一種本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑及其應(yīng)用；該復(fù)合制劑由稠油降解菌群、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、復(fù)合表面活性劑滲透劑、氧化促進(jìn)活化劑四個(gè)部分組成，其中稠油降解菌群是由從稠油土壤中篩選分離出的好氧桿狀細(xì)菌（Lactobacillus sp.）和厭氧桿狀芽孢細(xì)菌（bacillus sp.）構(gòu)成；將復(fù)合制劑噴灑在污染土壤中，經(jīng)過2-3個(gè)月，稠油污染土壤的降解率達(dá)到50-80%。
CGMCC No7636
20130523

CGMCC No7637
20130523
【專利說明】一種本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑及其對(duì)稠油污染土壤的修復(fù)應(yīng)用，屬于 微生物修復(fù)石油污染土壤【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】：
[0002] 隨著我國(guó)石油工業(yè)的迅速發(fā)展和對(duì)能源的迫切需求，對(duì)稠油的開采技術(shù)和產(chǎn)量越 來越受到重視。目前，在我國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的稠油油田主要分布下面幾個(gè)油區(qū)：遼河油區(qū)（主 要包括曙光油田、歡喜嶺稠油區(qū)、和高升油田），新疆克拉瑪依油區(qū)（主要分布在九區(qū)，六東 區(qū)，紅山嘴油田和鳳城稠油區(qū)），勝利油區(qū)，河南油區(qū)，吐哈油區(qū)和大港油區(qū)。稠油油區(qū)的稠 油總產(chǎn)量每年都在大幅度持續(xù)增長(zhǎng)。但稠油油田在勘探開發(fā)過程中的鉆井、井下作業(yè)和采 油等多個(gè)環(huán)節(jié)所產(chǎn)成的廢棄泥漿、落地原油、油泥等污染源以及運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程都會(huì)帶來 井場(chǎng)及其附近土壤土質(zhì)的惡化，破壞了稠油油區(qū)所在地的生態(tài)環(huán)境。稠油污染土壤還會(huì)隨 雨水、河流進(jìn)入到地下水或者遷移到動(dòng)物和植物體內(nèi)，對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全和人身健康構(gòu) 成嚴(yán)重威脅。
[0003] 微生物修復(fù)技術(shù)是利用自然環(huán)境中的土著菌、人為投加的外來菌或基因工程菌的 生命代謝作用分解環(huán)境中的污染物，從而降低或去除污染物的毒性以達(dá)到修復(fù)環(huán)境的目 的。當(dāng)前用于土壤石油污染治理的方法包括：物理修復(fù)法、化學(xué)修復(fù)法和生物修復(fù)法。物理 修復(fù)法和化學(xué)修復(fù)法應(yīng)用成熟，但費(fèi)用高昂，且使用的化學(xué)試劑會(huì)產(chǎn)生二次污染；石油污染 土壤的微生物修復(fù)是生物修復(fù)法中非常重要的方法，微生物修復(fù)法利用微生物及其他添加 齊U，將存在于土壤中有毒有害的石油污染物降解為二氧化碳和水或轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)的系統(tǒng) 工程技術(shù)，由于微生物修復(fù)技術(shù)具有費(fèi)用低、處理效果好、對(duì)環(huán)境影響低、無二次污染、不破 壞植物生長(zhǎng)所需要的土壤環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明目的是提供一種本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑及其用于稠油污染土壤的修復(fù)。
[0005] 本發(fā)明所述的本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑由以下四種組分組成：從稠油污染土壤中 分離出的高效降解菌、降解菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、復(fù)合表面活性劑滲透劑、氧化促進(jìn)活化劑。這四 種組分可以單獨(dú)保存。
[0006] 本發(fā)明提供的高效降解菌是乳桿菌5# (Lactobacillus sp.)和芽孢桿菌1# (Bacillus sp.)都保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)分別 為 CGMCC No. 7637 和 CGMCC No. 7636。
[0007] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的。
[0008] 1 ?從稠油污染土壤中分離降解菌：
[0009] (1)制備微生物培養(yǎng)基
[0010] 無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的組成：在1000ml蒸餾水中加入NaCllO. 00g，NH4C10. 50g， K2HP041. OOg, MgS040. 50g, CaCl20. 20g, KC10. lOg, FeS04 ? 7H200. 02g ；
