，盡管完整Cy5-Sgc8c始終保持著對CCRF-CEM細胞的高親和力，但Cy5_SAP探針則表現(xiàn)出顯著的溫度敏感性，其標(biāo)記靶細胞的熒光強度隨溫度升高而急劇下降。特別是當(dāng)溫度升高至37°C時，Cy5-SAP探針幾乎完全喪失了對CCRF-CEM細胞的識別效果。同時，在以Ramos細胞為陰性對照的特異性考察中還發(fā)現(xiàn)，無論在任何溫度下，Cy5-SAP探針都沒有顯示對Ramos細胞的明顯標(biāo)記效果，展示出良好的檢測特異性；而相比之下，完整Cy5-Sgc8c則始終表現(xiàn)出較Cy5-SAP探針稍強的非特異性吸附信號。因此，在最佳識別溫度4°C (也可以是0-8°C )下，Cy5-SAP探針產(chǎn)生的CCRF-CEM細胞對Ramos細胞的熒光標(biāo)記信背比要遠高于完整Cy5-Sgc8c。由此可見，裂開型核酸適配體探針能夠有效實現(xiàn)在保留親和力的同時提高檢測特異性，且這一識別性能具有明顯的溫度敏感性。
[0062]裂開型核酸適配體 探針與靶腫瘤細胞結(jié)合的可逆溫度響應(yīng)性考察
[0063]采用流式細胞術(shù)對SAP探針與靶CCRF-CEM細胞之間相互作用的可逆溫度響應(yīng)性進行了考察，即以單純Cy5-SAPb對CCRF-CEM細胞的非特異性信號為背景，首先將Cy5_SAP探針(包含40nM Cy5-SAPb和320nM SAPa)與CCRF-CEM細胞在結(jié)合緩沖液中于4°C避光培育90分鐘使二者穩(wěn)定結(jié)合，接著將該細胞樣品置于37°C培養(yǎng)箱中孵育I小時，孵育期間每隔10分鐘取IOOy L進行流式分析檢測；隨后將37°C孵育I小時后的細胞樣品置于4°C避光培育I小時，培育期間每隔10分鐘取出IOOy L進行流式分析檢測(采用633nm光激發(fā)、第四通道FL4收集)。
[0064]將每個細胞樣品通過流式細胞分析得到的平均熒光強度進行非特異性背景扣除和歸一化處理后，可得到如圖3所示的識別能力變化趨勢。由圖3可知，將Cy5-SAP探針與CCRF-CEM細胞置于4°C培育90分鐘后，與Cy5_SAPb對照探針樣品相比，可觀察到顯著增強的熒光標(biāo)記信號，表明在此溫度下SAP具有對靶腫瘤細胞的高親和力。接著，將該標(biāo)記有Cy5-SAP探針的CCRF-CEM細胞樣品置于37°C培育不同時間發(fā)現(xiàn)，細胞的熒光信號隨時間延長而逐漸下降，當(dāng)培育時間為30分鐘時，CCRF-CEM細胞的熒光標(biāo)記強度即已下降80%以上，而在培育60分鐘后，所檢測到的信號即與Cy5-SAPb探針陰性背景相當(dāng)，顯示此時Cy5-SAP探針已與CCRF-CEM細胞完全解離。隨后，將已于37°C下培育60分鐘的Cy5_SAP標(biāo)記CCRF-CEM細胞樣品重新置于4°C繼續(xù)培育，可以發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，細胞的熒光信號呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，當(dāng)培育時間為30分鐘時，所檢測到的細胞熒光強度即已恢復(fù)近60%，而在培育60分鐘后，則可觀察到80%左右的熒光恢復(fù)。由此可見，SAP探針與CCRF-CEM細胞之間的結(jié)合和解離狀態(tài)完全可以通過調(diào)節(jié)環(huán)境溫度在4°C和37°C之間轉(zhuǎn)換這一非常溫和的方式進行控制。
[0065]實施例2:
[0066]基于裂開型核酸適配體探針結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的腫瘤細胞檢測方法(SP可行性考察)[0067]如圖4所示，以Cy3_Cy5作為熒光供受體對模型，裂開型核酸適配體探針結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)用于腫瘤細胞檢測的原理如下:將熒光供體Cy3連接于SAPa探針3’端構(gòu)建了 SAPa-Cy3探針，將熒光受體Cy5連接于SAPb探針5’端構(gòu)建了 