SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，其主要特征是以T4DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag DNA及載體pcDNA3.1(-)DNA的產(chǎn)物，構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子；并以Ligation Mix連接經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增純化和鑒定后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞，經(jīng)G418篩選含陽性重組子的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組化染色、細(xì)胞增殖周期及其凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平在體外長期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及猴腎病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(hTERT)介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，主要用于心血管病研究領(lǐng)域，為先天性心臟病室間隔缺損的體外研究提供細(xì)胞模型并保存其科研資源。

【背景技術(shù)】
[0002]先天性心臟病室間隔缺損是發(fā)病率最高的出生缺陷之一，已成為嚴(yán)重的社會(huì)問題。我國每年新發(fā)先天性心臟病11.2萬-16.0萬例，將造成經(jīng)濟(jì)損失109億-156億；先天性心臟病的治療費(fèi)每年高達(dá)120億元，給社會(huì)和家庭造成了嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)和精神痛苦，已嚴(yán)重影響我國的人口質(zhì)量，已成為社會(huì)發(fā)展的沉重負(fù)擔(dān)和可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。
[0003]先天性心臟病等出生缺陷的研究及干預(yù)已成為我國政府行為，黨中央《決定》自2006年開始實(shí)施“出生缺陷干預(yù)工程”；中華人民共和國主席令《1994年10月27日第三十三號(hào)》公布我國自1995年6月I日起施行(出生缺陷)產(chǎn)前診斷的有關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)；全國人民代表大會(huì)相繼頒布了《中華人民共和國母嬰保健法》、《中華人民共和國母嬰保健法實(shí)施辦法》等一系列法規(guī)，促進(jìn)了出生缺陷產(chǎn)前診斷、干預(yù)工作的開展；在《國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的第十一個(gè)五年規(guī)劃綱要》中強(qiáng)調(diào)加大出生缺陷干預(yù)力度，改善出生人口素質(zhì)；在《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》中將出生缺陷的研究列為優(yōu)先主題。
[0004]目前認(rèn)為先天性心臟病室間隔缺損是遺傳和環(huán)境因素等復(fù)雜關(guān)系相互作用的結(jié)果，主要包括①.胎兒發(fā)育的環(huán)境因素:如妊娠前三個(gè)月患病毒或細(xì)菌感染尤其是風(fēng)疹病毒，其次是柯薩奇病毒，其出生的嬰兒先天性心臟病的發(fā)病率較高。其它如羊膜的病變，胎兒受壓，妊娠早期先兆流產(chǎn)，母體營養(yǎng)不良、糖尿病、苯酮尿、高血鈣，放射線和細(xì)胞毒性藥物在妊娠早期的應(yīng)用，母親年齡過大等均有使胎兒發(fā)生先天性心臟病的可能。②遺傳因素:多數(shù)的先天性心臟病是由多個(gè)基因與環(huán)境因素相互作用所形成。③其他因素:與地區(qū)、性別也有關(guān)系。
[0005]近年來，對先天性心臟病等出生缺陷的研究主要是針對遺傳、生物、物理、化學(xué)因素與發(fā)病(率)的關(guān)系進(jìn)行流行病學(xué)方面的調(diào)查研究。但是，由于沒有可在體外長期培養(yǎng)的、可用于先天性心臟病發(fā)病機(jī)制研究的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，就難以從細(xì)胞水平在體外研究先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制，從而嚴(yán)重限制了先天性心臟病室間隔缺損出生缺陷的進(jìn)一步研究。
[0006]國外文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞及動(dòng)物模型而在體外研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制。
[0007]但國外最近有研究發(fā)現(xiàn),SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞伴隨著DNA損傷修復(fù)機(jī)制的丟失、核型的不穩(wěn)定性以及少數(shù)細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化。此外，長期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)染SV40Tag的細(xì)胞只是延長了壽命，或僅僅渡過了衰老期(MI期)，多數(shù)細(xì)胞會(huì)最終進(jìn)入危機(jī)期(M2期)而死亡，說明細(xì)胞并未獲得永生化。同時(shí)SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因此SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對某些研究也存在一定程度的限制性。
[0008]國外研究表明，導(dǎo)入外源性hTERT可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征。近年來已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無致瘤性等相對“正常”的生長特征?？梢杂糜谌祟惡蛣?dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，對借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞模型而研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制，具有重要的意義。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細(xì)胞模型。如糖尿病細(xì)胞模型、癌細(xì)胞細(xì)胞模型、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細(xì)胞模型、子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型、癲癇細(xì)胞模型、電子細(xì)胞模型、酒精性癡呆細(xì)胞模型、腦水腫細(xì)胞模型。等等。
[0009]另有國外研究表明，人體組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)死亡而無法傳代，即在進(jìn)入衰老期(Ml期)前就會(huì)死亡。但猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化，可使細(xì)胞渡過Ml期后繼續(xù)存活、傳代培養(yǎng)20-30代，然后細(xì)胞又會(huì)進(jìn)入危機(jī)期(M2期)，細(xì)胞死亡率增加并伴染色體異常，分裂的細(xì)胞逐漸減少，絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生死亡。而hTERT可以維持細(xì)胞染色體端粒的穩(wěn)定，從而使細(xì)胞渡過危機(jī)期(M2期)，可繼續(xù)存活、傳代達(dá)100-300代以上。所以如果用SV40和hTERT同時(shí)轉(zhuǎn)染人離體組織細(xì)胞建立永生化細(xì)胞系，那么SV40可以使細(xì)胞渡過Ml期，hTERT可以使細(xì)胞渡過M2期，比單獨(dú)使用其中之一建立的細(xì)胞系更穩(wěn)定、壽命更長。