[0011] 胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA)液體培養(yǎng)基組成：在1000ml蒸餾水中加入酪蛋白 17. 00g，蛋白胨 3. 00g，葡萄糖 2. 50g，NaC15. 00g，K2HP042. 50g ;
[0012] (2)優(yōu)勢(shì)菌的富集分離和篩選
[0013] 從油污土壤中富集降解菌采用TSA液體培養(yǎng)基，使其能夠迅速生長(zhǎng)，第二次及第 三次富集培養(yǎng)采用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，加入1%稠油；分離培養(yǎng)基為無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基加入 2%的瓊脂，加入1%稠油；篩選降解采用無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基加入0. 5%的稠油；菌種純化保存 培養(yǎng)基為TSA液體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂，斜面劃線后于冰箱內(nèi)保存。
[0014] 2.微生物降解菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)篩選
[0015] 所述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由（NH4) 2S04, KN03和KH2P04構(gòu)成。
[0016] 本產(chǎn)品中微生物降解菌的N源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是由KN03和（NH4) 2S04構(gòu)成，P源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 由KH2P04構(gòu)成。
[0017] 3.油污土壤氧化促進(jìn)活化劑
[0018] 稠油污染土壤中含有大量重質(zhì)成分和部分膠質(zhì)、浙青。雙氧水（H202)在降解初期可 直接氧化土壤中重質(zhì)成分和部分膠質(zhì)、浙青，并能及時(shí)補(bǔ)充土壤中氧的消耗，作為微生物降 解的電子受體。本產(chǎn)品中的氧化促進(jìn)活化劑采用雙氧水（H 202) (98%含量的工業(yè)化產(chǎn)品)。
[0019] 4?復(fù)合表面活性劑滲透劑
[0020] 表面活性劑可以使石油類分散乳化及溶解，增加有機(jī)物的親水性，使吸附在土壤 上的油進(jìn)入到土壤溶液，增加了石油的生物可利用性，增強(qiáng)降解菌細(xì)胞膜的通透性，大大促 進(jìn)了生物降解過程。本產(chǎn)品選取油溶性化學(xué)表面活性劑TW-80和生物表面活性劑鼠李糖脂 組成的復(fù)合表面活性劑做滲透劑。這主要是考慮到高濃度的油溶性表面活性劑TW-80具有 一定的二次污染，高濃度生物表面活性劑鼠李糖脂成本高。
[0021] 本發(fā)明所述的本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑用于稠油污染土壤的修復(fù)：
[0022] (1)將 0. 1 克（NH4) 2S04,0 . 05 克 KN03 和 0. 2 克 KH2P04 加入 100 毫升的蒸餾水中， 均勻噴灑在已經(jīng)加入20毫升降解菌的100克污染土壤中，并混合均勻；
[0023] (2)將0. 02-0. 06克的雙氧水均勻噴灑在已經(jīng)加入降解菌的100克污染土壤中，并 混合均勻；
[0024] (3)由0.02-0. 1克TW-80和0? 1-0. 3克鼠李糖脂，溶解在1-5毫升的甲醇中，均勻 噴灑在土壤中，并翻土混合均勻。
[0025] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：
[0026] 1.本發(fā)明涉及的高效稠油降解菌是從稠油污染土壤中分離富集，純化得到的，降 解菌本身來自稠油土壤中，屬于本源微生物降解菌，所以對(duì)含有重質(zhì)成分和膠質(zhì)浙青較高 的稠油污染土壤具有很好的適應(yīng)性和高效性。
[0027] 2.本發(fā)明涉及的高效稠油降解菌的分離富集，純化采用常見的無機(jī)鹽和TSA培養(yǎng) 基，所用方法為常規(guī)培養(yǎng)方法，無特殊環(huán)境要求和特殊培養(yǎng)條件。
[0028] 3.本發(fā)明涉及的高效稠油降解菌是一種由降解效果好兼性厭氧桿狀細(xì)菌和適應(yīng) 性強(qiáng)的好氧芽孢桿菌構(gòu)成。稠油污染土壤中含有缺氧板結(jié)部分和含氧量高的松散部分，有 利用高效菌的作用充分發(fā)揮。
[0029] 4.石油污染土壤中的各類石油烴被微生物降解的相對(duì)能力為：飽和烴〉芳香烴〉 膠質(zhì)和浙青，稠油污染土壤中主要含芳香烴及部分膠質(zhì)和浙青。本產(chǎn)品添加了少量的氧化 性強(qiáng)的雙氧水（H2o2)，在降解初期可直接氧化稠油土壤中部分芳香烴及部分膠質(zhì)和浙青，使 石油烴降解為低分子量的物質(zhì)，提高微生物的降解效果，并及時(shí)補(bǔ)充土壤中氧的消耗，作 為微生物降解的電子受體，促進(jìn)微生物降解。
[0030] 5.本產(chǎn)品采用油溶性化學(xué)表面活性劑和生物表面活性劑的復(fù)合劑來增強(qiáng)污染油 的生物可利用性，增強(qiáng)降解菌細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)微生物降解效果，解決了高含量油溶性 化學(xué)表面活性劑的二次污染和高含量生物表面活性劑成本高的問題。