Cy5_SAPb探針；向待測細胞溶液中加入SAPa_Cy3探針和Cy5_SAPb探針，當(dāng)體系中沒有靶腫瘤細胞存在時，SAPa-Cy3探針和Cy5_SAPb探針之間不會發(fā)生明顯的相互作用，熒光供體Cy3和熒光受體Cy5之間距離較遠，熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號微弱，處于“關(guān)閉”狀態(tài)；而當(dāng)體系中有靶腫瘤細胞存在時，在最佳識別溫度(0-8°C)下，由于SAPa-Cy3探針和Cy5_SAPb探針經(jīng)靶標(biāo)誘導(dǎo)形成類似發(fā)夾的構(gòu)型，從而將熒光供體Cy3和熒光受體Cy5之間的距離拉近并觸發(fā)熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號增強，信號轉(zhuǎn)換為“開啟”狀態(tài)；由此，通過監(jiān)測熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號的變化即可指示靶腫瘤細胞的存在。
[0068]本實施例中，采用的針對CCRF-CEM腫瘤細胞的裂開型核酸適配體探針同實施例1,
[0069]SAPa_Cy3探針的核苷酸序列為:
[0070]5， -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA_(Cy3)_3，；
[0071]Cy5_SAPb探針的核苷酸序列為: [0072]5， -(Cy5)-CTG TAC GGT TAG A_3，。
[0073]具體檢測方法如下:
[0074]分別向100 ii L含有2 X IO5個CCRF-CEM細胞的結(jié)合緩沖液和100 U L含有2 X IO5個Ramos細胞的結(jié)合緩沖液中加入100 u L含有80nM SAPa_Cy3探針和640nM Cy5_SAPb探針的結(jié)合緩沖液，混勻后均于4°C避光培育90分鐘，再立即用流式細胞儀對細胞的熒光強度進行檢測(采用488nm光激發(fā)、第三通道FL3收集熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號)。
[0075]結(jié)果如圖5所示，與SAPa_Cy3探針和Cy5_SAPb探針共培育后的CCRF-CEM細胞樣品在488nm光激發(fā)下，顯示出較為強烈的熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號(第三通道FL3收集信號)增強，其中信號強度高于10的細胞數(shù)占細胞群中細胞總數(shù)的51.42% ;而在相同條件下，與SAPa-Cy3探針和Cy5_SAPb探針共培育后的Ramos細胞樣品則并未呈現(xiàn)明顯的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)發(fā)生，其中信號強度高于10的細胞數(shù)僅占細胞群中細胞總數(shù)的4.57%。由此說明，該基于裂開型核酸適配體探針結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)的腫瘤細胞檢測方法完全具備可行性，并且展示出靈敏而特異的檢測性能。
[0076]實施例3:
[0077]基于裂開型核酸適配體探針的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放方法(即可行性考察)
[0078]腫瘤細胞的特異性捕獲、分離和釋放回收技術(shù)的發(fā)展對于血液循環(huán)腫瘤細胞分析及其相關(guān)研究具有十分重要的意義。本發(fā)明利用裂開型核酸適配體探針對靶腫瘤細胞的識別親和力具有溫度敏感性的特點，發(fā)展了一種溫和、簡單而快速的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放方法，其具體原理如圖6所示:直接選擇包被有親和素的96孔細胞培養(yǎng)板作為捕獲容器，同時在SAPa片段5’端先插入由10個連續(xù)T堿基組成的連接片段再修飾生物素分子以構(gòu)建生物素化SAPa探針；接著，基于“生物素-親和素”特異性相互作用在該96孔板底部組裝生物素化SAPa探針，并采用牛血清白蛋白(BSA)對未結(jié)合位點進行封閉；在向孔內(nèi)加入待捕獲細胞樣品和SAPb探針后置于4°C培育，利用此溫度下生物素化SAPa探針和SAPb探針的特異性識別能力將靶腫瘤細胞捕獲至底板上，同時將未結(jié)合的非靶細胞和其他雜質(zhì)有效去除；隨即采用簡單而溫和的溫度控制方式，將孔板置于37°C條件下，使生物素化SAPa探針和SAPb探針喪失對靶標(biāo)的結(jié)合能力從而將靶腫瘤細胞釋放至上清液中，由此獲得的含有單純靶腫瘤細胞的溶液可進一步用于細胞培養(yǎng)、檢測或其他相關(guān)研究；與此同時，經(jīng)細胞釋放后的孔板還可循環(huán)利用進入下一輪腫瘤細胞捕獲與釋放過程。