[0010]但是，至今尚未見有關(guān)以猴腎病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(hTERT)同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞以建立永生細(xì)胞系并以此構(gòu)建可用于在體外從細(xì)胞水平研究先天性心臟病室間隔缺損發(fā)病機(jī)制的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的文獻(xiàn)報(bào)道，也無法開展相關(guān)項(xiàng)目的研究。為了解決這一問題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是要提供以SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，另一目的是為在體外從細(xì)胞水平研究先天性心臟病室間隔缺損的發(fā)病機(jī)制提供SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫。
[0012]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:以T4DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag DNA及載體 pcDNA3.1 (-) DNA 的產(chǎn)物，構(gòu)建 SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重組子；并以 Ligat1n Mix 連接經(jīng)EcoRI和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增純化和鑒定后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入先天性心臟病室間隔缺損組織細(xì)胞，經(jīng)G418篩選含陽性重組子的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平在體外長期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0013]本發(fā)明以PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳提純SV40LT和hTERT，分別經(jīng)基因載體pcDNA3.1 (-)DNA和pLXSNneo以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞而構(gòu)建其細(xì)胞模型，其組織細(xì)胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規(guī)的胰蛋白酶消化，以僅使引起細(xì)胞粘連的膠原被消化或使細(xì)胞懸浮，減少了細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)被消化而傷及細(xì)胞，使細(xì)胞培養(yǎng)的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的特定培養(yǎng)基，使細(xì)胞不會(huì)生長過快而影響hTERT基因的整合，也不會(huì)因缺少營養(yǎng)或細(xì)胞生長刺激因子而使細(xì)胞在未達(dá)到要求的匯合率、未進(jìn)入對數(shù)生長期前就過早死亡，或?qū)?shù)生長期縮短；制備的細(xì)胞系在-196°C液氮中凍存I個(gè)月后復(fù)蘇培養(yǎng)，均能生長出貼壁細(xì)胞；在作細(xì)胞系染色體鑒定時(shí)，秋水仙素的用量及作用時(shí)間是常規(guī)的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計(jì)數(shù)和分析；此外，用SV40LT和hTERT同時(shí)轉(zhuǎn)染人離體組織細(xì)胞建立永生化細(xì)胞系，SV40可以使細(xì)胞渡過Ml期，hTERT可以使細(xì)胞渡過M2期，比單獨(dú)使用其中之一建立的細(xì)胞系更穩(wěn)定、壽命更長。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明制備的先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型(貼壁生長)圖。
[0015]如圖1，細(xì)胞傳代至第166代、培養(yǎng)至第11天時(shí)，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達(dá)88%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變稀疏。

【具體實(shí)施方式】
[0016]1、SV40LT和hTERT的提取:(I)酶切SV40LT和hTERT:①酶切SV40LT:從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒，溶解于適量的H2O或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液、18uL H2O和限制性內(nèi)切酶BamH I (l_5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。②酶切hTERT:hTERT位于質(zhì)粒pClneo-hTERT的EcoRI與SalI位點(diǎn)之間，pLXSNneo載體多克隆位點(diǎn)(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點(diǎn)。從市售購買pCIneo-hTERT質(zhì)粒，溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和18uL H2O,加入限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)，按常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTERT后，收取擴(kuò)增物以備電泳。(2) SV40LT和hTERT電泳:①SV40LT (SV40DNA)電泳:取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照物，接通電極，使DNA向陽極移動(dòng)，在1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時(shí)，關(guān)閉電源。②hTERT電泳:取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的標(biāo)準(zhǔn)對照物，接通電極，使hTERT向陽極移動(dòng)，在l-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(shí)(30min)，關(guān)閉電源。(3) SV40LT和hTERT純化與回收:①SV40LT純化與回收:從瓊脂糖中分離出約2600bp SV40大T抗原DNA:在300_360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，在下層DNA的溶液中加入等體積酹氯仿(2個(gè))抽提2次,上清液轉(zhuǎn)入到另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預(yù)冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g, 4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解DNA。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。②hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7_)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酹氯仿(2個(gè))抽提2次,上清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預(yù)冷無水乙醇，于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，力口入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來。