[0031] 生物保藏信息
[0032] 1、保藏編號(hào)：GMCC No. 7636
[0033] 保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0034] 保藏日期：2013年5月23日
[0035] 2、保藏編號(hào)：CGMCC No. 7637
[0036] 保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0037] 保藏日期：2013年5月23日

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1不同N源對(duì)石油降解效率的影響
[0039] 圖2不同P源對(duì)石油降解效果的影響
[0040] 圖3雙氧水對(duì)石油降解效果的影響
[0041] 圖4不同濃度的TW-80對(duì)石油降解效果的影響
[0042] 圖5不同濃度的鼠李糖脂對(duì)石油降解效果的影響

【具體實(shí)施方式】：
[0043] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0044] 第一步：稠油污染土壤高效降解菌的制備
[0045] (1)菌株的富集：在TSA富集培養(yǎng)液中加入5g油污土壤，在28°C，150r/min搖床 上培養(yǎng)3天后取富集液10ml接種于新鮮無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，加入1%稠油作為唯一碳源， 相同條件下培養(yǎng)5天，如此連續(xù)富集培養(yǎng)2次。
[0046] (2)優(yōu)勢(shì)菌株的分離：取三次培養(yǎng)基中的上層液各10ml進(jìn)行稀釋（KT1?1(T 5)，從 各稀釋液中取〇. lml涂布于分離培養(yǎng)基中，均勻涂布后置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中，挑選出優(yōu) 勢(shì)菌種回接于含油培養(yǎng)皿中，劃平行線和Z型兩種方法進(jìn)行分離純化，純化后的菌種保存 于TSA斜面培養(yǎng)基中。
[0047] (3)降解活性菌株的篩選：將純化后的菌株在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，用TSA液體培養(yǎng) 基做成菌液，取lml接種至裝有100mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 為150r/min，溫度28°C，培養(yǎng)7d后，
[0048] 即形成活性菌株。
[0049] 第二步：微生物降解菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)添加
[0050] 稱取風(fēng)干后的稠油污染土壤100克，將其碾碎均勻填充在塑料杯中，用塑料薄膜 蓋住，在上面用針扎若干孔，以便于通氧氣，取上述高效菌的菌液20毫升，均勻的噴灑在土 壤中，并混合均勻，將〇. 1克（NH4) 2S04,0 . 05克KN03和0. 2克KH2P04加入100毫升的蒸餾 水中，均勻噴灑在土壤中，并混合均勻。
[0051] 表1稠油污染土壤的基本性質(zhì)
[0052]

【權(quán)利要求】
1. 一種本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑，其特征在于： 是由降解菌、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、復(fù)合表面活性劑滲透劑、氧化促進(jìn)活化劑四部分構(gòu)成； 所述的降解菌是由從稠油土壤中篩選分離出的好氧桿狀細(xì)菌（Lactobacillus sp.)和 厭氧桿狀芽孢細(xì)菌（bacillus sp.)構(gòu)成，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心的保藏號(hào)分別為CGMCC No. 7637和CGMCC No. 7636 ; 所述的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由（NH4) 2S04, KN03和KH2P04構(gòu)成； 所述的復(fù)合表面活性劑滲透劑由TW-80和克鼠李糖脂構(gòu)成； 所述的氧化促進(jìn)活化劑為雙氧水。
2. -種權(quán)利要求1所述的本源微生物修復(fù)復(fù)合制劑的應(yīng)用，其特征在于：用于稠油污 染土壤的修復(fù)： (1) 將0. 1克（NH4)2S04,0 . 05克謂03和0. 2克KH2P04加入100毫升的蒸餾水中，均勻 噴灑在已經(jīng)加入20毫升降解菌的100克污染土壤中，并混合均勻。 (2) 將0. 02-0. 06克的雙氧水均勻噴灑在已經(jīng)加入降解菌的100克污染土壤中，并混合 均勻； (3) 由0.02-0. 1克TW-80和0. 1-0. 3克鼠李糖脂，溶解在1-5毫升的甲醇中，均勻噴灑 在土壤中，并翻土混合均勻。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK104450543SQ201310416296
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】陳梅梅, 劉光全, 馬超, 鄧皓, 趙林, 宋佳宇, 劉鵬, 劉玉龍, 劉思敏, 湯小萌 申請(qǐng)人:中國(guó)石油天然氣股份有限公司