[0079]本實施例中，采用的針對CCRF-CEM腫瘤細胞的裂開型核酸適配體探針同實施例1,
[0080]生物素化SAPa探針的核苷酸序列為:
[0081]5，-生物素-TTT TTT TTT T ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3，。
[0082]具體捕獲與釋放方法包括以下步驟:[0083](I)向親和素包被的96孔板內(nèi)加入50 u L/孔含有生物素化SAPa探針的Tris-HCl緩沖液(IOOmM NaCl、30mM Tris-HCl，pH7.4)，每 50 y L Tris-HCl 緩沖液中含 200pmol 生物素化SAPa探針，于37°C下避光孵育I小時后用磷酸鹽緩沖液(8.00g/L NaCU0.20g/L KCl、
1.44g/LNa2HP04、0.24g/L KH2PO4, pH7.4)洗孔三次以去掉多余的未結(jié)合生物素化SAPa探針，再加入50 ii L質(zhì)量分數(shù)為1%的BSA于37°C繼續(xù)避光孵育I小時以封閉孔板底部的未反應(yīng)位點，接著用結(jié)合緩沖液洗孔3遍，即制得底板上固定有生物素化SAPa探針的96孔板；
[0084](2)向上述底板上固定有生物素化SAPa探針的96孔板中加入50ii L/孔含有CCRF-CEM細胞的結(jié)合緩沖液(3X IO5個CCRF-CEM細胞/50 u L結(jié)合緩沖液)和6.4 y L/孔SAPb探針(50 ii M)，混勻后于4°C避光培育90分鐘，去除上清液并用結(jié)合緩沖液(預(yù)先冰好)于4°C洗孔3遍后，靶腫瘤細胞即可從原樣品中分離出來并被捕獲至孔板底部，隨后加入100 u L/孔結(jié)合緩沖液于光學(xué)顯微鏡下對孔板底部捕獲到的靶腫瘤細胞進行成像表征和計數(shù)，以判定該捕獲過程是否有效；
[0085](3)將上述捕獲有靶腫瘤細胞的孔板置于37°C避光培育60分鐘后取出上清液，即可獲得含有單純靶腫瘤細胞的溶液，隨后加入100 u L/孔結(jié)合緩沖液于光學(xué)顯微鏡下對孔板底部殘留的細胞進行成像表征和計數(shù)，以判定該釋放過程是否有效。
[0086]針對上述基于裂開型核酸適配體探針的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放方法，首先通過設(shè)計多組對照實驗對其特異性捕獲可行性進行了考察(含操作步驟I和操作步驟2)，包括未修飾生物素化SAPa探針的孔板加入SAPb探針后對CCRF-CEM細胞的捕獲對照(參見圖7)、修飾有生物素化SAPa探針的孔板在不加入SAPb探針的情況下對CCRF-CEM細胞的捕獲對照(參見圖8)以及修飾有生物素化SAPa探針的孔板加入SAPb探針后對Ramos細胞的捕獲對照(參見圖9)。結(jié)果表明，只有修飾了生物素化SAPa探針的孔板在同時加入SAPb探針的情況下才能實現(xiàn)對CCRF-CEM細胞的特異性捕獲(參見圖10)，其捕獲到的細胞密度高達4638±394cells/mm2 (參見圖 13)。
[0087]隨后，將上述經(jīng)操作步驟I和操作步驟2獲得的捕獲有CCRF-CEM細胞的孔板樣品置于37°C下培育I小時(操作步驟3)，考察了細胞釋放可行性。以經(jīng)操作步驟I和操作步驟2獲得的捕獲有CCRF-CEM細胞的孔板樣品置于4°C下培育I小時后的釋放結(jié)果為對照比較發(fā)現(xiàn)，4°C培育并未使捕獲到的細胞得到有效釋放(參見圖11)，仍然可以觀察到密度為4200 ±551 ce 11 s/mm2的CCRF-CEM細胞牢固結(jié)合在孔板底部(參見圖13);而經(jīng)過37°C處理后，由于破壞了裂開型核酸適配體探針與靶細胞之間的緊密結(jié)合，底板上僅可見個別細胞殘留(參見圖12)，密度下降至18±6cells/mm2 (參見圖13)。[0088]綜上所述，裂開型核酸適配體探針不僅可用于靶腫瘤細胞的特異性捕獲，而且還能在溫度改變的溫和調(diào)控下，有效實現(xiàn)對捕獲細胞的釋放回收。