[0017]2、SV40LT 和 hTERT 分別與載體 pcDNA3.1 和 pLXSNneo 構(gòu)建重組子:(I) SV40LT/pcDNA3.1重組子的構(gòu)建:取9 μ I上述DNA成份(0.1-5 μ g)、10 μ 12X連接緩沖液、I μ 11OmmoI/LATP, T4DNA連接酶(20?500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1 空載體混合，15°C溫育 24h，構(gòu)建成 SV40LT/pcDNA3.1 重組子。(2) pLXSNneo-hTERT重組子的構(gòu)建:取9 μ I上述純化的hTERT成份(0.1-5 μ g)、I μ 110mmol/L ATP、1ulLigat1n Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ulpLXSNneo空載體混合，15 °C溫育24h，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT 重組子。
[0018]3、重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定:(I) SV40LT/pcDNA3.1重組子的擴(kuò)增、分離與鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉(zhuǎn)搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值& 0.4，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min后，于4°C用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，_70°C貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ I轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積彡10 μ 1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min,不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可達(dá)200 μ I)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。②重組子的篩選、擴(kuò)增與提取:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(0D_4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min),于4°C,6000g離心lOmin，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積彡20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在-20°C或_70°C無限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入211^70%乙醇輕輕洗漆沉淀,然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長期保存)。③重組子的鑒定:上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進(jìn)行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。(2)pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉(zhuǎn)搖床200?300r/min)，每隔20?30min測量0D600值?0.4，在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用Sorval 1GS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心1min,以回收細(xì)胞,倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1MCaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆谩＂谝愿惺軕B(tài)大腸桿菌純化和擴(kuò)增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別取200 μ I轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，在每管中加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積彡10 μ I,DNA ( 50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每90mm平板可達(dá)200 μ I)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。③篩選、擴(kuò)增重組子:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(0D_4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min),于4°C, 6000g離心lOmin,用4mL GTL溶液重懸沉淀,并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積彡20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在_20°C或_70°C無限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置lOmin，加入7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長期保存)。④重組質(zhì)粒的鑒定與擴(kuò)增:挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，370C，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4°C、10000r/min離心5min，按試劑盒說明書小量提取并純化重組質(zhì)粒；WEcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系:限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10 X buffer2ul、重組質(zhì)粒1ul、加水補(bǔ)足至20ul，37 V酶切Ih0酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳，時(shí)間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測定重組質(zhì)粒的序列；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測序鑒定準(zhǔn)確后，將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴(kuò)增培養(yǎng)，按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行大劑量質(zhì)粒抽提純化，紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度及純度后備用。