[0089]生物素化SAPa探針修飾的孔板用于靶腫瘤細胞的循環(huán)捕獲與釋放可行性考察
[0090]采用鈣黃綠素對CCRF-CEM細胞進行熒光染色，即將適量CCRF-CEM細胞置于含6111鈣黃綠素的磷酸鹽緩沖液(8.0(-/1 NaCl、0.20g/L KCl、1.44g/L Na2HP04、0.24g/LKH2PO4,pH7.4)中，于37°C避光培育20分鐘后用磷酸鹽緩沖液洗滌3次并分散于結(jié)合緩沖液中備用(采用汞燈藍光波段激發(fā)，收集綠光發(fā)射)；隨后采用如上述基于裂開型核酸適配體探針的溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放可行性考察中所述孔板修飾和細胞捕獲與釋放程序?qū)CRF-CEM細胞進行連續(xù)兩輪捕獲與釋放處理，于低倍物鏡大視野觀察條件下對生物素化SAPa探針修飾的孔板用于靶腫瘤細胞的循環(huán)捕獲與釋放性能進行了考察。結(jié)果如圖14和圖15所示，經(jīng)4°C培育后，生物素化SAPa探針修飾的孔板在SAPb探針的共同作用下，將大量鈣黃綠素標(biāo)記的CCRF-CEM細胞捕獲于孔板底部，密度高達4173± 113cells/mm2 ;接著進行37°C升溫處理，絕大多數(shù)細胞即被釋放至上清中，底板上僅可見零星光點，密度下降為15±6CellS/mm2，由此成功實現(xiàn)了第一輪細胞捕獲與釋放。隨后，向上述孔中繼續(xù)加入新鮮鈣黃綠素標(biāo)記的CCRF-CEM細胞樣品并補充SAPb探針以實施第二輪細胞捕獲與釋放。通過統(tǒng)計底板上的細胞密度發(fā)現(xiàn)，該使用過孔板的捕獲效率仍高達4330±170cellS/mm2，且釋放后即急劇下降至13±5CellS/mm2。由此可見，該溫控處理方式不會對生物素化SAPa探針修飾孔板的捕獲與釋放性能造成破壞，使其可有效用于腫瘤細胞的循環(huán)捕獲與釋放研究。
[0091 ] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不僅局限于上述實施例。凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護范圍。應(yīng)該指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下的改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種裂開型核酸適配體探針，其特征在于，所述探針包括將完整的核酸適配體序列在適當(dāng)位點分裂后形成的兩條核酸片段，設(shè)為片段a和片段b ;所述完整的核酸適配體序列具有對靶腫瘤細胞的特異性識別能力，所述適當(dāng)位點是指在該位點對完整的核酸適配體序列進行分裂后的核酸片段仍能保持對靶腫瘤細胞的特異性識別能力；所述片段a和片段b在沒有靶腫瘤細胞存在時不會發(fā)生相互作用，當(dāng)體系中引入靶腫瘤細胞時，片段a和片段b與靶腫瘤細胞發(fā)生特異性結(jié)合，所述片段a和片段b對靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合必須在片段a和片段b同時存在時才能發(fā)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裂開型核酸適配體探針，其特征在于，所述片段a和片段b對靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合具有溫度敏感性，即片段a和片段b與靶腫瘤細胞在(TC-8°C共培育時發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)溫度上升至37°C或37°C以上時，片段a和片段b與靶腫瘤細胞全部解離；所述片段a和片段b與靶腫瘤細胞的特異性結(jié)合和解離具有可逆性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的裂開型核酸適配體探針，其特征在于，所述完整的核酸適配體序列是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)篩選出來的腫瘤細胞特異性核酸適配體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的裂開型核酸適配體探針，其特征在于，所述完整的核酸適配體序列是指對人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞具有特異性識別能力的核酸適配體序列，所述完整的核酸適配體序列的核苷酸序列為:
5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’ ； 所述完整的核酸適配體序列裂開后形成的片段a和片段b的核苷酸序列分別為:
片段 a:5’ -ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AA-3’ ；
片段 b:5’ -TAC TGT ACG GTT AGA-3’ 或 5’ -CTG TAC GGT TAG A-3’。
5.一種如權(quán)利要求1 -4中任一項所述的裂開型核酸適配體探針用于腫瘤細胞檢測的方法，包括以下步驟: (1)在片段a的5’端、片段b的3’端分別連接熒光供體和熒光受體，或者在片段a的3’端、片段b的5’端分別連接熒光供體和熒光受體； (2)向待測細胞溶液中加入5’端連接有熒光供體的片段a和3’端連接有熒光受體的片段b，或者加入3’端連接有熒光供體的片段a和5’端連接有熒光受體的片段b，混勻后于0°C-8°C下共培育90分鐘，并采用陰性細胞溶液進行相同操作作為陰性對照； (3)對上述共培育后的陰性細胞溶液和待測細胞溶液分別進行流式細胞術(shù)分析，即采用流式細胞儀激發(fā)熒光供體、收集熒光受體的信號，并對收集到的細胞群的熒光受體信號強度進行統(tǒng)計分析；在相同檢測參數(shù)下，當(dāng)陰性細胞溶液中熒光受體信號強度高于10的細胞數(shù)占細胞群中細胞總數(shù)的百分率小于或等于5%、待測細胞溶液中熒光受體信號強度高于10的細胞數(shù)占細胞群中細胞總數(shù)的百分率大于或等于10%時，即認為待測溶液中有目標(biāo)腫瘤細胞被所述裂開型核酸適配體探針檢出。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述突光供體和突光受體之間存在突光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)；所述熒光供體和熒光受體組成熒光供受體對，所述熒光供受體對包括FITC-TMR、FAM-TMR、Alexa488_TMR、Atto550-Atto647 或 Cy3_Cy5。
7.—種如權(quán)利要求1-4中任一項所述的裂開型核酸適配體探針用于溫度控制的腫瘤細胞特異性捕獲與釋放的方法，包括以下步驟: (I)將片段a的5’端先插入連接片段后再修飾第一功能團，在一捕獲容器底部修飾第二功能團，通過第一功能團與第二功能團之間的相互作用將帶有連接片段的片段a固定至捕獲容器底部，得到固定有片段a的捕獲容器； (2)將待捕獲細胞樣品與片段b—起加入上述固定有片段a的捕獲容器中，于0°C-8°C下共培育90分鐘，去除上清液并洗滌捕獲容器后，靶腫瘤細胞即可從待捕獲細胞樣品中分離出來并被捕獲至捕獲容器的底部； (3)將上述捕獲有祀腫瘤細胞的捕獲容器置于25°C-40°C培育60分鐘后取出上清液，即得到含有單純靶腫瘤細胞的溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述裂開型核酸適配體探針對腫瘤細胞的捕獲與釋放具有可逆性，所述固定有片段a的捕獲容器具有循環(huán)使用功能，即在通過溫度變化控制腫瘤細胞捕獲與釋放過程中，當(dāng)經(jīng)過一輪細胞捕獲與釋放后，所述固定有片段a的捕獲容器能夠繼續(xù)用于下一輪腫瘤細胞的捕獲與釋放。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述連接片段為一段不會與片段a雜交的核酸片段或 者一段具有親水性和生物相容性的聚合物鏈；所述第一功能團包括生物素、巰基、羧基、氨基或炔基；所述第二功能團包括鏈霉親和素、巰基、氨基或疊氮基；所述捕獲容器包括細胞培養(yǎng)板或細胞捕獲芯片。
【文檔編號】C12Q1/04GK103451182SQ201310418651
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】王柯敏, 石慧, 何曉曉, 湯進錄, 顏律安 申請人:湖南大學(xué)