[0019] 4、重組子SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT導(dǎo)入先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞及其陽性克隆的篩選:(I)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞的收集與培養(yǎng):以無菌操作提取在作其他實(shí)驗(yàn)或其他檢查后多余、廢棄的先天性心臟病室間隔缺損患兒的羊水脫落組織細(xì)胞，以細(xì)胞終濃度約為lX105/mL備用，取上述呈單個(gè)分散的細(xì)胞或經(jīng)處理后成為單個(gè)分散的細(xì)胞接種于含5?10nmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C，體積分?jǐn)?shù)5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)75%?85%、處于剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)，即考慮收集培養(yǎng)細(xì)胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入l-2ml0.01%的膠原酶II液或胰酶(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn))，靜置2-10min (顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測)，吸去膠原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使成細(xì)胞懸液，離心沉淀，去上清液，細(xì)胞沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導(dǎo)入。(2)重組子SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT導(dǎo)入先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞:方法1:選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，取上法分離所得細(xì)胞的2X 15個(gè)細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，在37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36h，使細(xì)胞生成單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)55%?65%、處于剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)，即可轉(zhuǎn)染SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT。在
1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A，將重組子SV40LT/pcDNA3.1溶于50 μ I無血清培養(yǎng)液中；管B，將重組子pLXSNneo-hTERT溶于50 μ I無血清培養(yǎng)液中；管C，將20 μ I脂質(zhì)體Lipofectamine溶解于80 μ I無血清培養(yǎng)液中，管Α、管B和管C混勻，室溫下置45min。吸去上述細(xì)胞培養(yǎng)液后，用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，在LipOfectamine-SV40LT/pcDNA3.1和Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合物中加入Iml無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻,再滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入Iml無血清培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg.Γ1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個(gè)細(xì)胞集落進(jìn)行亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后再加大G418濃度到SOOmg.L—1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的克隆進(jìn)行傳代擴(kuò)增。方法2:吸取1/10-1/40細(xì)胞懸液，配制成終濃度為IX 105/mL細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，選擇低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，其中含20mL/L胎牛血清、lOnmol/L胰島素，培養(yǎng)48h后，使細(xì)胞生成單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞匯合率達(dá)55%?65%、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將重組子pLXSNneo-hTERT和SV40LT/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞內(nèi)，用含700mg/L G418的培養(yǎng)液篩選lw，將G418濃度改為300mg/L，至出現(xiàn)陽性克隆，將其轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)大、傳代培養(yǎng)；方法3:將上述細(xì)胞懸液以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液配成5X 108/L終濃度的細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至約90%融合時(shí)用于轉(zhuǎn)染，將分別含有0.2μ g的重組子SV40LT/pcDNA3.1 和 pLXSNneo-hTERT 分別用 DMEM 或 RPMI1640 調(diào)整體積為 50 μ 1，室溫放置5min ;脂質(zhì)體15 μ 1，用DMEM調(diào)整體積為50 μ 1，室溫放置5min，將上述試劑輕輕混勻，然后室溫放置20min，將24孔板內(nèi)的細(xì)胞用DMEM洗3次，然后每孔加培養(yǎng)液100 μ 1，再加A Lipofectamine-SV40LT/pcDNA3.1 和 Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT 混合物輕輕在細(xì)胞表面鋪均勻后，于37°C 5% C02培養(yǎng)箱放置6h，隨后用0.01g/L膠原酶將細(xì)胞消化，轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基，次日加G418抗生素使終濃度為500mg/L，直到有單克隆細(xì)胞長出。約1d后有單克隆細(xì)胞集落長出，挑取并置于24孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，以300mg/L的G418維持并穩(wěn)定傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。以此建立可在體外反復(fù)傳代培養(yǎng)的永生化先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型。
[0020]5、SV40LT/pcDNA3.1和phXSNneo-hTERT轉(zhuǎn)染先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型的傳代擴(kuò)增:收集上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT的陽性單克隆細(xì)胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基配成約I X 105/mL的細(xì)胞懸液，接種于數(shù)瓶20?50cm2培養(yǎng)瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，至細(xì)胞貼壁生長、匯合率達(dá)到80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時(shí)收集細(xì)胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代接種、培養(yǎng)，記錄代數(shù)并觀察細(xì)胞生長特點(diǎn)，如圖1，細(xì)胞傳代至第166代、培養(yǎng)至第11天時(shí)，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達(dá)88%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變稀疏。其中對數(shù)生長是指細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞數(shù)量的增加與培養(yǎng)時(shí)間呈倍增關(guān)系，通常按常規(guī)按種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)I?2天便可在顯微鏡下找到生長的單個(gè)細(xì)胞；4?5天時(shí)可見細(xì)胞集落，貼壁生長細(xì)胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的1/3，培養(yǎng)7?13天時(shí)可見貼壁生長細(xì)胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的2/3以上，甚至細(xì)胞重疊、幾乎不留空隙(匯合率達(dá)95?100% )，細(xì)胞光亮，無顆粒、無粗糙感等老化現(xiàn)象，也可據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系來判斷；死亡的細(xì)胞少，每周因死亡而漂浮的細(xì)胞少于10% [通過臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，因?yàn)檎５幕罴?xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡，方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細(xì)胞薄片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比]。
[0021]6、永生化先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型生物學(xué)特性的鑒定:使用SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT建立的細(xì)胞模型(細(xì)胞系)，鑒定的關(guān)鍵問題有:一是要求該細(xì)胞具有持續(xù)的增殖能力；二是要求其形態(tài)、基本生理功能等保持不變。①觀察細(xì)胞形態(tài):在倒置光學(xué)顯微鏡下每日觀察細(xì)胞是否呈典型的上皮細(xì)胞樣貼壁生長，是否呈梭形、或小園形生長。本細(xì)胞系傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)與正常人成纖維細(xì)胞形態(tài)無明顯差異；②觀察細(xì)胞生長曲線:取生長較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)，分別取1.4X 14細(xì)胞接種于30個(gè)含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在h印ato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對數(shù))，描繪在半對數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線，永生化細(xì)胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發(fā)明采集的原代細(xì)胞，則說明該細(xì)胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒有，也說明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:在細(xì)胞生長密度達(dá)85-95% (其中小園形細(xì)胞占10% )、處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物中按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時(shí)，吸干培養(yǎng)液，加入預(yù)熱的2-3mL EDTA-胰酶消化液，37°C作用5分鐘，終止消化，洗下貼壁細(xì)胞，經(jīng)離心、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型軟瓊脂集落生長試驗(yàn):將細(xì)胞以5X104/ml接種于直徑為35mm軟瓊脂平皿內(nèi)，觀察三周后，未發(fā)現(xiàn)克隆形成，說明本實(shí)驗(yàn)的永生化細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)形成克隆，符合永生化特點(diǎn)裸鼠致瘤試驗(yàn):將永生化細(xì)胞以3X107接種裸鼠背部皮下，2個(gè)月后，4只裸鼠均未見腫瘤形成，證明此細(xì)胞為非惡化細(xì)胞；⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物測定:按試劑盒做PCR擴(kuò)增后電泳，檢出hTERT mRNA條帶。如以免疫組織化學(xué)檢測，hTERT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性:收集細(xì)胞系，按試劑盒說明制備裂解液，作PCR擴(kuò)增和電泳分析，以302nm紫外光觀察結(jié)果，可見呈端粒酶陽性條帶。⑧流式細(xì)胞術(shù)檢測:檢測第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng)，說明是hTERT和SV40LT整合、表達(dá)的結(jié)果；另外以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率，本細(xì)胞系的細(xì)胞增殖指數(shù)較轉(zhuǎn)染前無明顯改變，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率較轉(zhuǎn)染前明顯降低轉(zhuǎn)染細(xì)胞SV40大T基因檢測:如以免疫組織化學(xué)檢測，SV40轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入細(xì)胞內(nèi)；也可用RT-PCR法檢測T抗原在細(xì)胞中的表達(dá)，其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5，-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496)5，-GAA ATG CCA TCT AGT GAT-3，;擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 268bp，擴(kuò)增條件為 94°C，5min,即:(94°C，Imin ；55°C，lmin, -0.5°C / 循環(huán)；72°C, lmin) X 30、(94°C，30S ；40°C，30S,72°C，30S) X15，擴(kuò)增體系為 50 μ 1: [Mg2+] 2mmol/L、dNTPs200 μ mol/L、引物濃度 0.4 μ mol/L、TaqlU、模板5 μ I ;實(shí)驗(yàn)組以第19代細(xì)胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，產(chǎn)物_20°C保存)；陰性對照設(shè)兩個(gè)，分別以無菌水、原代細(xì)胞的cDNA做模板，陽性對照以SV40DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因?yàn)镾V40病毒無包膜，不使用SDS破膜，取5 μ I進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20°C保存?zhèn)溆?SV40大T基因mRNA表達(dá)產(chǎn)物測定:T抗原mRNA RT-PCR產(chǎn)物測序:取100 μ I體系的擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μ I DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I進(jìn)行測序，符合SV40大T基因mRNA表達(dá)產(chǎn)物的序列。
[0022]所以，本發(fā)明的細(xì)胞模型為(I)細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長；(2)細(xì)胞的生長曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)細(xì)胞染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發(fā)明采集的原代細(xì)胞；(4)細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(形成克隆)；(5)細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；(6)細(xì)胞的DNA中同時(shí)整合了 SV40LT和hTERT基因，同時(shí)表達(dá)SV40LT和hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；(7)細(xì)胞傳代至第166代、培養(yǎng)至第11天時(shí)，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達(dá)88%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變稀疏；(8))用于集中保存SV40LT和hTERT同時(shí)轉(zhuǎn)染的可再生的先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞的遺傳資源并用于在體外從細(xì)胞水平研究環(huán)境因素致先天性心臟病室間隔缺損的發(fā)病機(jī)制、研究對環(huán)境有害物的耐受性。
[0023]7、SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫:篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細(xì)胞，經(jīng)過消化、終止和離心分離(1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5 X 15個(gè)/ml，加入凍存管，分裝、標(biāo)注，經(jīng)4°C，0.5h ；~20V,2h ;-70°C，過夜，入_196°C液氮凍存。以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，并作為先天性心臟病室間隔缺損發(fā)病機(jī)制體外研究的細(xì)胞模型，以加速拓展先天性心臟病室間隔缺損研究的新途徑、從細(xì)胞水平在體外長期研究先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制。
[0024]8、細(xì)胞模型應(yīng)用:先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型作為科研細(xì)胞:使先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(xué)(如甲醛、汽油、鉛、汞)、生物(如風(fēng)疹病毒，巨細(xì)胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養(yǎng)，然后取體外長期傳代的不同周期的活細(xì)胞、傳代過程的凋亡細(xì)胞、含有傳代培養(yǎng)中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)液從不同角度和水平，對比研究先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型、正常對照細(xì)胞模型對有害物的耐受性的差異、有害物致先天性心臟病室間隔缺損的機(jī)制。例如應(yīng)用常規(guī)方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs等篩選差異的基因及其多態(tài)性、甲基化水平；運(yùn)用原位雜交(FISH)、Northern blot,Real-time PCR、CHIP、EMSA等技術(shù)檢測基因所在研究細(xì)胞模型中的基因轉(zhuǎn)率表達(dá)、定位及調(diào)控；利用酶反應(yīng)學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)鑒定細(xì)胞模型長期傳代中蛋白質(zhì)代謝過程和關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物；應(yīng)用雙向電泳、MALD1-T0F質(zhì)譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究細(xì)胞模型在長期傳代中的蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用，從活細(xì)胞培養(yǎng)過程動(dòng)態(tài)、長期研究先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞對環(huán)境有害因素的耐受性和適應(yīng)性，例如:①環(huán)境中常見的毒性物質(zhì)苯并芘致先天性心臟病室間隔缺損的研究:使先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型和對照細(xì)胞分別在含有0.1、1.0,5.0、10.0,20.0pmoI/L苯并芘的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，檢測在培養(yǎng)2周、4周、6周、8周、16周等不同培養(yǎng)時(shí)間的可作為細(xì)胞毒性指標(biāo)的細(xì)胞凋亡、壞死、雙核細(xì)胞率和可作為遺傳毒性指標(biāo)的微核率、核質(zhì)橋率、核芽率，即在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)10000個(gè)雙核細(xì)胞中的微核數(shù)、核質(zhì)橋數(shù)和核芽數(shù)；500個(gè)活細(xì)胞中的凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)、雙核細(xì)胞數(shù)，以及檢測細(xì)胞存活率，即應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養(yǎng)液后，在96孔板上加入20%的5mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150yL 二甲亞砜，振蕩lOmin，使紫色結(jié)晶物充分溶解，本酶標(biāo)儀以490nm測定各孔的吸光度值，計(jì)算出細(xì)胞存活率。還可以其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測不同培養(yǎng)時(shí)間的含毒性物與不含毒性物、先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型與正常細(xì)胞中各組細(xì)胞的基因突變、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞分泌功能、染色體畸變、細(xì)胞存活率(壽命)等，以從活細(xì)胞培養(yǎng)過程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長期研究環(huán)境有害因素對先天性心臟病室間隔缺損的作用機(jī)制。②以某種病源微生物替換毒性物質(zhì)苯并芘做同樣的研究，即可從活細(xì)胞培養(yǎng)過程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長期研究先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞對生物因素的耐受性和適應(yīng)性及作用機(jī)制。③將配成濃度梯度的治療藥物與配成濃度梯度的病源微生物或毒性化學(xué)物質(zhì)以及細(xì)胞模型共同培養(yǎng)，檢測細(xì)胞培養(yǎng)過程壽命、基因突變、各種分子變化等，即可從活細(xì)胞培養(yǎng)過程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長期研究藥物對先天性心臟病室間隔缺損的治療效果及干預(yù)效果。④同樣可用先天性心臟病房間隔缺損細(xì)胞模型研究基因治療的方法，替代某些以人體直接做試驗(yàn)。⑤以細(xì)胞模型的形式保存先天性心臟病室間隔缺損者的遺傳資源。
【權(quán)利要求】
1.一種用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，其主要特征是以T4DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag DNA及載體pcDNA3.1(-)0嫩的產(chǎn)物，構(gòu)建5￥401^1。0嫩3.I (-)重組子；并以Ligat1n Mix連接經(jīng)EcoRI和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增純化和鑒定后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入先天性心臟病室間隔缺損組織細(xì)胞，經(jīng)G418篩選含陽性重組子的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平(替代人體或動(dòng)物直接試驗(yàn))在體外長期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，其特征是所指細(xì)胞模型為(I)細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長；(2)細(xì)胞的生長曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)細(xì)胞染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發(fā)明采集的原代細(xì)胞；(4)細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(形成克隆)；(5)細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；(6)細(xì)胞的DNA中同時(shí)整合了 SV40LT和hTERT基因，同時(shí)表達(dá)SV40LT和hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；(7)細(xì)胞傳代至第166代、培養(yǎng)至第11天時(shí)，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長匯合率達(dá)88%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長變慢、變稀疏；(8))用于集中保存SV40LT和hTERT同時(shí)轉(zhuǎn)染的可再生的先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞的遺傳資源并用于在體外從細(xì)胞水平研究環(huán)境因素致先天性心臟病室間隔缺損的發(fā)病機(jī)制、研究對環(huán)境有害物的耐受性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，其特征是取自因其他實(shí)驗(yàn)所需而采集的、并在其他實(shí)驗(yàn)后多余、廢棄的先天性心臟病室間隔缺損患兒的羊水脫落組織細(xì)胞構(gòu)建之。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，其特征是用作傳代培養(yǎng)以備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的先天性心臟病室間隔缺損組織細(xì)胞，在原代擴(kuò)增培養(yǎng)中，其收集指標(biāo)是細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)75%?85%、處于剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)收集細(xì)胞；用作脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的傳代先天性心臟病室間隔缺損組織細(xì)胞，其時(shí)機(jī)選擇的指標(biāo)是細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)55%?65%、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)的培養(yǎng)細(xì)胞；傳代細(xì)胞系收集的指標(biāo)是選擇細(xì)胞貼壁生長的匯合率達(dá)80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時(shí)收集細(xì)胞；染色體核型分析的細(xì)胞收集指標(biāo)是細(xì)胞生長密度達(dá)85-95%、小園形細(xì)胞占10%以上、處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，其特征是以0.01%膠原酶II消化貼壁生長的組織細(xì)胞，作染色體核型分析時(shí)，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病室間隔缺損細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫的構(gòu)建，其特征是細(xì)胞庫的構(gòu)建包括(I)篩選經(jīng)鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的SV40LT和hTERT介導(dǎo)的先天性心臟病房間隔缺損細(xì)胞；(2)作傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細(xì)胞；(3)經(jīng)消化、終止、離心(1200r/min，6min)步驟收獲細(xì)胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5X 15個(gè)/ml的細(xì)胞懸液；(5)按照4°C，0.5h ；-20°C,2h ;_70°C，過夜；入_196°C液氮的程序凍存細(xì)胞；(6)可再生性地長期保存SV40LT和hTERT介導(dǎo)先天性心臟病房間隔缺損細(xì)胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104419720SQ201310403780
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月1日
【發(fā)明者】翁炳煥, 陳松長, 朱依敏, 苗正友, 孫義錫, 金帆 申請人:翁炳煥